卵巢癌CD90+肿瘤干细胞的生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.014

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

CD90蛋白：CD90，又称Thy-1，是细胞黏附分子免疫球蛋白超家族的成员。目前在神经细胞、胸腺细胞、成纤维细胞亚群、内皮细胞、肾小球系膜细胞、造血干细胞等表面均有发现。CD90蛋白已被确定在非淋巴组织的多种干细胞中均有不同程度的表达。CD90可以调节细胞-细胞、细胞-细胞质之间的反应，在神经再生和转移、炎症以及纤维化中起重要作用。

肿瘤干细胞：肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。传统观念认为，肿瘤是由体细胞突变而成，每个肿瘤细胞都可以无限制地生长。但这无法解释肿瘤细胞似乎具有无限的生命力以及并非所有肿瘤细胞都能无限制生长的现象。肿瘤细胞生长、转移和复发的特点与干细胞的基本特性十分相似，因此，有学者提出肿瘤干细胞的理论。这一理论为重新认识肿瘤的起源和本质，以及临床肿瘤治疗提供了新的方向和视觉角度。

背景：卵巢癌干细胞学说认为：肿瘤中有一小部分具备自我更新、多向分化的干细胞，属于卵巢癌复发和耐药的根源。相关研究结果显示：CD90能够作为间充质干细胞和其他癌症的干细胞标志物。

目的：探讨卵巢癌CD90⁺肿瘤细胞的生物学特性。

方法：从卵巢癌患者腹水中分离原代卵巢癌细胞，以流式分选法得到CD90⁺、CD90^-细胞，采用 RT-PCR法检测干细胞相关基因及上皮间质化相关基因表达，采用Transwell小室侵袭实验观察细胞侵袭力，克隆形成实验观察细胞增殖分化能力，悬浮成球实验观察干细胞潜能，动物体内成瘤实验观察成瘤率。

结果与结论：①原代卵巢癌CD90⁺细胞的干细胞相关基因CD44、CD133、ALDH1表达以及EMT相关基因N-cad、Vimentine表达明显高于CD90^-细胞(P < 0.05)，EMT相关基因E-cad表达低于CD90^-细胞(P < 0.05)。②随着接种细胞数目的增加，CD90⁺、CD90^-细胞的成瘤率升高，CD90⁺细胞升高更明显。③CD90⁺细胞穿膜细胞数、细胞克隆数以及悬浮成球数目显著高于CD90^-细胞(P < 0.05)。④结果提示CD90⁺细胞高表达间质属性基因和干细胞相关基因，具备更高的侵袭力、增殖分化能力、体内成瘤能力和干细胞潜能，CD90⁺细胞分离可能成为卵巢癌干细胞分离的新方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0003-1998-4794 (刘智慧)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 卵巢癌, 原代细胞, CD90+细胞, 生物学特性

Abstract:

BACKGROUND: Thinking from ovarian cancer stem cell theory shows that: in the tumor cells, there are a fraction of stem cells with self-renewing ability and multipotent differentiation, which are the root causes of ovarian cancer recurrence and drug resistance. Studies have shown that CD90 can be used as a surface marker of mesenchymal stem cells and stem cells of other cancers.

OBJECTIVE: To explore the biological features of CD90⁺ tumor cells from ovarian cancer tissues.

METHODS: Primary ovarian cancer cells were isolated from the abdominal dropsy of ovarian cancer patients to sort CD90⁺ and CD90^- cells using flow cytometry. RT-PCR was used to detect expressions of stem cell-related genes and epithelial to mesenchymal transition-related genes. Cell invasion was observed by Transwell invasion assay, cell proliferation and differentiation observed by clone formation assay, stem cell potential observed by suspension sphere-forming assay, and tumor formation rate observed by in vivo tumorigenicity experiment.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the CD90^- cells, the expressions of CD44, CD133, ALDH1, N-cad and Vimentine were significantly higher in the CD90⁺cells (P < 0.05), but the expression of E-cad was significantly decreased in the CD90⁺ cells (P < 0.05). Tumor formation rates of CD90^- and CD90⁺ cells were increased significantly with the increase of seeded cell number, which was more obvious in CD90⁺ cells. The number of transmembrane cells, the number of cell clones and the number of suspended spheres were significantly higher in the CD90⁺ cells than the CD90^- cells (P < 0.05). Experimental findings from this study show that CD90⁺ cells highly express epithelial to mesenchymal transition-related genes and stem cell-related genes, with higher invasion, proliferation and differentiation, in vivo tumorigenicity and potential of stem cells. CD90⁺ cell separation may be a new method to separate ovarian cancer stem cells.

刘智慧，向志辉. 卵巢癌CD90+肿瘤干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(10): 1468-1473.

Liu Zhi-hui, Xiang Zhi-hui.

Biological features of CD90⁺ tumor stem cells in ovarian cancer

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学观察实验。

1.2 时间及地点于2013年12月至2015年1月在华中科技大学同济医学院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 Wistar 大鼠20只，体质量为0.16- 0.40 kg，平均(0.20±0.01) kg，雌雄不限，由川北医学院动物实验中心提供，严格遵守相关标准进行饲养^[11]。

1.3.2 实验相关试剂和仪器 DF12培养基及胎牛血清(美国Gibco公司)，流式抗体EPCAM-FITC、CD90- FITC，CD133-PE(美国 BD公司)，表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子(美国 Peprotech公司)，激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)，恒温摇床(中国艾测电子科技有限公司)，RT-PCR仪、梯度PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 腹水原代细胞分离、鉴定抽取未进行化疗的卵巢癌患者的腹水1 000 mL，在常温下离心(1 000 r/min) 10 min，弃除上清后，在室温下裂解红细胞5 min，PBS清洗，再次离心(1 000 r/min)5 min，经200目滤网过滤后，采用DF12培养基重悬贴壁培养，静置48 h后弃除未贴壁细胞，PBS清洗，继续培养。待细胞铺满瓶底后立即采用梯度消化去除成纤维细胞，采用 EpCAM-FITC标记，若上皮细胞比率 > 90%为合格原代细胞^[12-13]。

1.4.2 CD90⁺和CD90^-细胞的分选收集上述贴壁培养的原代细胞，预冷PBS冲洗2次后加入FITC标记CD90抗体，37 ℃孵育1 h。预冷PBS冲洗2次，上流式分选仪对CD90⁺和CD90^-细胞进行分选^[14-18]。

1.4.3 干细胞及上皮间质化相关基因表达利用RT-PCR方法检测干细胞相关基因以及上皮间质化相关基因的表达，严格遵循试剂盒操作说明进行操作。采用SYBR green PCR mix反应条件参数：95 ℃ 1 min→95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 15 s，40个循环，以GAPDH作为内参基因，基因相对表达量以2^-^??Ct表示^[19-20]。

1.4.4 细胞成瘤能力观察将CD90⁺和CD90^-细胞分别以10²，10³，10⁴细胞数与Matrigel进行等体积混合共100 μL，分别接种于Wistar大鼠两侧大腿根部(左侧为CD90⁺，右侧为CD90^-)。每周两次观察肿瘤的生长情况，用成瘤率和成瘤时间表示成瘤情况。若4个月内还没有成瘤者则可以终止实验^[21-24]。

1.4.5 细胞增殖分化能力检测将CD90⁺和CD90^-细胞以每孔500个接种在6个孔板上进行培养，每3 d换液 1次，2周后去除培养基，采用多聚甲醛进行固定，结晶紫染色计数孔板内的细胞克隆数。同样采用上述相同方法将CD90⁺和CD90^-细胞接种在低黏附24孔板上进行培养，培养基中加入10 μg/L表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子，每3 d补液1次，2周后观察直径 > 50 μm的悬浮球体数^[25-26]。

1.4.6 细胞侵袭相关性实验将4 ℃预冷的无血清 RPMI1640培养基与Matrigel胶等比例混合均匀放置在冰上待用。在超净台内取Transwell小室放入孔板内，采用移液器吸取配好的10 μL Matrigel胶均匀的涂敷在小室上室的膜上，注意不要留有气泡，24孔板转移到37 ℃培养箱孵育30 min使Matrigel胶凝固，凝固后Transwell小室上室加入含细胞的无血清培养基，下室加入含体积分数为20%胎牛血清的培养基，培养24 h。培养完毕后取出小室用棉签拭去膜上层细胞，以 40 g/L多聚甲醛进行固定，PBS清洗，结晶紫染色，计数穿膜细胞数。

1.5 主要观察指标 ①CD90⁺、CD90^-细胞的干细胞相关基因和EMT相关基因相对表达。②CD90⁺、CD90^-细胞成瘤能力。③CD90⁺、CD90^-细胞侵袭力、增殖分化能力和悬浮成球数。

1.6 统计学分析利用SPSS 18.0软件进行处理，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

卵巢癌是临床上常见的疾病，患者发病后临床症状不显著，早期难以发现，多数患者一旦确诊已经是中晚期，错过了最佳治疗时机^[27-28]。卵巢癌的常规方法更多以化疗为主，该治疗方法虽然能够缓解病情的发展，但是长期疗效不理想，患者死亡率也比较高。近年来，肿瘤干细胞得到广泛关注，它是具有高度成瘤性，能够多向分化和自我更新的一类细胞。卵巢癌瘤体原位灶、腹水、转移灶中均存在一小部分具备高度分化潜能的细胞，这些细胞能够维持自身比例高达0.1%-1%，在化疗过程中能够抵抗凋亡生存下来并且成为日后复发和耐药的根源^[29-40]。

CD90是卵巢癌中相对比较重要的干细胞标志，可作为细胞之间的重要连接分子，在多种细胞中广泛表达^[41-42]。有研究表明，CD90能够单独作为肝癌和肺癌的干细胞标志物，并且该分子还能够参与维持干细胞自身的属性^[43-44]。卵巢癌患者经过化疗治疗后，多数癌细胞会发生EMT现象^[45-47]，从而使得残留的肿瘤细胞获得更强的恶性表型，治疗后复发率相对较高，实验结果显示原代卵巢癌细胞CD90⁺细胞的干细胞相关基因CD44、CD133、ALDH1表达以及EMT相关基因N-cad、Vimentine表达明显高于原代卵巢癌细胞CD90^-细胞 (P < 0.05)，而EMT相关基因E-cad表达低于CD90^-细胞(P < 0.05)，由此看出，EMT在卵巢癌化疗后发生和转移过程中发挥重要的作用^[48-49]。

研究结果显示，随着接种细胞数目的增加，CD90⁺、CD90^-细胞的成瘤率升高，成瘤时间缩短，CD90⁺细胞升高更明显，由此看出：CD90⁺细胞能够进一步提高肿瘤细胞的增殖和分化以及成瘤能力^[50]。同时，CD90⁺细胞穿膜细胞数、细胞克隆数以及悬浮成球数目显著高于CD90^-细胞(P < 0.05)，由此看出：卵巢癌细胞CD90⁺细胞亚群具有更强的增殖、分化以及自我更新能力，能够抵抗卵巢细胞的凋亡。

综上所述，肿瘤细胞具有高度异质性，并且肿瘤中有一小部分具备自我更新、多向分化的干细胞，它们是复发和耐药的根源，CD90⁺细胞高表达间质属性基因和干细胞相关基因，具备更高的侵袭力、增殖分化能力、体内成瘤能力和干细胞潜能。