基于生物信息学构建骨肉瘤miRNA-mRNA的调控网络

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3196

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (17): 2740-2746.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3196

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基于生物信息学构建骨肉瘤miRNA-mRNA的调控网络

袁长深1，容伟明2，卢智贤2，段戡1，郭锦荣1，梅其杰1

1广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023；2广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530000

收稿日期:2020-04-08 修回日期:2020-04-16 接受日期:2020-05-30 出版日期:2021-06-18 发布日期:2021-01-08
通讯作者: 梅其杰，硕士，副主任医师，广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023
作者简介:袁长深，男，1978年生，硕士，副主任医师，主要从事骨与关节疾病的基础与临床研究。
基金资助:
广西中医药民族医药自筹科研课题(GZZC15-12)，项目负责人：梅其杰；广西中医药大学自然科学研究项目(2015MS007)，项目负责人：郭锦荣

Construction of osteosarcoma miRNA-mRNA regulatory network based on bioinformatics

Yuan Changshen1, Rong Weiming2, Lu Zhixian2, Duan Kan1, Guo Jinrong1, Mei Qijie1

1The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2020-04-08 Revised:2020-04-16 Accepted:2020-05-30 Online:2021-06-18 Published:2021-01-08
Contact: Mei Qijie, Master, Associate chief physician, The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Yuan Changshen, Master, Associate chief physician, The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
Traditional Chinese Medicine and Ethnic Medicine Self-funded Research Project of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. GZZC15-12 (to MQJ); Natural Science Research Project of Guangxi University of Chinese Medicine, No. 2015MS007 (to GJR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨肉瘤：是一种好发于儿童和青少年的原发性恶性肿瘤，死亡率非常高。随着对骨肉瘤发病机制认识的不断深入和诊疗技术的发展，骨肉瘤患者5年生存率已由低于20%升高到50%-60%，但对于发生肺转移或局部复发者，预后仍极差。
miRNA：是长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，参与细胞发育、分化和细胞周期等生物过程，在肿瘤的发生机制中发挥重要作用。由于miRNA与肿瘤的发生、发展密切相关，因而阐明miRNA在骨肉瘤中的作用机制，有利于为治疗靶点提供一个新的方向。

背景：骨肉瘤是常见的原发性恶性肿瘤，其极易转移及预后较差；miRNA调控基因的表达参与骨肉瘤的发生与发展，但其潜在的miRNA-mRNA 调控网络尚未全面建立。
目的：通过生物学分析方法，构建骨肉瘤发病机制中潜在miRNA-mRNA调控网络，以便更全面地阐明骨肉瘤的发病机制。
方法：从GEO数据库获取miRNA微阵列数据集(GSE65071)，利用GEO2R对20个骨肉瘤血浆样本和15个健康者血浆样本的数据进行差异表达分析，筛选出在骨中有靶向基因的差异表达miRNA，并预测差异表达miRNA潜在转录因子。同时，从GEO数据库获得GSE16088数据集并在线分析获取差异表达基因，将靶基因与差异表达基因交集获得目标基因。最后，对目标基因进行GO注释和KEGG通路富集分析，构建PPI网络和筛选出关键基因，进一步评估关键基因的表达。
结果与结论：共筛选出8个上调差异表达miRNA和14个下调差异表达miRNA，其主要转录因子有EGR1、POU2F1、SP1、SP4、NFIC、LHX3。22个差异表达miRNA靶基因与差异表达基因交集共获得110个目标基因。KEGG途径分析显示目标基因主要涉及细胞衰老、Apelin信号通路和癌症中的蛋白聚糖等途径。PPI网络分析显示CCNB1、AURKA、CD44较为重要。结果显示，通过构建骨肉瘤发病相关潜在miRNA-mRNA调控网络，为深入研究骨肉瘤分子机制提供理论基础，也为开发新的治疗靶标提供科学依据。
https://orcid.org/0000-0001-5749-9859 (袁长深)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨, 骨肉瘤, 生物学分析, RNA, miRNA, mRNA, 基因, 蛋白, 靶向

Abstract: BACKGROUND: Osteosarcoma is a common primary malignant tumor, which is easy to metastasize and has a poor prognosis. MicroRNA (miRNA) regulates gene expression to participate in the occurrence and development of osteosarcoma, but its potential miRNA-mRNA regulatory network has not been fully established.
OBJECTIVE: To build a potential miRNA-mRNA regulatory network in the pathogenesis of osteosarcoma through bioinformatic analysis in order to comprehensively clarify the pathogenesis of osteosarcoma.
METHODS: GEO2R tool was used to perform differential expression analysis on the data of 20 osteosarcoma plasma samples and 15 healthy plasma samples, based on the miRNA microarray dataset (GSE65071) from the GEO database. Differentially expressed miRNAs with targeted genes in bone were screened, and potential transcription factors for differentially expressed miRNAs were predicted. Simultaneously, the GSE16088 dataset was obtained from the GEO database and analyzed online to obtain differentially expressed genes, and the target genes were intersected with the differentially expressed genes to obtain the desired genes. Finally, gene oncology (GO) annotation and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome (KEGG) pathway enrichment analysis were performed. Protein-protein interaction network was then established, and hub genes were screened. The expression of hub genes was further evaluated.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 8 up-regulated and 14 down-regulated differentially expressed miRNAs were screened. The major transcription factors were EGR1, POU2F1, SP1, SP4, NFIC, and LHX3. In total, 110 desired genes were obtained by the intersection of 22 target genes with differentially expressed miRNA and differentially expressed genes. KEGG pathway analysis showed that the desired genes were mainly involved in cellular senescence, Apelin signaling pathway and proteoglycans in cancer. Protein-protein interaction network analysis showed that CCNB1, AURKA, and CD44 were more important. By constructing a potential miRNA-mRNA regulatory network related to osteosarcoma pathogenesis, it provides a theoretical basis for the in-depth study of osteosarcoma molecular mechanism and also provides a scientific basis for the development of new therapeutic targets.

Key words: bone, osteosarcoma, bioinformatics analysis, RNA, miRNA, mRNA, gene, protein, target

中图分类号:

袁长深, 容伟明, 卢智贤, 段戡, 郭锦荣, 梅其杰. 基于生物信息学构建骨肉瘤miRNA-mRNA的调控网络[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2740-2746.

Yuan Changshen, Rong Weiming, Lu Zhixian, Duan Kan, Guo Jinrong, Mei Qijie. Construction of osteosarcoma miRNA-mRNA regulatory network based on bioinformatics[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(17): 2740-2746.

图/表（结果） 9

2.1 芯片数据集在GEO数据库中，筛选出GSE65071芯片数据，其由GPL19631(http://www.exiqon.com/mirna-pcr-panels)平台完成，数据样本为20例骨肉瘤患者血浆样本、15例健康者血浆样本。
2.2 芯片数据差异表达miRNA的筛选使用GEO2R在线分析，对比GSE65071数据集中骨肉瘤样本组与对照组的miRNA表达差异，输出结果后再以P < 0.05、|logFC|>1作为条件进行严格筛选，共筛选出265个差异表达miRNA，包括60个上调差异表达miRNA和205个下调差异表达miRNA，见图1。

2.3 差异表达miRNA下游靶基因的预测通过miRNet数据库分析265个差异表达miRNA，最终筛选出在骨中有靶基因的22个差异表达miRNA，包括8个上调的差异表达miRNA，分别为hsa-let-7b-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-mir-33a-5p、
hsa-mir-30d-5p、hsa-mir-223-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-mir-
151a-5p；14个下调差异表达miRNA，分别为hsa-mir-192-5p、
hsa-mir-34a-5p、hsa-mir-124-3p、hsa-mir-200c-3p、hsa-mir-375、
hsa-mir-196b-5p、hsa-mir-449a、hsa-mir-483-3p、hsa-mir-92b-3p、hsa-let-7b-3p、hsa-mir-148b-5p、hsa-mir-483-5p、hsa-mir-455-3p、hsa-mir-940。在数据库中分别有1 934和5 065个独立靶基因。为了更好展示差异表达miRNA与靶基因的关系，分别建立了上调差异表达miRNA-靶基因网络和下调差异表达miRNA-靶基因网络，见图2A、C；同时，也列出每个差异表达miRNA靶基因计数，见图2B、D。

2.4 差异表达miRNA上游的潜在转录因子采用FunRich软件分别预测骨中有靶向基因的差异表达miRNA上游转录因子，获得差异较明显的前10个转录因子，见图3A、B。8个上调差异表达miRNA前10个转录因子是EGR1、POU2F1、SP1、LHX3、SP4、NFIC、ARID3A、MEF2A、HOXA5和SOX1。14个下调差异表达miRNA前10个转录因子是EGR1、POU2F1、SP1、SP4、NFIC、LHX3、NKX6-1、MEF2A、TCF3和RREB1；其中EGR1、POU2F1、SP1、SP4、NFIC、LHX3较为重要。

2.5 差异表达基因的筛选在GEO数据库中筛选出GSE16088芯片数据，由GPL96(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/info/geo_affy.html)平台完成，使用GEO2R在线分析14个骨肉瘤组织样本与3个正常组织样本的差异表达，得到了173个上调和346个下调的显著差异表达基因，见图4。对差异表达基因和差异表达miRNA预测的靶基因进行综合分析后，获得上调的差异表达miRNA的靶向目标基因36个和下调的差异表达miRNA的靶向目标基因74个，见图5。

2.6 GO功能和信号通路富集分析为了明确筛选出目标基因的生物学作用，使用Enrichr数据库对110个目标基因进行GO功能注释和KEGG途径富集分析。在GO功能注释中，生物过程分析揭示目标基因在神经胚细胞分化、凋亡过程的调节、胞质分裂调节中显著富集；分子功能分析目标基因在蛋白质异二聚活性、RNA结合、磷脂酰肌醇-4， 5-二磷酸3-激酶活性等方面较为丰富；细胞成分分析表明目标基因显著富集于纺锤极体、黏着斑、纺锤体等，见图6A-C。KEGG途径富集分析结果显示，目标基因在细胞衰老、Apelin信号通路、癌症中的蛋白聚糖、黑色素瘤、胶质瘤等途径中显著富集，见图6D。

2.7 PPI网络的建立与分析将所有目标基因导入String数据库中，构建目标基因的蛋白互作网络，最终获得的110个节点和276个边缘的网络。将数据输入到cytoscape3.6.1软件建立一个更直观的PPI网络，并根据网络拓扑分析筛选出前20个关键基因，见图7，包括下调差异表达miRNA的靶基因：CCNB1、AURKA、CD44、FGF2、NPM1、AURKB、KIF2C、MKI67、KIF23、CDC6、FEN1、CENPN、TRIP13、RFC3、MCM10、CTGF、CAV1、PA2G4；上调差异表达miRNA的靶基因：PDGFRA、TWIST1。

2.8 关键基因的鉴定利用GEPIA数据库检测20个关键基因在肉瘤中的表达水平，其中CCNB1、AURKA、CD44、AURKB、KIF2C、MKI67、KIF23、CDC6、FEN1、CENPN、TRIP13、RFC3、MCM10等13个基因的表达水平在肉瘤组织中均显著高于正常组织；另外FGF2、NPM1、CTGF、CAV1、PA2G4、PDGFRA、TWIST1等7个基因的表达在肉瘤组织与正常组织样品之间无显著差异，见图8；最后构建骨肉瘤发病机制中潜在的miRNA-mRNA关系，见图9。

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引言

材料方法

1.1 外周血miRNA芯片的来源通过GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)检索“osteosarcoma”“miRNA”等关键词，并限制研究类型为expression profiling by RT-PCR和种属为Homo sapiens，检索2019年12月以前已报道的骨肉瘤外周血miRNA的表达谱，最终筛选出由GPL19631(Exiqon human V3 microRNA PCR panel Ⅰ+Ⅱ)平台完成的GSE65071数据集，其是一个包括20例儿童患者血浆样本(10例无转移局限型、10例转移型)和15例18岁健康个体对照血浆样本进行全面miRNA表达谱分析的数据集。该研究将20个骨肉瘤疾病样本作为骨肉瘤样本组，15个健康者的血浆样本作为对照组。
1.2 外周血差异表达miRNA筛选选择数据集GSE65071，进入GEO2R页面(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/? acc=GSE65071)，选择“Analyze with GEO2R”项目，点击“Define groups”对骨肉瘤血浆样本和正常血浆样本进行分组，选择“Save all results”并保存至TXT文档。将TXT文档以Excel方式打开后，筛选同时满足P < 0.05和|logFC|>1的差异表达miRNA(DE-miRNA)。根据P值和差异倍数，构建miRNA表达谱的火山图以便更直观地了解差异表达情况。
1.3 差异表达miRNA下游靶基因的预测 miRNet(https://www.mirnet.ca/miRNet/upload/MirUploadView.xhtml)是一个集成11个数据库的miRNA-靶标相互作用数据的在线工具，可用于预测miRNA的下游靶基因。因此，该研究通过miRNet数据库预测差异表达miRNA在骨中的下游靶基因。
1.4 差异表达miRNA上游的潜在转录因子 FunRich数据库提供途径、转录因子、生物过程、细胞成分、分子功能和蛋白质-蛋白质相互作用等的注释，使用FunRich软件预测在骨中有靶基因的差异表达miRNA潜在转录因子。将上调和下调的差异表达miRNA分别输入该软件，获得前10个最显著的预测转录因子。
1.5 骨肉瘤差异表达基因数据处理为提高筛选差异表达miRNA靶基因的可靠性，通过GEO其他数据集验证其靶基因的表达。在GEO数据库中检索骨肉瘤mRNA的表达数据集，该研究选择由GPL96(Affymetrix Human Genome U133A Array)平台完成的GSE16088数据集，并利用“Analyze with GEO2R”对14个儿童骨肉瘤组织样本与3个正常组织样本在线进行差异表达分析，下载分析后的结果，构建火山图并筛选出同时满足P < 0.05和|logFC|≥ 2的差异表达基因。
1.6 筛选差异表达miRNA下游靶基因的目标基因使用从GEO中得到的骨肉瘤样本与正常样本之间的差异表达基因，确定上调、下调的差异表达基因。利用韦恩图把上调的差异表达基因和下调的差异表达miRNA预测靶基因交集；下调的差异表达基因和上调的差异表达miRNA预测靶基因交集。
1.7 GO功能注释和KEGG途径富集分析 Enrichr是一个基于网页端的综合性基因集富集分析工具。采用Enrichr数据库对骨肉瘤中差异表达miRNA的靶向目标基因进行基因本体论数据库(GO)功能注释和KEGG信号通路富集分析，其中GO分析包括3类：生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)。
1.8 蛋白质-蛋白质相互作用网络的建立与分析为了更好地了解目标基因表达的蛋白之间的关系，使String数据库在综合得分≥0.4条件下建立PPI网络。使用cytoscape3.6.1软件的插件“cytohubba”进行网络拓扑分析，筛选出PPI网络中前20个关键基因。
1.9 关键基因的鉴定目前暂无检测骨肉瘤的基因数据库，骨肉瘤是肉瘤中的一种，因而采用肉瘤的相关数据库。基因表达谱交互式分析(GEPIA)是一种基于Web的工具，可用于分析来自TCGA、GTEx肿瘤和正常样品的差异表达分析、相关性分析、患者存活率分析等。使用GEPIA进一步验证前20个关键基因在肉瘤中的表达水平，关键基因同时满足|logFC|>1和 P < 0.05被认为差异有显著性意义，构建潜在miRNA-mRNA关系网络。

讨论

miRNA在调控基因表达中起关键作用，但大多数miRNA与mRNA的相互作用尚不清楚[9]。而体内miRNA-mRNA调控网络在癌症的发生发展中起重要作用[10]，其调控失调也是骨肉瘤发病的原因之一[4]。
到目前为止，骨肉瘤中的miRNA-mRNA调控网络尚未全面建立。在该研究中，对GEO数据库中miRNA的数据集进行差异表达分析，最终筛选出血浆中异常表达且在骨中有靶基因的22个差异表达miRNA，包括8个上调的差异表达miRNA和14个下调的差异表达miRNA，其分析结果与临床报道基本相同。miR-449a下调可降低对细胞周期蛋白A2的抑制作用，促进骨肉瘤细胞的生长[11]。miR-375低表达可增加YAP1表达，导致骨肉瘤细胞增殖和迁移[12]。miR-192的正常表达可抑制U2OS和MG63细胞的增殖、侵袭和迁移并诱导凋亡，但在骨肉瘤细胞系与骨肉瘤组织中却显著下调[13]。另外，miR-151a-5p在肺腺癌组织中的表达明显高于正常肺组织[14]。miR-124-3p被证实与多种肿瘤的发生、发展有关，在肝癌细胞系及肝癌组织中表达明显低于正常组织[15]，且也在骨肉瘤的转移中发挥重要作用[16]，但miR-223-3p在骨肉瘤患者中呈下调状态[17]，这与作者筛选的结果相反，可能与所取标本部位差异相关。
miRNA表达受转录因子的调控，亦可反过来作用于转录因子[18]，共同调控mRNA转录和翻译，被视为细胞代谢的主要调节剂[19]，因此作者通过FunRich软件预测差异表达miRNA的转录因子。早期生长反应蛋白1(EGR1)是具有锌指结构的转录因子，在调节细胞分化、血管生成和迁移中起到至关重要的作用[20]；EGR1可通过降低细胞周期相关基因和增加凋亡相关基因的表达而抑制骨肉瘤细胞的增殖[21]。POU2F1位于染色体1q24上，也称为八聚体结合转录因子1(OCT-1)[22]，是体内最重要的调节蛋白之一，在氧化、增殖、免疫以及代谢调节中发挥作用。OCT-1在许多肿瘤(包括骨肉瘤)中明显上调，具有促癌作用[23-25]。特异性蛋白1(Sp1)是涉及许多生物过程的重要转录因子，包括细胞代谢、增殖分化、衰老凋亡等，其通过调控真核RNA聚合酶Ⅲ基因的表达在肿瘤形成、癌细胞生长和细胞转移中发挥重要作用[26]；同时SP1/MIR17HG/miR-130a-3p/SP1反馈回路在骨肉瘤发展进程中发挥促进作用[27]。
通过对差异表达miRNA靶基因与差异表达基因的整合，筛选出74个上调和36个下调目标基因。GO功能注释结果显示这110个目标基因主要富集于神经胚细胞分化、蛋白质异二聚活性、纺锤极体等；KEGG富集分析显示，目标基因主要富集在细胞衰老、Apelin信号通路和癌症中的蛋白聚糖等途径中。细胞衰老是生长停滞的状态，衰老细胞永久丧失了增殖的潜能同时可抑制癌症的发展，因此诱导细胞衰老可能成为肿瘤治疗的新疗法[28]。Apelin是一种内源性神经肽，它可与apelin受体(APJ)结合调节细胞的增殖、迁移和血管生成[29-30]。APL/APJ信号系统可通过激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶(PI3K/AKt)等途径促使肿瘤血管生成、细胞增殖、转移以及抑制细胞凋亡等，在肿瘤的发展中扮演着重要的角色[31-32]。蛋白聚糖是细胞外基质的主要成分，通过可溶性因子的活性调节肿瘤生长和血管生成，在恶性肿瘤中发挥越来越重要的作用[33]。这些不同的途径均可能是骨肉瘤的潜在作用机制。
构建目标基因的PPI网络，筛选出在网络中较为重要的前20个基因，再通过GEPIA数据库进一步对这20个基因进行表达分析，结果显示CCNB1、AURKA、CD44等13个基因具有统计学意义，其在骨肉瘤中起关键作用。细胞周期蛋白B1(CCNB1)是细胞周期G2-M中的关键蛋白，参与癌细胞的生长分化、凋亡、转移等，在多种恶性肿瘤中大量表达[34]；研究也发现，降低CCNB1的表达可抑制骨肉瘤细胞增殖[35]。Aurora蛋白激酶包括Aurora-A(即AURKA)、Aurora-B和Aurora-C，是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞有丝分裂中起着重要作用[36]；AURKA作为Aurora激酶家族的重要成员，是细胞周期关键调节剂，可使BRCA1磷酸化或激活polo样激酶1(PLK1)等不同机制促进癌细胞有丝分裂和中心体的扩增，是癌症发展中的致癌基因[37]；抑制Aurora‑A激酶的活性，可以阻止骨肉瘤癌细胞的生长和增殖，并诱导骨肉瘤癌细胞凋亡[38]。CD44是一种广泛分布的跨膜糖蛋白，通过与透明质酸较好的亲和力在多种细胞中发挥关键的作用，包括生长、分化、侵袭和存活等[39-40]；透明质酸与CD44的结合，可影响MAPK和PI3/Akt信号通路中MAP和PI3激酶的活性，促使肿瘤细胞的增殖、存活及转移[41]。XIAO等[42]发现骨肉瘤患者中CD44表达水平越高其预后越差，降低CD44的表达可有效抑制骨肉瘤的发展与转移。
尽管该研究仍存在一定的局限性，例如：选取GEO数据集样本量较小，也缺乏对miRNA-mRNA调控网络的体内外验证实验。但该研究通过生物信息网络手段，综合各数据库的相关研究，更加系统、全面的从宏观层面构建骨肉瘤基因调控网络；避免传统研究对其单一或片面的阐述，为临床治疗和实验研究提供有效依据。
鉴于生物信息学的优势，该研究发现miRNA和mRNA在骨肉瘤中的表达是通过多途径、多靶点进行调控。通过对其miRNA和mRNA的筛选、分析，认为潜在miRNA-mRNA网络对阐明骨肉瘤发病机制、预后及开发新靶点药物具有重要的指导意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

基于生物信息学构建骨肉瘤miRNA-mRNA的调控网络

Construction of osteosarcoma miRNA-mRNA regulatory network based on bioinformatics

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