载阿霉素自组装多肽水凝胶的制备及体外评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3114

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (16): 2488-2493.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3114

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载阿霉素自组装多肽水凝胶的制备及体外评价

张馨1，陆莹1，姚庆强2，朱颐申1

1南京工业大学，江苏省南京市 211816；2南京医科大学附属南京医院骨科，江苏省南京市 210006

收稿日期:2020-02-18 修回日期:2020-02-27 接受日期:2020-06-05 出版日期:2021-06-08 发布日期:2021-01-07
通讯作者: 姚庆强，教授，南京医科大学附属南京医院骨科，江苏省南京市 210006 朱颐申，教授，南京工业大学生物与制药工程学院，江苏省南京市 211816
作者简介:张馨，女，1994年生，陕西省西安市人，汉族，2020年南京工业大学毕业，硕士，主要从事骨组织工程方面的研究。
基金资助:
江苏省社会发展重点项目(BE2019736)，项目负责人：朱颐申

Preparation and in vitro evaluation of self-assembling peptide hydrogel loaded with doxorubicin

Zhang Xin1, Lu Ying1, Yao Qingqiang2, Zhu Yishen1

1Nanjing Tech University, Nanjing 211816, Jiangsu Province, China; 2Department of Orthopedic Surgery, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210006, Jiangsu Province, China

Received:2020-02-18 Revised:2020-02-27 Accepted:2020-06-05 Online:2021-06-08 Published:2021-01-07
Contact: Yao Qingqiang, Professor, Department of Orthopedic Surgery, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210006, Jiangsu Province, China Zhu Yishen, Professor, The College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, Jiangsu Province, China
About author:Zhang Xin, Master, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Key Project of Social Development in Jiangsu Province, No. BE2019736 (to ZYS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
自组装多肽水凝胶：是一种能够人工合成且具有类似细胞外机制的组织工程材料，其中多肽分子可利用非共价键作用力自组装形成纳米纤维结构，与生物矿化、纳米技术、组织工程、细胞生物学等学科相结合可促进软骨与骨再生。
药物缓释系统：药物缓释是通过物理或化学手段将小分子药物与高分子载体结合，在体内扩散、渗透，将小分子药物持续可控的释放出来，从而达到预期的药物治疗效果。药物缓释系统由于具有良好的生物相容性、可调节的释药速率、特异的靶向性等特点，被广泛运用于肿瘤治疗方面的研究。

背景：化疗是治疗骨肉瘤的重要手段，但传统的小分子疗法临床疗效不理想，不良反应严重，因此需要研发一种治疗骨肉瘤的新治疗方法，能够低剂量下抗肿瘤并降低不良反应。
目的：构建载阿霉素的自组装多肽水凝胶体系(doxorubicin self-assembling peptide hydrogel，DOX-SAPH)，分析其体外药物释放性能与生物相容性。
方法：将阿霉素引入到由FEFEFKFK(F为苯丙氨酸，E为谷氨酸，K为赖氨酸)构成的自组装多肽水凝胶中，制备含20，30，40 g/L FEFEFKFK的DOX-SAPH，该体系中阿霉素质量浓度为2 g/L。将3种DOX-SAPH置于PBS中，定时检测阿霉素释放量。将3种DOX-SAPH浸提液分别与兔骨髓间充质干细胞共培养，CCK-8法检测细胞存活率。将不同质量浓度的阿霉素溶液与含不同质量浓度阿霉素的DOX-SAPH浸提液(含FEFEFKFK 30 g/L)分别与MG63人骨肉瘤细胞共培养，采用CCK-8法检测细胞存活率。
结果与结论：①随着水凝胶中FEFEFKFK质量浓度的增加，DOX-SAPH的缓释作用增强，体外第168小时，20，30，40 g/L DOX-SAPH的药物累计释放率分别为88%，83%，80%；②体外共培养1，3，5 d时，20 g/L DOX-SAPH浸提液组的细胞增殖快于30，40 g/L DOX-SAPH浸提液组 (P < 0.05)，其中40 g/L DOX-SAPH浸提液组于第1天时有一定的细胞毒性；③阿霉素溶液与DOX-SAPH浸提液呈浓度依赖性抑制MG63细胞的增殖，当阿霉素溶液与DOX-SAPH浸提液中阿霉素质量浓度<12.5 mg/L时，二者对MG63细胞的毒性无明显差异(P > 0.05)；当阿霉素质量浓度≥ 12.5 mg/L时，阿霉素溶液的细胞毒性大于DOX-SAPH浸提液(P < 0.05)；④结果表明，DOX-SAPH具有良好的药物缓释作用，可抑制MG63骨肉瘤细胞的生长。

https://orcid.org/0000-0002-1676-3382 (张馨)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨, 材料, 水凝胶, 肿瘤, 阿霉素, 体外评价, 骨肉瘤, 组织工程

Abstract: BACKGROUND: Chemotherapy is an important method for treating osteosarcoma, but traditional small molecule therapy is not ideal for clinical efficacy and has serious adverse reactions. Therefore, it is necessary to develop a new method for osteosarcoma, which can anti-tumor at low doses and reduce adverse reactions.
OBJECTIVE: To construct a self-assembling peptide hydrogel (SAPH) loaded with doxorubicin (DOX) and analyze its drug release performance and biocompatibility in vitro.
METHODS: DOX was introduced into SAPH composed of FEFEFKFK (F, phenylalanine; E, glutamic acid; K, lysine), prepared to contain 20, 30, and 40 g/L DOX-SAPH of FEFEFKFK; the DOX mass concentration in this system was 2 g/L. Three kinds of DOX-SAPH were placed in PBS, and the amount of DOX released was regularly detected. Three DOX-SAPH extracts were co-cultured with rabbit bone marrow mesenchymal stem cells, and the cell survival rate was detected by CCK-8 method. The DOX solution containing different concentrations of DOX and the DOX-SAPH extract (containing FEFEFKFK 30 g/L) were co-cultured with MG63 human osteosarcoma cells, and the cell survival rate was detected by CCK-8 method.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) With the increase of the concentration of FEFEFKFK in the hydrogel, the sustained release effect of DOX-SAPH was enhanced. The cumulative drug release rate of DOX-SAPH at 20, 30, and 40 g/L at the 168th hour in vitro was 88%, 83%, and 80%. (2) The cells in 20 g/L DOX-SAPH extract group proliferated faster than 30 and 40 g/L DOX-SAPH extract group at 1, 3, and 5 days in vitro (P < 0.05), in which the 40 g/L DOX-SAPH extract group had certain cytotoxicity on the first day. (3) DOX solution and DOX-SAPH extract showed concentration-dependent inhibition of MG63 cell proliferation, when the concentration of DOX in the DOX solution and the DOX-SAPH extract was lower than 12.5 mg/L, there was no significant difference in the toxicity of the two to MG63 cells (P > 0.05). When the concentration of DOX was higher than 12.5 mg/L, the cell toxicity of the DOX solution was greater than that of DOX-SAPH extract (P < 0.05). (4) The results show that DOX-SAPH has a good drug slow-release effect, which can inhibit the growth of MG63 osteosarcoma cells.

Key words: bone, materials, hydrogel, tumor, doxorubicin, in vitro evaluation, osteosarcoma, tissue engineering

中图分类号:

张馨, 陆莹, 姚庆强, 朱颐申. 载阿霉素自组装多肽水凝胶的制备及体外评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2488-2493.

Zhang Xin, Lu Ying, Yao Qingqiang, Zhu Yishen. Preparation and in vitro evaluation of self-assembling peptide hydrogel loaded with doxorubicin[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(16): 2488-2493.

图/表（结果） 7

2.1 DOX-SAPH的制备将20，30，40 g/L的DOX-SAPH倒置30 min观察，凝胶仍贴附在西林瓶底部不流动，见图2。

2.2 DOX-SAPH微观形貌测试前将20，30，40 g/L的DOX-SAPH冻干，其形貌如图3所示，所有水凝胶均具有片状微结构，参考文献[24]可知DOX-SAPH冻干粉显微结构与SAPH冻干粉无区别。

2.3 DOX-SAPH傅里叶红外光谱分析 DOX、SAPH和20，30，40 g/L DOX-SAPH的特征傅里叶红外光谱图见图4所示，谱图出现SAPH的特征峰分别是：3 287 cm-1(-NH-)，1 209 cm-1 (C-N)，1 625 cm-1和1 695 cm-1(β折叠)，其光谱强度表现为：40 g/L>30 g/L >20 g/L。当DOX负载到SAPH上后同时出现了以上FEFEFKFK和DOX的特征吸收谱图，增加了DOX的特征峰989 cm-1(C-C-C)。

2.4 DOX检测方法学考察
2.4.1 DOX检测波长选择 DOX在480 nm波长处有最大吸收，见图5a；含FEFEFKFK的PBS溶液在480 nm处无吸收，见图5b。故选480 nm为DOX的测定波长。

2.4.2 DOX标准曲线的绘制根据实验数据进行线性回归拟合，如图6所示，得到标准曲线方程为A=0.016 51c+0.005 14，R2=0.999 6。表明DOX溶液在1.76-56.32 mg/L范围内线性关系良好。

2.4.3 精密度日内和日间精密度分别为0.87%，1.49%，1.40%和3.19%，1.76%，1.57%，表明此方法具有良好的日内精密度和日间精密度。
2.5 DOX-SAPH体外药物释放率由图7可知，FEFEFKFK浓度越高纳米纤维密度越大，所形成的水凝胶中DOX的缓释作用越强，当短肽质量浓度降低到20 g/L时，24 h后接近85%的DOX被释放；当短肽质量浓度升高到40 g/L时，约55%的DOX被释放。20，30，40 g/L的DOX-SAPH在第168小时的DOX平均累计释放百分率分别达到88%，83%，80%。

2.6 SAPH体外细胞相容性实验由CCK-8检测结果可知(图8a)，20 g/L SAPH浸提液中第1，3，5 天的兔骨髓间充质干细胞增殖高于30，40 g/L SAPH浸提液(P < 0.05)；第7天时，由于皿底细胞量高细胞接触抑制，3组间细胞增殖比较差异无显著性意义(P > 0.05)；其中培养第1天时，40 g/L SAPH浸提液中的细胞增殖率为86%，有一定的细胞毒性。结合体外释放率结果，选30 g/L SAPH负载DOX进行细胞毒性实验。
2.7 DOX-SAPH细胞毒性实验根据图8b结果所示， DOX-SAPH浸提液与DOX溶液都能明显抑制MG63细胞的增殖。DOX-SAPH浸提液的IC50值为6.26 mg/L，DOX溶液的IC50值为2.91 mg/L。当DOX的质量浓度<12.50 mg/L时，DOX溶液和DOX-SAPH浸提液的细胞毒性无明显差异(P > 0.05)；当DOX质量浓度≥12.50 mg/L时，与DOX-SAPH浸提液相比，DOX溶液对MG63细胞展现出更强的细胞毒性。

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引言

骨肉瘤是一种常见恶性原发性骨癌，多发于青少年，具有较高的致死率，严重影响患者的生活质量[1-2]。中国每年因骨肿瘤致死、残疾及功能障碍的人数位居世界首位[3]。1970年前，手术切除是肿瘤最主要的治疗方法，患者术后总生存率约为20%[4-5]，术后化疗可将青少年患者总生存率提高至60%-70%[6]。在过去几十年中骨肉瘤的临床治疗方法变化不大，目前主要是新辅助化疗、原发肿瘤的手术切除和辅助化疗[7-9]，但术后常伴有部分肿瘤组织残余未完全切除，肿瘤细胞转移和术中医源性传播的情况，为术后肿瘤局部复发埋下隐患。
阿霉素(doxorubicin，DOX)是一种蒽环类的抗肿瘤药物，其抗瘤谱较广，临床上可用于乳腺癌、支气管肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤等多种肿瘤的治疗[10-11]。由于DOX会导致心脏毒性、白细胞数目下降、血小板数目减少，常规治疗剂量就会对人体产生明显的不良反应，故DOX的在临床应用上具有很大的局限性[12-13]。随着制药技术的进步，可通过制备生物降解型缓释给药系统增强药物在局部肿瘤部位的分布，降低全身毒副作用，提升化疗药物的疗效，提高患者生活质量。目前生物降解型缓释给药系统与骨修复材料相结合的复合材料，为骨肉瘤治疗提供了一个新的研究方向。
自组装多肽水凝胶(self-assembling peptide hydrogel，SAPH)构建的各种功能性材料在组织工程[14-16]、药物递送[17-20]、生物传感[21-23]、生物矿化[24-25]、药物释放等生物医学领域具有广阔的应用前景[26-28]。自组装多肽具有良好的生物相容性和生物降解性，通过合理调控多肽的分子结构及改变外界的环境，多肽分子可利用非共价键作用力自组装形成纳米纤维结构，进而形成水凝胶[29]。FEFEFKFK(F为苯丙氨酸，E为谷氨酸，K为赖氨酸)在水溶液中可自组装成有疏水和静电相互作用的反向β片层结构水凝胶，制备成本低，生产效率高[30-31]。有文献表明，由FEFEFKFK自组装的SAPH是促进骨修复的良好三维基质，可促进软骨细胞、成骨细胞的生长[32]。
由于SAPH材料可模拟天然细胞外基质环境，具有较高的保留水分子能力，使其非常适合作为生物降解型缓释给药系统[33]。在药物缓释给药系统中，由于脂质体等纳米材料需要具备形状、大小、表面电荷(可改善被动靶向)和配体共轭(可改善主动靶向)等多种特性才能将抗肿瘤药物特异性地递送至目标部位[34]。虽然全身性药物递送系统是有效的，但是在其治疗应用时常因制备方法过于复杂而受到限制[35]。近年来，易于制备的可注射载药水凝胶在术后局部化疗的应用引起了人们的广泛关注，但迄今为止抗肿瘤药物与SAPH相结合的缓释给药系统复合材料相关报道较少[36-37]。实验制备了一种基于FEFEFKFK的SAPH，如图1所示，并以DOX作为模型药物，研究了DOX-SAPH的体外释药性能、细胞相容性及细胞毒性，并对其进行表征分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外释药性能及体外细胞实验。
1.2 时间及地点实验于2019年2至8月在南京工业大学及南京市第一医院骨科实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 主要仪器 EVOLUTION 201紫外分光光度仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；ES1035A型电子分析天平(天津德安特传感技术有限公司)；HZQ-D台式恒温振荡器(太仓市实验设备厂)；HH-S恒温水浴锅(江苏省金标市正基仪器有限公司)；Nicolet-5700傅里叶红外光谱仪(美国尼高力科学仪器有限公司)；Synergy 2 酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；S-4800扫描电镜(日本日立公司)；Freezone 2.5冻干机(美国Labconco公司)。
1.3.2 主要药品与试剂盐酸阿霉素(DOX·HCl，上海阿拉丁生化科技技术股份有限公司)；PBS(0.01 mol/L，pH=7.2-7.4，上海源叶生物技术有限公司)；短肽FEFEFKFK(实验室自制，纯度98.9%)；CCK-8(江苏凯基生物技术股份有限公司)。
1.3.3 细胞株及培养基 MG63人骨肉瘤细胞(江苏凯基生物技术股份有限公司)；兔骨髓间充质干细胞由南京市第一医院王黎明教授实验室提供；胎牛血清(杭州天杭生物科技股份有限公司)；胰蛋白酶、不完全高糖培养基、不完全低糖培养基(江苏凯基生物技术股份有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 DOX-SAPH的制备室温下将DOX溶于PBS，随后按照20，30，40 g/L的质量浓度将所需量FEFEFKFK粉末溶于含2 g/L DOX的PBS中。涡旋样品1 min，放入70 ℃烘箱加热1 h至完全溶解，得到DOX-SAPH，取出冷却放置室温备用。
1.4.2 扫描电镜观察将20，30，40 g/L的 DOX-SAPH在低温、真空下冷冻干燥，干燥后进行镀铂处理，使用扫描电镜进行形貌观察。
1.4.3 傅里叶红外观察将DOX、SAPH、DOX-SAPH在低温、真空下冷冻干燥，使用傅里叶红外光谱仪测试红外光谱图。
1.4.4 DOX检测方法学考察
检测波长选择：精密称取DOX 2.20 mg配制成88 mg/L的DOX溶液。于波长200-800 nm处以2 nm为单位进行全波长扫描。
FEFEFKFK干扰实验：称取适量的FEFEFKFK制成空白溶液。取空白溶液置于10 mL容量瓶，用PBS(pH=7.4)稀释至刻度，测定。取DOX对照品配成10 mg/L对照品溶液，检测比对。
DOX标准曲线的制备：室温下精密称取DOX 2.20 mg，用离子强度I=0.2 mol/L、pH=7.4的PBS配置质量浓度为88 mg/L的DOX溶液，再以此溶液配制一系列不同质量浓度的溶液。以空白缓冲液为对照，用紫外-可见分光光度计测定DOX溶液在λ=480 nm处的吸光度值。以吸光度-质量浓度作图得到DOX标准曲线。
精密度：分别配置高、中、低(56.32，14.08，3.52 mg/L)质量浓度的DOX溶液，紫外-可见分光光度计法测定DOX浓度，在1 d内每个浓度重复测量3次，考察日内精密度；同法连续测定3 d，每天1次，考察日间精密度。
1.4.5 体外释药实验取1 mL DOX-SAPH置于已称质量的西林瓶，60 ℃恒温水浴放置2 h使其充分成胶，加入1 mL离子强度I=0.2 mol/L、pH=7.4的PBS中，置于37 ℃恒温培养摇床，震荡速率为80 r/min，定时取出全部释放介质并补充新鲜释放介质1 mL。使用紫外-可见分光光度计检测其在480 nm处的吸收强度，通过标准曲线计算溶液中DOX的浓度，以累计释药量对时间作图。取3个平行样进行测试，数据表示为平均值。
1.4.6 SAPH体外细胞相容性实验参照浸提液细胞毒性实验标准(GB/T 16886.5-2003/ISO 10993-5:1999)，将1 mL 20，30，40 g/L的SAPH溶液分别加入10 mL完全低糖培养基，然后置于37 ℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱内浸提24 h。
选择生长良好的4代兔骨髓间充质干细胞接种于96孔板，接种体积为200 μL，接种细胞数为5×103/孔。37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养24 h后，每孔加不同材料浸提液，对照组加等量的培养基(认为细胞存活率为100%)，继续孵育1，3，5，7 d后，采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况。每孔加入CCK-8 20 μL，孵育1 h，用酶标仪测定反应液在450 nm处的吸光度值，细胞存活率通过如下公式进行计算：细胞存活率=(实验组A450-空白孔A450)/(对照组A450-空白孔A450)。
1.4.7 DOX-SAPH细胞毒性实验参照浸提液细胞毒性实验标准，在1 mL 30 g/L的 DOX-SAPH中加入10 mL完全高糖培养基，然后置于37 ℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱内浸提24 h。采用当量浓度，即凝胶中DOX质量浓度为2 g/L，浸提液体积为10 mL，所以DOX当量浓度是200 mg/L。将该浸提液再按1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128， 1∶20 000等比例用完全高糖培养基稀释，即得含DOX质量浓度分别为100，50，25，12.5，6.25，3.13，1.56，0.01 mg/L的DOX-SAPH浸提液。
选择生长良好的MG63，每孔5×103个细胞接种到96孔板，每孔接种体积为200 μL。37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养24 h后，实验组分别加入0.01，1.56，3.13，6.25，12.50，25，50，100 mg/L的DOX溶液或含0.01，1.56，3.13，6.25，12.50，25，50，100 mg/L DOX的DOX-SAPH浸提液200 μL，对照组加等量的培养基(认为细胞存活率为100%)，继续孵育1 d后采用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。每孔加入CCK-8 20 μL，孵育1 h，用酶标仪测定反应液在450 nm处的吸光度值。细胞存活率计算方法同1.4.6，并用GraphPad Prism 7.0软件计算DOX溶液和DOX-SAPH浸提液的药物半数抑制浓度(IC50)。
1.5 主要观察指标 DOX-SAPH的体外药物释放性能与生物相容性。
1.6 统计学分析采用单因素方差(one-way ANOVA)分析进行统计学分析，实验结果表示为x±s，当P < 0.05时认为差异有显著性意义。

讨论

组织工程学是一门将材料科学与细胞生物学相结合，认识正常与病理组织和结构功能关系，研究功能性生物替代物的学科。研究表明，SAPH材料具有良好的细胞信号传导性、释药性、机械性及生物降解性。LI等[24]运用浸渍涂布法将基于FEFEFKFK的SAPH修饰于聚己内酯支架表面，构建了一种细胞外基质仿生支架。体内骨修复实验结果证明，与空白缺损组和植入聚己内酯支架相比，经过SAPH表面修饰的聚己内酯支架对软骨和软骨下骨具有更好的一体化修复的作用。药物的局部药物输送系统能够将抗肿瘤药物直接输送到目标部位，而无需复杂的过程[38]。阿霉素局部给药可减少治疗骨肉瘤时的不良反应，目前希望能有新的进展，通过设计一种对抗肿瘤药物缓释可控的SAPH来改善骨肉瘤术后肿瘤复发、骨缺损两大难题。目前在骨肉瘤治疗的相关研究中尚未发现成熟的集抗肿瘤与骨修复能力为一体的可注射骨修复材料。
实验建立了DOX-SAPH的制备方法，制备了具有缓释效果的DOX-SAPH。倒置小瓶法成胶结果与文献报道中SAPH临界胶凝质量浓度≤5 g/L相符，20，30，40 g/L的DOX-SAPH成胶性好，可长时间贴附西林瓶底部[32]。实验的DOX-SAPH扫描电镜图未观察到纤维结构，结合文献判断，由于20，30，40 g/L的DOX-SAPH凝胶浓度高纤维网络重叠，冻干后无法观察到典型的纤维结构，观察DOX-SAPH纤维结构需将样品稀释至极低浓度，稀释浓度过大将会影响水凝胶的真实结构，故实验未进一步稀释检测[24]。
由DOX-SAPH的傅里叶红外光谱图可知，FEFEFKFK的特征吸收峰有3 310-3 350 cm-1处的-NH-伸缩振动，1 650-1 500 cm-1处的-NH2弯曲振动，1 230-1 030 cm-1处的C-N伸缩振动。1 625 cm-1的强吸收带和1 695 cm-1的弱吸收带是反向β折叠的特征吸收[30]。DOX标准品的特征吸收峰 816 cm-1有单氧六元环弱的面外振动，1 109 cm-1的醚键连接甲基的C-H振动，1 285 cm-1的单氧六元环上的C-H振动，989 cm-1的DOX酮基的C-C-C的弯曲振动峰[39]。当DOX负载到SAPH上后同时出现了以上FEFEFKFK和DOX的特征吸收，其中DOX部分特征峰因浓度低致使响应值不明显。
体外释放度是药物缓释系统的一项重要指标。DOX-SAPH的体外释放度实验显示，其24 h内释药速率较快，随后可稳定释药，释药达7 d以上，具有良好的缓释作用；其中，FEFEFKFK含量越高缓释作用越强，具体表现为：20 g/L 的DOX-SAPH释放DOX速度最快，而40 g/L的 DOX-SAPH释放DOX速度最慢，30 g/L DOX-SAPH释放DOX速度居于两者之间。实验结果表明，改变FEFEFKFK纤维的密度可有效控制水凝胶释放DOX的速度。实际应用时可通过调节FEFEFKFK含量达到对DOX不同释药速率和释放量的需求。
在体外细胞相容性实验中，40 g/L SAPH浸提液在体外细胞培养1 d时显现了一定的细胞毒性，20，30 g/L的 SAPH浸提液细胞相容性良好。CASTILLO DIZA等[32]研究了基于FEFEFKFK的SAPH作为原代人成骨细胞培养的支架的潜力，结果证明30 g/L的SAPH最适合用于原代人成骨细胞培养，且凝胶内细胞的活力和增殖可保持14 d以上(最长测试时间)。在三维体外细胞培养中，40 g/L SAPH中人成骨细胞存活率低，分析是由于水凝胶纤维网络的密度较高，导致凝胶孔隙率较小，限制了营养物质扩散、气体交换和细胞排泄物输出。MUJEED等[40]将牛软骨细胞在基于FEFEFKFK的SAPH进行二维和三维体外细胞培养，发现其可在体外维持软骨细胞活力与增殖长达35 d。因此，基于FEFEFKFK的SAPH是一种有前景的骨组织修复材料，因此选择了30 g/L SAPH用于进一步的细胞研究。
实验通过CCK-8法考察30 g/L DOX-SAPH对MG63细胞的毒性，结果显示DOX-SAPH浸提液和游离DOX的细胞毒性均存在一定的浓度依赖性，当DOX质量浓度≥12.50 mg/L时，DOX-SAPH浸提液的细胞毒性显著低于游离DOX，这主要是因为在DOX-SAPH体系中DOX未被完全浸提出来，故在高质量浓度下游离DOX的细胞毒性大于DOX-SAPH浸提液。此外，体外释放度实验表明，DOX-SAPH可缓释DOX达7 d以上。综上所述，DOX-SAPH的抗肿瘤效果优于游离DOX。
实验制备的DOX-SAPH是一种局部药物输送系统，首先缓释DOX抑制骨肉瘤细胞增殖，当DOX缓释完全后，SAPH由于自身的生物相容性及其他特性可促进术后骨缺损修复，该制剂易于制备，具有可注射性和局部药物递送的特性，使得这种肽基水凝胶材料为当前骨肉瘤临床治疗提供了新的思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

载阿霉素自组装多肽水凝胶的制备及体外评价

Preparation and in vitro evaluation of self-assembling peptide hydrogel loaded with doxorubicin

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