转入WIF-1或5-氮杂-2’-脱氧胞苷去甲基化抑制骨肉瘤模型鼠的肿瘤生长

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.005

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (27): 3984-3991.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.005

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转入WIF-1或5-氮杂-2’-脱氧胞苷去甲基化抑制骨肉瘤模型鼠的肿瘤生长

段飞，李书忠，朱万平，康学华，张恒甲，代胜杰，田艳朋

青岛大学附属医院脊柱外科，山东省青岛市 266100

修回日期:2016-04-18 出版日期:2016-06-30 发布日期:2016-06-30
通讯作者: 李书忠，硕士，主任医师，青岛大学附属医院脊柱外科，山东省青岛市 266100
作者简介:段飞，男，1989年生，山东省菏泽市人，汉族，青岛大学在读硕士，主要从事脊柱外科研究。
基金资助:
山东省自然科学基金(ZR2011HM082)，课题名称：WIF-1基因在骨肉瘤中的表达及意义

WIF-1 or 5-aza-2'-deoxycytidine demethylation suppresses tumor growth in a mouse model of osteosarcoma

Duan Fei, Li Shu-zhong, Zhu Wan-ping, Kang Xue-hua, Zhang Heng-jia, Dai Sheng-jie, Tian Yan-peng

Department of Spine Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266100, Shandong Province, China

Revised:2016-04-18 Online:2016-06-30 Published:2016-06-30
Contact: Li Shu-zhong, Master, Chief physician, Department of Spine Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266100, Shandong Province, China
About author:Duan Fei, Studying for master’s degree, Department of Spine Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266100, Shandong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2011HM082

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
DNA甲基化：是一种重要的遗传修饰，广泛存在于肿瘤的发生过程。甲基化可导致抑癌基因的转录失活，参与肿瘤的发生发展，多种肿瘤临床病理学分析也发现其中存在高甲基化改变。
WIF-1：是一种抑癌基因，WIF-1基因甲基化后WIF-1蛋白表达下调，失去对Wnt蛋白的拮抗作用，致使Wnt信号通路异常激活，胞质内β-catenin避免了被磷酸化而降解，导致细胞凋亡受到抑制，诱导肿瘤的发生。WIF-1由于启动子过度甲基化后在组织中的表达下调，致使对照组瘤体较用药组增长迅速。
鼠骨肉瘤模型：基因组分析资料表明，小鼠的基因与人类相似达95%，说明小鼠模型在模拟人类疾病时具有得天独厚的优势。因此实验选用SPF级小鼠建立骨肉瘤模型，移植细胞株按其来源可分为鼠源性和人源性，人源性细胞株可以用来研究基因突变是如何导致肿瘤发生和转移的，从而为临床治疗提供帮助。人源性细胞株包括MG-63，POS-1、U2-OS、HOS-58及SAOS-2等，其中MG-63、POS-1等建立的动物模型肿瘤可以自行发生肺部转移，与人类肿瘤表现类似，也常用于研究抗癌药物的有效性，是较好的研究模型。因此实验选用MG-63作为移植细胞株进行造模。

摘要
背景：WIF-1是一种抑癌基因，由于启动子过度甲基化从而导致其在大多数肿瘤中的表达下调，而DNA甲基化抑制剂可使一些基因发生去甲基化从而恢复其表达。
目的：在骨肉瘤动物模型中转入WIF-1或使用5-氮杂-2’-脱氧胞苷去甲基化处理后，观察瘤体的病理学差异及WIF-1 mRNA和蛋白的表达变化。
方法：建立鼠骨肉瘤模型，分为3组，对照组：不做任何处理；5-氮杂-2’-脱氧胞苷组：每只每日注射适量5-氮杂-2’-脱氧胞苷去甲基化剂；WIF-1组：每只每日注射适量Wnt/β-catenin信号转导通路抑制剂WIF-1。用药后第7天开始每7 d称裸鼠体质量，测量肿瘤短径(a)和长径(b)，分别计算各组肿瘤的相对体积，计算用药后第7，14，21，28，56天的肿瘤相对增长率。分别于用药后第7，14，21，28，56天5个时间点脱颈处死每组各4只裸鼠，剥取肿瘤组织称瘤质量，对瘤体做病理分析，检测用药第56天3组骨肉瘤组织中WIF-1蛋白、WIF-1 mRNA的表达情况。
结果与结论：①用药组与对照组相比，第7，14，21，28，56天的裸鼠体质量有所增加，但用药组与对照组之间差异无显著性意义。②用药组的肿瘤体积较对照组明显减小，用药组WIF-1 mRNA、WIF-1蛋白表达较对照组均出现不同程度的升高。③结果表明WIF-1的启动子区基因甲基化是骨肉瘤发生发展的机制之一，在骨肉瘤动物模型中转入WIF-1或采用5-氮杂-2'-脱氧胞苷去甲基化处理可抑制肿瘤生长。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0002-4900-3187(段飞)

关键词: 实验动物, 骨软骨损伤与修复动物模型, 骨肉瘤, WIF-1, 5-氮杂-2’-脱氧胞苷, 甲基化, 动物模型, 山东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: WIF-1 is a tumor suppressor gene. Promoter hypermethylation causes WIF-1 down- regulation in most tumors. DNA methylation inhibitor can lead to gene demethylation and restore its expression.
OBJECTIVE: To observe the differences of tumor pathology and, WIF-1 mRNA and protein changes using WIF-1 or 5-aza-2'-deoxycytidine demethylation in animal models of osteosarcoma.
METHODS: Murine osteosarcoma models were established and divided into three groups. In the control group, no treatment was given. In the 5-aza-2'-deoxycytidine group, an appropriate amount of 5-aza-2'-deoxycytidine was injected in each mouse daily. In the WIF-1 group, an appropriate amount of Wnt/β-catenin signal transduction pathway inhibitor WIF-1 was injected in each mouse daily. Seven days after medication, the weight of nude mouse was weighed every 7 days. Short tumor diameter (a) and the long diameter (b) were measured. The relative tumor volume was calculated. The relative growth rate of tumor was calculated at 7, 14, 21, 28 and 56 days. Four nude mice from ach group were sacrificed by pulling the neck at 7, 14, 21, 28 and 56 days after medication. Tumor tissues were stripped and the weight of them was weighed. Pathological analysis of the tumor was conducted. The expression of WIF-1 protein and WIF-1 mRNA was detected in osteosarcoma at 56 days after medication in the three groups.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the medication and control groups, the weight of nude mice was increased at 7, 14, 21, 28 and 56 days in the treatment group. No significant difference was found between the medication and control groups. (2) The tumor size was significantly smaller in the medication group than in the control group. WIF-1 mRNA and WIF-1 protein expression was increased in the medication group compared with the control group to different degrees. (3) Results suggested that WIF-1 gene promoter methylation is one of the mechanisms of the development of osteosarcoma. Use of WIF-1 or 5-aza-2'-deoxycytidine demethylation can inhibit tumor growth in animal models of osteosarcoma.

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Key words: Osteosarcoma, Deoxycytidine, Methylation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

段飞，李书忠，朱万平，康学华，张恒甲，代胜杰，田艳朋. 转入WIF-1或5-氮杂-2’-脱氧胞苷去甲基化抑制骨肉瘤模型鼠的肿瘤生长[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(27): 3984-3991.

Duan Fei, Li Shu-zhong, Zhu Wan-ping, Kang Xue-hua, Zhang Heng-jia, Dai Sheng-jie, Tian Yan-peng. WIF-1 or 5-aza-2'-deoxycytidine demethylation suppresses tumor growth in a mouse model of osteosarcoma[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(27): 3984-3991.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 参加实验动物60只，每组20只，接种后未发现感染，各组裸鼠存活良好，实验中未出现死亡。

2.2 各组裸鼠体质量比较 见表1。实验前3组裸鼠体质量为(22.8±0.15) g，各组裸鼠体质量差异无显著性意义。用药后5-氮杂-2’-脱氧胞苷组与WIF-1组裸鼠体质量较对照组有所增加，但用药后第7，14，21，28，56天测量的裸鼠体质量5-氮杂-2’-脱氧胞苷组与对照组之间差异无显著性意义：第7天(t=1.667，P > 0.05)，第14天(t=1.866，P > 0.05)，第21天(t=1.910，P > 0.05)，第28天(t=0.643，P > 0.05)，第56天(t=3.184，P > 0.05)。用药后第7，14，21，28，56天测量的裸鼠体质量WIF-1组与对照组之间差异无显著性意义：第7天(t=2.828，P > 0.05)，第14天(t=4.899，P > 0.05)，第21天(t=9.245，P > 0.05)，第28天(t=7.000，P > 0.05)，第56天(t=4.700，P > 0.05)。

2.3 各组裸鼠瘤质量比较 见表2。5-氮杂-2’ -脱氧胞苷组与WIF-1组瘤质量较对照组明显减小。5-氮杂-2’-脱氧胞苷组用药后第7，14，21，28，56天测量的瘤质量较对照组明显减小，差异有显著性意义(P < 0.05)。WIF-1组用药后第7，14，21，28，56天测量的瘤质量较对照组明显减小，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 各组裸鼠骨肉瘤生长曲线和相对增长率 用药后第7天开始每7 d用游标卡尺测量肿瘤短径(a)和长径(b)，根据公式V=0.5×a²×b计算相对肿瘤体积并绘制生长曲线(图1)，对照组较5-氮杂-2’-脱氧胞苷组、WIF-1组增长明显较快。根据公式RTVn=V_n/V₈计算第7，14，21，28，56天的肿瘤相对增长率(图2)，5-氮杂-2’-脱氧胞苷组、WIF-1组较对照组肿瘤增长速率明显减慢，WIF-1组较5-氮杂-2’ -脱氧胞苷组肿瘤增长速率有所减慢。

2.5 5-氮杂-2’-脱氧胞苷对裸鼠骨肉瘤中WIF-1 mRNA表达的影响 RT-PCR 结果显示对照组肿瘤组织中未见目的条带，5-氮杂-2’-脱氧胞苷组、WIF-1组肿瘤组织可见不同程度的 WIF-1 mRNA表达，WIF-1组肿瘤组织中WIF-1 mRNA的表达量比5-氮杂-2’-脱氧胞苷组略微减少，见图3。
2.6 5-氮杂-2’-脱氧胞苷对裸鼠骨肉瘤中WIF-1蛋白表达的影响 采用Western Blot技术检测3组肿瘤组织中WIF-1蛋白的表达情况。结果显示WIF-1蛋白在对照组无表达，在5-氮杂-2’-脱氧胞苷组、WIF-1组有不同程度的表达，见图4。2.7 各组肿瘤组织的病理分级及对比用药第7，14，21，28，56天的瘤体进行苏木精-伊红染色做病理分析，对照组较5-氮杂-2’-脱氧胞苷组、WIF-1组分化较差，核大深染，病理性核分裂像较多，见图5-9。

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引言

材料方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 60只雄性6周龄NU/NU免疫缺陷鼠，体质量为(22.8±0.15) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(动物合格编号：11400700134903)。

1.1.2 细胞株和主要试剂 人骨肉瘤细胞株MG-63(中国科学院上海生物细胞研究所)，体积分数为10%胎牛血清(美国Hyclone公司)，100 U/mL青霉素及100 mg/L链霉素(上海信帆生物科技有限公司)，WIF-1蛋白、总蛋白提取试剂盒(Sino Biological Inc.)，5-氮杂-2’-脱氧胞苷(美国Sigma公司)，PCR试剂盒(Takara公司)，兔抗鼠WIF-1多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，引物(TaKara生物公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 在DMEM高糖培养基中添加体积分数为10%胎牛血清及双抗(100 U/mL青霉素及100 mg/L链霉素)配制培养液，将人骨肉瘤细胞株MG-63置于该培养液中，并将培养瓶放在恒温培养箱(37 ℃、体积分数为5%CO₂)中培养。当培养瓶中细胞的汇合率达到70%以上时进行传代，去除培养瓶中的旧培养液，用胰蛋白酶进行消化，在倒置显微镜下观察到细胞胞质回缩、间隙增大时终止消化，并用吸管吸取培养瓶中的培养液反复吹打瓶壁细胞，制备细胞悬液进行传代(1∶2比例)。

1.2.2 骨肉瘤裸鼠模型的建立及药物处理 将预先培养的呈对数增长的细胞消化并离心后，加PBS制备细胞悬液，在每只裸鼠的右前肢腋后皮下注射大约含1×10⁷个细胞的细胞悬液0.2 mL。待每只裸鼠的肿瘤长径长至0.4 cm时将60只裸鼠随机分为对照组、5-氮杂-2’-脱氧胞苷组、WIF-1组，每组20只。按体质量计算，5-氮杂- 2’-脱氧胞苷组每只裸鼠给予5-氮-2’-脱氧胞苷1 μg/g (100 μL PBS) 腹腔注射，每天1次。WIF-1组每只裸鼠给予WIF-1 20 ng/g腹腔注射，每天1次。对照组裸鼠不做任何处理。术后每天观察肿瘤生长情况及手术区有无感染，用药后第7天开始用电子天平称量裸鼠体质量(每7 d称量1次，以g为单位)，游标卡尺测量每只裸鼠肿瘤的短径(a)和长径(b)(以cm为单位)，根据公式V=0.5×a²×b计算各组裸鼠的相对肿瘤体积并制作肿瘤生长曲线图表以作比较，按公式RTVn=V_n/V₈计算用药后第7，14，21，28，56天各组裸鼠的肿瘤相对增长率并绘图比较(V₈是指每只裸鼠第8天的肿瘤体积)。分别于用药后第7，14，21，28，56天5个时间点脱颈处死每组各4只裸鼠，剥取肿瘤组织，一部分用体积分数为10%甲醛固定，石蜡包埋作苏木精-伊红染色，观察每组肿瘤的病理学差异。一部分用药后56 d的肿瘤组织用于检测WIF-1蛋白、WIF-1 mRNA表达。

1.2.3 RT-PCR 法检测WIF-1基因在3组肿瘤组织中的表达 ①取出用药56 d的骨肉瘤组织，立即在液氮中冻结、保存，将冻结的组织敲碎呈粉末状，称取每组骨肉瘤组织50 mg置于1.5 mL微型试管中，加入400 μL溶解液，使用1.5 mL微型试管对应的匀浆器，对组织进行匀浆化操作，直至均匀。将组织装入带有注射针的针筒(1 mL)中来回抽吸10次左右，以减低溶液的黏性。分别加入800 μL吸附液，并用漩涡混合器搅拌，离心(10 000 r/min× 3 min)，回收上清液。mRNA的两次纯化均严格按照说明书进行。②PCR扩增：采用β-actin基因作内参照，WIF-1上游引物：5’-ATC ATC TTC TTA ACT GGC ATT GTG -3’，WIF-1下游引物：5’-AAA AAT AAA AAA AAC ACG CT-3’，扩增条带380 bp；β-actin上游引物：5’-GGC ATG GGT CAG AAG GAT TCC-3’， β-actin下游引物：5’-ATG TCA CDC ACG ATT TCC CGC-3’，扩增条带 300 bp。③PCR反应条件：94 ℃预变性1 min；循环条件为94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 23 s；共循环30次，循环结束后在72 ℃的条件下延伸10 min。④制备2.5%琼脂糖凝胶与胶板，在加样板上混合样品和上样缓冲液，对加样后的凝胶板通电进行电泳，采用凝胶成像系统拍照保存。

1.2.4 Western blot法检测WIF-1蛋白的表达 称取用药56 d的骨肉瘤组织50 mg，将3组组织块分别置于1.0-2.0 mL匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织剪碎，加入400 μL单去污剂裂解液(含PMSF)于匀浆器中，进行匀浆，然后置于冰上。几分钟后再碾一会儿再置于冰上，重复几次使组织尽量碾碎。裂解30 min后，用移液器将裂解液移至1.5 mL离心管中，然后在4 ℃下 12 000 r/min离心5 min，取上清分装于0.5 mL离心管中并置于-20 ℃保存。使用SDS-PAGE凝胶配制试剂盒配制SDS-PAGE凝胶，分别取适量上述各组蛋白加入上样缓冲液后行SDS-PAGE电泳，严格按照说明书进行转膜，转膜完成后，将蛋白膜放置在洗涤液中漂洗，漂洗完成后去除洗涤液，加入封闭液于摇床上摇动并室温封闭60 min。参照Ⅰ抗、Ⅱ抗说明书稀释、孵育Ⅰ抗(兔抗鼠WIF-1多克隆抗体)和Ⅱ抗(HRP 标记的羊抗兔IgG 抗体)。在避光条件下配制显影试剂并行显影检测，上述实验同条件下重复3次。

1.3 主要观察指标 ①用药后56 d 3组骨肉瘤组织中的WIF-1蛋白、WIF-1 mRNA的表达。②各组肿瘤质量、体积、肿瘤相对增长率、病理分级。

1.4 统计学分析 使用计算机统计软件SPSS 19.0分析实验数据，计量资料数据以x(_)±s表示，各组间比较采用配对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

讨论

建立骨肉瘤动物模型的方法主要分为2大类，实验性动物模型和自发性动物模型^[6]。自发性动物模型是指在自然情况下所发生的疾病，实验动物不经过任何人为处置。自发性动物模型的疾病发生与人类很相似，具有很高的应用价值，但这类模型的来源很少，实际应用比较困难^[7]。Schmidt于1988年发现了1例BALB/c鼠自发骨肉瘤，随后从这一模型取得的细胞系再建立模型已属于实验性动物模型^[8]，实验性动物模型的建立方法主要有诱导(放射性核素、化学物质、生物致瘤因素)和异体移植，技术最成熟的是异体移植。

常用的人源性细胞株包括MG-63，POS-1、U2-OS、HOS-58及SAOS-2等^[9-14]。MG-63、POS-1等人源性细胞株建立的动物模型肿瘤可以自行发生肺部转移，与人类肿瘤表现类似，常用于抗癌药物的研究，可以作为造模的细胞株^[15-19]。因此实验采用人源性细胞株MG-63进行造模。实验所采用的造模方法具有操作简便、价格便宜、可重复性好等优点^[20]。

实验研究结果显示，应用DNA甲基化抑制剂可使WIF-1基因发生去甲基化，而WIF-1是一种Wnt分子的胞外抑制剂^[21]，因此在骨肉瘤动物模型中转入WIF-1或使用5-氮杂-2’-脱氧胞苷去甲基化处理后，对照组无WIF-1蛋白及WIF-1mRNA的表达，原因可能是WIF-1基因甲基化^[22]，导致该基因及其表达产物不能被检测到，用药组肿瘤生长较对照组明显减慢，病理分化程度较对照组增高，由此可以认为使用WIF-1或5-氮杂-2’-脱氧胞苷能够干预骨肉瘤的进展。

Wnt(Wingless-type)信号通路是一种分泌型糖蛋白家族，由半胱氨酸残基构成，该通路的作用是向细胞传递生长刺激信号，由各种因素造成的异常激活可引起正常细胞异常增殖、分化而导致多种肿瘤的发生，有关研究已发现该通路的异常激活与结直肠癌、头颈部恶性肿瘤、恶性黑色素瘤、白血病等有关^[23-24]，WIF-1(Wnt inhibitory factor-1)可以与Wnt蛋白结合，阻断Wnt通路的传导，是近年来新发现的Wnt信号通路的重要拮抗物之一，对干预肿瘤的发生、发展起着重要作用^[25]。实验在骨肉瘤动物模型中使用WIF-1、5-氮杂-2’-脱氧胞苷，可能通过上述环节发挥作用，通过抑制Wnt信号传导通路或逆转WIF-1基因启动子的甲基化状态从而恢复骨肉瘤细胞WIF-1基因的表达^[26-28]，WIF-1作为抑癌基因参与细胞增殖的调控，抑癌基因的失活是肿瘤发生与增长的主要原因^[29-31]，因此当Wnt信号传导通路被抑制及WIF-1重新表达后，用药组瘤体较对照组出现了明显的生长抑制。Zhang等^[32]已证明5-氮杂-2’-脱氧胞苷对人鼻咽癌裸鼠移植瘤具有抑制作用。Wijermans等^[33]通过研究发现5-氮杂-2’-脱氧胞苷可以强烈抑制DNMT的活性，由此证明该药是DNA甲基化的强烈抑制剂^[34]。5-氮杂-2’-脱氧胞苷已被证实能够治愈部分肿瘤和一些血液系统恶性疾病^[35]。5-氮杂-2’-脱氧胞苷可能通过恢复未发生突变或丢失的基因结构逆转DNA的甲基化状态，被抑制的生长调控基因可重新表达而恢复对细胞正常生长的调控功能，而达到临床治疗肿瘤的目的^[36-37]。Zhang等^[38]从细胞水平验证了WIF-1蛋白对骨肉瘤的抑制作用。江黎珠等^[3]研究发现WIF-1蛋白是WIF-1基因的编码产物，是一种高度保守的分泌性糖蛋白，其在人体多种正常组织中都有高度表达。实验证明在动物模型中转入WIF-1或采用5-氮杂-2’-脱氧胞苷去甲基化处理可明显抑制肿瘤生长及增殖分化，用药组裸鼠体质量较对照组有所增加，但用药组和对照组之间差异无显著性意义，用药组肿瘤生长曲线较对照组斜率变小，瘤质量较对照组明显减小，说明了WIF-1与5-氮杂-2’-脱氧胞苷在肿瘤模型水平的作用及意义，较细胞水平的研究更加直观。

综上所述，WIF-1作为一种抑癌基因，被发现在多种肿瘤中表达降低，WIF-1的失活对肿瘤的发生、发展起着重要的影响，其在各种肿瘤中的具体机制有待进一步探索。因此可以认为在骨肉瘤中转入WIF-1或采用5-氮杂-2’-脱氧胞苷去甲基化处理可抑制骨肉瘤的进展，为临床治疗骨肉瘤提供重要的参考依据，由于5-氮杂-2’-脱氧胞苷的非特异性细胞毒性，因此在临床治疗上也有一定的局限性，其应用有待于进一步研究与发展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

转入WIF-1或5-氮杂-2’-脱氧胞苷去甲基化抑制骨肉瘤模型鼠的肿瘤生长

WIF-1 or 5-aza-2'-deoxycytidine demethylation suppresses tumor growth in a mouse model of osteosarcoma

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