骨髓间充质干细胞移植治疗系统性红斑狼疮

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.013

摘要/Abstract

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文题释义：

系统性红斑狼疮：是一种涉及许多系统和脏器的自身免疫性疾病，大量研究显示在遗传因素、环境因素、雌激素水平等各种因素相互作用下，导致T淋巴细胞减少、T抑制细胞功能降低、B细胞过度增生，产生大量的自身抗体，并与体内相应的自身抗原结合形成相应的免疫复合物，沉积在皮肤、关节、小血管、肾小球等部位。在补体的参与下，引起急慢性炎症及组织坏死，或抗体直接与组织细胞抗原作用，引起细胞破坏，从而导致机体的多系统损害。

骨髓间充质干细胞的低免疫原性：骨髓间充质干细胞表达中等量人类主要组织相容性复合体Ⅰ类分子，不表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子，也不表达Fas配体和共刺激分子如B7-1，B7-2，CD40L等。骨髓间充质干细胞既不能激活T细胞，也不是CD8⁺T细胞的靶标。CD8⁺T淋巴细胞能杀伤供者标记的单个核细胞，却不能杀伤同一供者来源的骨髓间充质干细胞。未分化的骨髓间充质干细胞不能诱导异基因淋巴细胞增殖反应，提示其无免疫原性。

背景：目前对系统性红斑狼疮患者治疗一般采用非特异性免疫抑制方法，但是预后存在易感染、复发率高等问题。

目的：评价骨髓间充质干细胞对系统性红斑狼疮小鼠的治疗作用。

方法：16只系统性红斑狼疮小鼠随机平均分为对照组与实验组，实验组小鼠经尾静脉注射移植第3代骨髓间充质干细胞，对照组注射等量的生理盐水。收集小鼠尿液采用Bradford 法检测尿蛋白水平，采集两组小鼠尾尖血液，利用放射免疫方法测定血清抗ds-DNA抗体浓度；组织学切片进行苏木精-伊红染色及免疫组化学染色，显微镜下观察小鼠肾脏病理学改变，采用流式细胞仪检测眼内眦血液、新鲜脾脏与胸腺中CD4⁺CD25⁺T细胞水平。

结果与结论：①骨髓间充质干细胞移植后10周内，两组MRL/LPR小鼠尿液中尿蛋白均逐渐升高，对照组尿蛋白升高速率明显高于实验组，从第4周至第10周，实验组小鼠尿蛋白水平明显低于对照组 (P < 0.05)。②对照组小鼠肾脏组织被淋巴细胞浸润，出现少量的浆细胞，表现出间质性肾炎病理，实验组小鼠无肾脏病理改变。③对照组与实验组小鼠的肾小球系膜区域均呈现出免疫复合物，对照组呈片状分布，实验组呈点状分布，相对所占面积比例明显低于对照组。④实验组小鼠血液和胸腺内CD4⁺CD25⁺T细胞水平明显高于对照组(P < 0.05)；实验组小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺T细胞水平略高于对照组小鼠，但差异无显著性意义(P > 0.05)。⑤实验组小鼠血清抗ds-DNA抗体浓度明显低于对照组(P < 0.05)。⑥结果提示骨髓间充质干细胞移植可改善系统性红斑狼疮小鼠的病理损伤，对系统性红斑狼疮疾病具有一定的治疗效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0001-7551-0716(王治国)

关键词: 干细胞, 移植, 系统性红斑狼疮, MRL/LPR小鼠, 骨髓间充质干细胞, 干细胞移植, CD4+CD25+T细胞水平, 血清ds-DNA抗体

Abstract:

BACKGROUND: The non-specific immune suppression method is generally used for treatment of systemic lupus erythematosus, but poor prognosis, such as infection and high recurrence rate, exists.
OBJECTIVE: To evaluate the therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on systemic lupus erythematosus in mice.
METHODS: Sixteen mice with systemic lupus erythematosus were equivalently randomized into control and experimental groups, or then subjected to passage 3 bone marrow mesenchymal stem cell transplantation or the equal volume of normal saline via the tail vein, respectively. Mouse urine samples were collected to detect urine protein levels by Bradford method. Blood samples from the tip of the mouse tail were extracted to detect serum anti-ds-DNS antibody concentration by radioimmunoassay. Mouse kidney tissues were taken and observed pathohistologically through hematoxylin-eosin staining and immunohistochemistry staining under microscope. Flow cytometry was used to detect the expression of CD4+CD25+T cells in the inner canthus blood, fresh spleen and thymus.
RESULTS AND CONCLUSION: Within 10 weeks after cell transplantation, the urine protein levels in the two groups were gradually increased, and the rising velocity was higher in the control group than in the experimental group. From the 4th to 10th week, the urine protein levels in the experimental group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05). In the control group, lymphocyte infiltration was visible in the kidney tissues with a few of plasmocytes, and pathological findings showed the mice presented with interstitial nephritis; in the experimental group, the mice had no pathological changes in the kidney. In the two groups, immune complexes were found in the mesangial area, which showed a patch-like distribution in the control group and a punctate distribution in the experimental group; the relative proportion of the occupied area in the experimental group was significantly lower than that in the control group. The expression level of CD4+CD25+T cells in the blood and thymus were significantly higher in the experimental group than the control group (P < 0.05), and the expression level of CD4+CD25+T cells in the spleen was slightly higher in the experimental group than the control group with no significant difference (P > 0.05). The serum anti-ds-DNA antibody concentration in the experimental group was significantly lower than that in the control group (P < 0.05). Taken together, bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can improve the pathological damage in systemic lupus erythematosus mice, and has a certain therapeutic effect on systemic lupus erythematosus.

王治国，刘学明，佟胜全，石哲群，饶莉. 骨髓间充质干细胞移植治疗系统性红斑狼疮[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(10): 1461-1467.

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图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量及一般状态分析 MRL/LPR狼疮小鼠16只全部进入结果分析，无脱失。整个实验过程中，两组小鼠的饮食量、饮水量、体质量、活动度以及毛发等没有明显差异。

2.2 体外培养的骨髓间充质干细胞形态接种培养 12 h左右，细胞开始贴壁，细胞呈梭形，分散于瓶底。换液后贴壁细胞开始分裂增殖，倒置显微镜下可见部分细胞呈现集落样形态生长。当细胞融合达90%左右时，细胞呈长梭形，漩涡状、网状，排列具有明显方向性(图1A，B)。第3代骨髓间充质干细胞培养时，完全贴壁，细胞呈梭形，生长迅速，细胞形态与原代细胞基本一致(图1C)。

2.3 肾脏组织学苏木精-伊红染色及免疫组化学染色检测结果对照组和实验组小鼠肾脏表面形态正常，组织切面与内髓分界明显、清晰，肾脏组织动脉壁无增厚和变硬异常形态出现。小鼠肾脏组织切片苏木精-伊红染色显示：注射生理盐水对照组小鼠肾脏组织内淋巴细胞浸润，出现少量的浆细胞，表现出间质性肾炎病理，而注射骨髓间充质干细胞的实验组小鼠无肾脏病理改变，见图2。两组小鼠肾脏组织免疫组化染色检测显示：对照组与实验组MRL/LPR小鼠的肾小球系膜区域均呈现出免疫复合物，对照组小鼠的组织免疫复合物片状分布，分布比较集中，而移植骨髓间充质干细胞实验组小鼠的免疫复合物却呈现点状分布，相对所占面积比例明显低于注射生理盐水的对照组小鼠，见图3。

2.4 CD4⁺CD25⁺T细胞水平尾静脉注射移植骨髓间充质干细胞8周后，取胸腺和脾脏组织，同时于小鼠眼内眦采集血液约0.15 mL，以剪碎法与化学处理法分别将胸腺和脾脏组织制备成单细胞悬液，计数后，利用流式细胞仪检测血液、脾脏及胸腺中CD4⁺CD25⁺T细胞水平。结果显示：实验组小鼠血液、脾脏、胸腺中的CD4⁺CD25⁺T细胞水平分别为(1.60±0.18)%，(26.00± 1.17)%，(32.00±1.87)%；对照组小鼠血液、脾脏、胸腺中的CD4⁺CD25⁺T细胞水平分别为(0.70±0.02)%，(25.00±1.01)%，(25.00±1.01)%；实验组小鼠血液和胸腺内的CD4⁺CD25⁺T细胞水平明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；虽然实验组小鼠脾脏组织CD4⁺CD25⁺T细胞水平略高于对照组，但差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.5 小鼠尿蛋白水平移植骨髓间充质干细胞后，正常收集两组小鼠尿液10周。移植细胞前，两组小鼠尿蛋白水平差异无显著性意义(P > 0.05)；移植骨髓间充质干细胞后10周内，两组MRL/LPR小鼠尿液中尿蛋白均逐渐升高，对照组尿蛋白升高速率明显高于实验组，从第4周至第10周，实验组小鼠尿蛋白水平明显低于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.6 小鼠血清抗ds-DNA抗体变化对照组、实验组第1个月血清抗ds-DNA抗体分别为(30.24±1.62)%，(24.45±2.01)%，第2个月血清抗ds-DNA抗体分别为(40.71±2.34)%，(1.87±1.92)%。实验组小鼠血清ds-DNA抗体浓度明显低于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。

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引言

材料方法

1.1 设计随机分组对照动物实验。

1.2 时间及地点于2013年10月至2014年7月在河北医科大学附属唐山工人医院完成。

1.3 材料 3月龄SPF级雄性MRL/LPR狼疮小鼠16只，体质量25-30 g，采购于南京大学模式动物研究所，饲养于河北省动物实验中心，温度(25±2) ℃、湿度(50±5)%，适应性喂养2周。8周龄SPF级雄性SD大鼠 1只用于骨髓间充质干细胞的分离及培养，体质量 200 g，采购于南京大学模式动物研究所，饲养于河北省动物实验中心。实验过程中对动物处置均符合2006年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准^[5]。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定取SPF级SD大鼠，断颈法处死，在体积分数为75%乙醇中浸泡5 min杀菌，在无菌操作台上解剖大鼠两侧后肢，取出股骨及胫骨，去除软组织及表面的肌肉，用DMEM培养液冲洗3次，剪刀剪去骨骺端，用标准培养液冲洗，冲出后的细胞悬浮液于低温条件下2 000 r/min离心5 min，除去上清液，轻轻加入淋巴细胞分离液上层，以3 000 r/min离心15 min，取界面单个核细胞层，用磷酸盐缓冲液润洗2次，2 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入培养液制成细胞悬液，调整细胞浓度为3.0×10⁶ L^-¹接种于培养瓶(含高糖DMEM培养基+体积分数为10%胎牛血清)，置37 ℃、体积分数为5%CO₂培育箱，观察细胞形态变化，培育2 d后用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，制成单细胞悬液，以细胞浓度为3.0×10⁶ L^-¹接种传代。第3代细胞接种后在培育箱中继续培养72 h，使用胰蛋白酶消化，以1 500 r/min离心5 min，细胞计数仪计数，用生理盐水调整细胞浓度为1.0×10¹⁰ L^-¹移植备用。

1.4.2 实验分组和骨髓干细胞移植小鼠于动物实验中心适应性喂养2周后，检测体质量及尿蛋白浓度，无差异性。将MRL/LPR狼疮小鼠随机分为对照组与实验组，每组8只。实验组每只小鼠经尾静脉注射细胞浓度为1.0×10¹⁰ L^-¹骨髓间充质干细胞悬液0.1 mL；对照组每只小鼠经尾静脉注射等量的生理盐水。

1.4.3 小鼠尿液样品收集采用小鼠代谢笼在上午 8：00至12：00收集尿液，收集频率为每4 d 1次，每次4 h，为防止水和食物对尿液样品造成污染，收集时间段内对小鼠进行禁食禁水。收集小鼠尿液装于冻存EP管中，于冰箱中-20 ℃环境条件下冻存，用Bradford法检测小鼠尿液中蛋白含量。

1.4.4 小鼠血液采集及血清分离

小鼠尾尖取血：小鼠于动物实验中心适应性喂养2周后，开始第1次尾部采血，之后采血频率1次/周，连续采集2个月。小鼠尾尖采血操作方法：固定小鼠，去尾尖毛，消毒，温水浸泡2 min，擦干，用手术剪快速割去小鼠尾尖约2 mm，采血约60 μL，采血结束后给小鼠尾尖伤口消毒并止血。血液置于4 ℃冰箱内2 h，用移液枪吸取上清液血清，采用放射免疫学方法检测两组小鼠血清抗ds-DNA抗体的浓度变化。

小鼠眼内眦静脉丛取血：骨髓充质干细胞移植后第8周时从小鼠眼内眦采血。眼内眦取血方法：乙醚麻醉后，用内径0.5 mm的硬质玻璃滴毛细管由小鼠眼内角刺入，收集适量血液约0.15 mL于EP管中，采用流式细胞仪检查CD4⁺CD25⁺T细胞水平。

1.4.5 肾脏组织切片、苏木精-伊红染色及免疫组化学检测细胞移植后10周，给小鼠以2 mL/kg腹腔注射水合氯醛处死，于超洁净实验操作台上解剖小鼠，摘取小鼠肾脏，置于无菌培养皿中，用磷酸盐缓冲液冲洗3次，体积分数为10%甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋，切片。一部分组织切片进行苏木精-伊红染色，另一部分组织切片进行免疫组化学染色，用于组织学分析。同时收集两组小鼠新鲜脾脏、胸腺组织，采用流式细胞仪检测CD4⁺CD25⁺T细胞水平。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞形态。②小鼠尿蛋白浓度，血清抗ds-DNA抗体水平。③小鼠肾脏组织病理学形态。④小鼠血液、脾脏和胸腺组织中CD4⁺CD25⁺T细胞水平。

1.6 统计学分析实验数据符合正态分布，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以x(_)±s表示，组间比较釆用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

间充质干细胞是近年来医学、生命科学等领域研究的热点之一，具有来源丰富，易于体外培养等优点，可分化为软骨细胞、成骨细胞、神经元样细胞、内皮细胞、脂肪细胞等^[6-11]。与其他间充质干细胞相比，骨髓中存在大量的间充质干细胞，细胞收获量大，易于体外培养^[12-15]，所以实验采用骨髓间充质干细胞作为移植种子细胞^[16-17]。第3代骨髓间充质干细胞完全贴壁，细胞呈梭形，生长迅速，细胞特征与文献相一致^[18-23]。

系统性红斑狼疮是一种临床表现多样，有多系统损害的慢性自身免疫性疾病，几乎每一个器官都可以受到累及。系统性红斑狼疮发病机制复杂，目前尚未完全清楚。与其他自身免疫性疾病类似，会引起体内形成大量循环免疫复合物，沉积在肾小球等组织的毛细血管，引起肾炎等全身多系统病变^[24-25]。MRL/LPR小鼠是类全身性红斑狼疮动物模型^[26]，其发生的病理变化与文献一致^[27]。

国内外研究发现，间充质干细胞可参与DC、NK、T、B等免疫细胞的调节^[28-31]，可推测出间充质干细胞对自身体液免疫调节发挥主要抑制作用^[32]。骨髓间充质干细胞移植后10周内，两组MRL/LPR小鼠尿液中尿蛋白均逐渐升高，对照组尿蛋白升高速率明显高于实验组，从第4周至第10周，实验组小鼠尿蛋白水平明显低于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。苏木精-伊红染色后显微镜下显示，注射生理盐水对照组小鼠肾脏组织被淋巴细胞浸润，出现少量的浆细胞，表现出间质性肾炎病理，而注射骨髓间充质干细胞的实验组小鼠无肾脏病理改变；免疫组化染色检测显示：对照组与实验组MRL/LPR小鼠的肾小球系膜区域均呈现出免疫复合物，对照组小鼠的组织免疫复合物片状分布，分布比较集中，移植骨髓间充质干细胞实验组小鼠的免疫复合物点状分布，相对所占面积比例明显低于注射生理盐水的对照组小鼠。

研究发现，CD4⁺CD25⁺T细胞可维持自身免疫耐受，防止自身免疫疾病的发生，在多种自身免疫性疾病的研究中都涉及该细胞免疫调节问题^[33-37]。尾静脉注射移植骨髓间充质干细胞8周后，实验组小鼠血液和胸腺内的CD4⁺CD25⁺T细胞水平明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；虽然实验组小鼠脾脏组织CD4⁺CD25⁺T细胞水平略高于对照组，但差异无显著性意义(P > 0.05)。采用放射免疫学方法检测实验组小鼠血清ds-DNA抗体浓度明显低于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。以上实验提示骨髓间充质干细胞移植可改善系统性红斑狼疮小鼠的病理损伤，对系统性红斑狼疮疾病具有一定的治疗效果。