神经干细胞移植治疗颅脑损伤后遗症：最佳时机选择

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.015

摘要/Abstract

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文题释义：

神经干细胞移植治疗颅脑损伤：颅脑损伤根本原因是神经元功能的丧失，而体内神经干细胞不足以产生充足的神经元修复替代缺失的神经元建立新的突触联系，只能由胶质细胞填充，导致中枢神经系统损伤功能难以恢复，此时补充外源性神经干细胞分化后产生的神经元和胶质细胞可以分泌多种神经营养因子，改善内环境，促使损伤或病变后残存的功能下降或处于休眠状态的受体细胞发挥功能，起到代偿作用，并启动再生相关基因的表达，促使受体神经纤维再生，补充缺失的神经元。

功能独立性评价量表：是目前国际上运用较多的一种功能评价量表，目前已证实它有较好的可信度，并能作为预测康复治疗效果的指标之一。目前在美国已建立了一个全国康复医学统一数据系统，这个系统汇总了美国主要康复医疗单位运用功能独立性评价量表评价康复治疗患者出院和随访的资料。该量表主要根据患者完成某一规定动作或项目所需要的帮助程度进行评分。这些项目包括6个方面：自我照顾能力、括约肌控制能力、转移能力、运动能力、语言交流能力及社会认知能力，得分越高，表明患者的功能独立性越好。

背景：神经干细胞移植为治疗颅脑损伤后遗症提供了重要思路，但是在治疗时机选择方面，尚无明确的定论。

目的：探讨神经干细胞移植治疗颅脑损伤后遗症的临床效果及其最佳治疗时机。

方法：选择178例颅脑损伤后遗症患者，均接受神经干细胞移植治疗，按照治疗时机分为损伤后6个月以内组(60例)、损伤后6-12个月组(59例)、损伤后12个月以上组(59例)，分别在损伤后6个月以内、损伤后6-12个月、损伤后12个月以上进行神经干细胞移植治疗。记录3组患者的临床症状改善情况和功能独立性评定量表评分。

结果与结论：①损伤后6个月以内组的治疗总有效率显著高于损伤后6-12个月组和损伤后12个月以上组，差异有显著性意义(P < 0.05)。②与移植前比较，3组患者的功能独立性评定量表评分显著提高(P < 0.05)；第4次移植后3个月，损伤后6个月以内组功能独立性评定量表评分显著高于其他两组。③神经干细胞移植治疗后，损伤后6个月以内组不良反应发生率显著低于其他两组(P < 0.05)。④结果表明不同时机移植神经干细胞均可以获得一定的效果，其损伤后6个月以内是临床最佳治疗时机。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-6818-274X (娄永利)

关键词: 干细胞, 移植, 颅脑损伤, 后遗症, 神经干细胞, 干细胞移植, 临床效果, 治疗时机

Abstract:

BACKGROUND: Neural stem cell transplantation provides an important way to treat sequela of traumatic brain injury, but the timing for treatment is inconclusive.

OBJECTIVE: To explore the clinical effect of neural stem cell transplantation in the treatment of sequela of traumatic brain injury and the choice of the best treatment time.

METHODS: Totally 178 patients with sequela of traumatic brain injury who underwent neural stem cell transplantation were divided into three groups as per the timing for neural stem cell transplantation: group A (with 6 months after injury, n=60), group B (6-12 months after injury, n=59), and group C (over 12 months after injury, n=59). Improvement in clinical symptoms and scores on function independent measure (FIM) were recorded and compared in the three groups.

RESULTS AND CONCLUSION: The total effective rate of group A was significantly higher than that in groups B and C (P < 0.05). FIM scores were significantly improved in the three groups after cell transplantation (P < 0.05). At 3 months after the fourth transplantation, the FIM score in the group A was significantly higher than that in the other two groups, and the incidence of adverse reactions in the group A was significantly lower than that in the other two groups (P < 0.05). These findings indicate that neural stem cell transplantation at different timing can all harvest certain clinical effects, but the best timing for neural stem cell transplantation is within 6 months after injury.

娄永利，陈萍，姜羽，张辉，闵有会. 神经干细胞移植治疗颅脑损伤后遗症：最佳时机选择[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(10): 1474-1480.

Lou Yong-li, Chen Ping, Jiang Yu, Zhang Hui, Min You-hui . Neural stem cell transplantation for sequela of traumatic brain injury: the best timing for treatment[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(10): 1474-1480.

图/表（结果） 5

2.1 胚胎神经干细胞形态培养2 d后可见细胞形成悬浮团块，倒置相差显微镜下可见细胞散在且胞体较小，呈圆形，折光性较好(图1A)。8-10 d后，细胞生长成为悬浮球形克隆，细胞数量达到数十个到数百个。经 Nestin蛋白免疫细胞化学鉴定，可以观察到胞浆被染成褐色神经球，Nestin呈阳性(图1B)。

2.2 患者随访情况分析 178例患者均完成12个月的随访，并进入最终的结果分析，随访率为100%。

2.3 各组患者基线资料比较经统计学分析，3组基线资料具有可比性(P > 0.05)，见表1。

2.4 各组患者治疗有效率分析损伤后6个月以内组的治疗总有效率显著高于损伤后6-12个月组和损伤后12个月以上组，差异有显著性意义(P < 0.05)；损伤后6-12个月组和损伤后12个月以上组之间经比较差异无显著性意义(P > 0.05，表2，图2)。

2.5 各组患者第1次移植前以及第4次移植后3个月FIM评分在第1次移植前以及第4次移植后3个月，分别对3组患者进行FIM评分。结果显示，与移植前比较，3组患者FIM评分显著提高(P < 0.05)；第4次移植后3个月对3组评分进行比较，损伤后6个月以内组评分显著高于损伤后6-12个月组和损伤后12个月以上组，差异有显著性意义(P < 0.05)；损伤后6-12个月组和损伤后12个月以上组之间经比较差异无显著性意义(P > 0.05，表3，图3)。

2.6 各组患者不良反应发生情况神经干细胞移植后，有6例出现恶心症状，未给予特殊处理，两三天后症状逐渐消失；9例患者出现头痛症状，给予平卧和镇静休息之后，症状得到有效缓解；19例患者出现发热现象，体温分布在37.5-38.6 ℃之间，并伴有轻度的鼻塞、流涕等症状，给予解热镇痛药治疗，体温明显下降，并于3 d内体温恢复至正常水平，各项症状消失。所有患者均未出现切口感染和颅内血肿以及切口不愈合、应激性消化道出血、重要脏器功能损害等严重不良反应。对3组患者的不良反应发生情况进行分析，损伤后6个月以内组不良反应发生率显著高低于损伤后6-12个月组和损伤后12个月以上组，差异有显著性意义(P < 0.05)；损伤后6-12个月组和损伤后12个月以上组之间经比较差异无显著性意义(P > 0.05，表4，图4)。

参考文献

[1] 寿纪新,马林,付旭东,等.不同时间移植神经干细胞治疗颅脑损伤的对比研究[J].中国实用神经疾病杂志,2010, 13(9):71-73.

[2] 王东,张建军,马景鑑,等.神经干细胞NgR基因沉默立体定向移植治疗大鼠脑损伤[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(14):2539-2544.

[3] 李红星,赵宗茂,金耀东,等.神经节苷脂联合神经干细胞移植对颅脑损伤大鼠海马的作用[J].中国组织工程研究, 2012, 16(10):1846-1850.

[4] 王春亮,刘瑞莲.干细胞移植与运动性颅脑损伤的修复[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(40):7560-7563.

[5] 王崇谦,丁鹏,牟临杰,等.颅脑损伤后内源性神经干细胞增殖与迁移中的基质细胞衍生因子1[J].中国组织工程研究, 2012,16(6):998-1002.

[6] 刘辉,杨树源,张建宁,等.神经干细胞移植对颅脑损伤大鼠脑皮层的神经保护作用[J].中国神经精神疾病杂志,2010, 36(6):335-338.

[7] Wan JF, Zhang SJ, Wang L, et al. Implications for preserving neural stem cells in whole brain radiotherapy and prophylactic cranial irradiation: a review of 2270 metastases in 488 patients. J Radiat Res. 2013;54(2):285-291.

[8] 黎国雄,王传湄,龚利平,等.神经干细胞立体定向脑内移植治疗大鼠重型颅脑损伤[J].中国临床神经外科杂志,2009, 14(5):288-290.

[9] 刘辉,杨树源,张建宁,等.神经干细胞移植对颅脑外伤神经组织的替代和修复作用[J].中华神经外科杂志,2002, 18(5): 282-285.

[10] 李晓红,陈翀,赵霞,等.亚低温对大鼠颅脑创伤后内源性神经干细胞增殖和分化的影响及其机制[J].中华创伤杂志,2014,30(6):500-503.

[11] Mondragon-Teran P, Baboo JZ, Mason C, et al. The full spectrum of physiological oxygen tensions and step-changes in oxygen tension affects the neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biotechnol Prog. 2011;27(6):1700-1708.

[12] 郑小敏,范薇,汪昕,等.神经干细胞移植技术在脑卒中和颅脑损伤治疗中的应用[J].中国组织工程研究与临床康复, 2007,11(15):2964-2967.

[13] 薛蓬,陈镇洲,刘钊,等.骨髓源性神经干细胞诱导分化及移植治疗颅脑损伤[J].中国组织工程研究与临床康复,2007, 11(7):1271-1273,1404.

[14] Menendez L, Yatskievych TA, Antin PB, et al. Wnt signaling and a Smad pathway blockade direct the differentiation of human pluripotent stem cells to multipotent neural crest cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(48):19240-19245.

[15] 杨小锋,虞军,刘伟国,等.脑源性神经营养因子和神经干细胞联合移植治疗大鼠重度颅脑损伤的研究[J].浙江医学,2005,27(1):1-3,14.

[16] 刘建新,王晓峰,张荣军,等.经枕大池移植神经干细胞治疗重型颅脑损伤大鼠的实验研究[J].临床神经外科杂志, 2012, 9(3):133-135.

[17] 崔勇,陈静,卢亦成,等.神经干细胞移植治疗创伤性颅脑损伤的研究进展[J].中国综合临床,2011,27(2):220-222.

[18] 罗江兵,赵鹏洲,欧英雄,等.神经干细胞在脑损伤模型中的迁移、成活和神经生长因子表达[J].中国微侵袭神经外科杂志,2012,17(5):232-234.

[19] 隋立森.大鼠颅脑损伤后神经干细胞原位诱导、增殖分化及Notch信号通路调控机制的实验研究[D].广州:南方医科大学,2008.

[20] 任维维,周志武.神经干细胞移植治疗颅脑损伤的研究进展[J].中外医学研究,2012,10(1):163-164.

[21] Ekici M, Hohl M, Schuit F, et al. Transcription of genes encoding synaptic vesicle proteins in human neural stem cells: chromatin accessibility, histone methylation pattern, and the essential role of rest. J Biol Chem. 2008;283(14):9257-9268.

[22] Ostrakhovitch EA, Byers JC, O'Neil KD, et al. Directed differentiation of embryonic P19 cells and neural stem cells into neural lineage on conducting PEDOT-PEG and ITO glass substrates.Arch Biochem Biophys. 2012; 528(1):21-31.

[23] 李红星,苑国富,金耀东,等.神经干细胞移植联用神经节苷脂对脑损伤大鼠神经学功能恢复的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(40):7505-7510.

[24] 刘辉.神经干细胞生物学特性、神经干细胞移植治疗颅脑损伤后神经功能缺失及免疫基因治疗大鼠胶质瘤的研究[D]. 天津:天津医科大学,2002.

[25] Bowman AN, van Amerongen R, Palmer TD, et al. Lineage tracing with Axin2 reveals distinct developmental and adult populations of Wnt/β-catenin- responsive neural stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(18):7324-7329.

[26] 黎国雄,王传湄,龚利平,等.神经干细胞立体定向脑内移植治疗大鼠重型颅脑损伤[J].中国临床神经外科杂志,2009, 14(5):288-290.

[27] 康建华,杨建平,贺小望,等.干细胞移植技术治疗重度颅脑损伤临床研究[J].江西医药,2012,47(12):1076-1078.

[28] 杨小峰,刘伟国,虞军,等.BDNF和神经干细胞移植联合治疗大鼠重度颅脑损伤的研究[C].首届中国中青年神经外科医师论坛论文汇编,2004:641-644.

[29] Scanga VI,Goraltchouk A,Nussaiba N,et al. Biomaterials for neural-tissue engineering- Chitosan supports the survival, migration, and differentiation of adult-derived neural stem and progenitor cells.J Canadian Chemistry. 2010, 88(3): 277-287.

[30] 张化明,杨海,马江红,等.神经干细胞移植并手术治疗重型颅脑损伤的疗效分析[J].中国实用神经疾病杂志,2013, 16(13):52-53.

[31] 张力,张辉,孙黎,等.神经干细胞在创伤性脑损伤灶周边的成活和迁移[J].中国组织工程研究与临床康复,2010, 14(36):6715-6719.

[32] 刘辉,杨树源,张建宁,等.神经干细胞移植对颅脑外伤神经组织的替代和修复作用[J].中华神经外科杂志,2002, 18(5): 282-285.

[33] 郑小敏,范薇,汪昕,等.神经干细胞移植技术在脑卒中和颅脑损伤治疗中的应用[J].中国组织工程研究与临床康复, 2007,11(15):2964-2967.

[34] 王崇谦,丁鹏,牟临杰,等.颅脑损伤后内源性神经干细胞增殖与迁移中的基质细胞衍生因子1[J].中国组织工程研究, 2012,16(6):998-1002.

[35] 黎国雄,王传湄,龚利平,等.神经干细胞立体定向脑内移植治疗大鼠重型颅脑损伤[J].中国临床神经外科杂志, 2009, 14(5):288-290.

[36] 王东,张建军,马景鑑,等.神经干细胞NgR基因沉默立体定向移植治疗大鼠脑损伤[J].中国组织工程研究与临床康复, 2010,14(14):2539-2544.

[37] 陈昱,付先明,牛朝诗,等.神经干细胞移植治疗缺血性脑卒中后遗症的实验研究[J].山东医药,2007,47(15): 3-5.

[38] Eriksson C, Björklund A, Wictorin K. Neuronal differentiation following transplantation of expanded mouse neurosphere cultures derived from different embryonic forebrain regions. Exp Neurol. 2003; 184(2):615-635.

[39] 刘辉,杨树源,张建宁,等.神经干细胞移植对颅脑损伤大鼠脑皮层的神经保护作用[J].中国神经精神疾病杂志, 2010,36(6):335-338.

[40] 李红星,赵宗茂,金耀东,等.神经节苷脂联合神经干细胞移植对颅脑损伤大鼠海马的作用[J].中国组织工程研究, 2012,16(10):1846-1850.

引言

材料方法

1.1 设计回顾性病例分析。

1.2 时间及地点于2014年6月至2015年8月在郑州大学附属郑州中心医院完成。

1.3 对象纳入颅脑损伤后遗症患者178例进行研究，男90例，女88例，年龄17-61岁，平均年龄(39.25±10.15)岁。患者均存在不同程度的肌肉无力、肌肉萎缩现象，55例合并有不同程度的构音障碍和吞咽困难、颈部活动困难等。

纳入标准：①具有确切颅脑外伤病史，经临床颅CT或MRI检查，存在各种颅内血肿和(或)脑挫裂伤现象。②属于非过敏体质，不会对神经干细胞悬液产生过敏现象。③一般情况良好，神志精神状态尚可，未合并严重心肾等疾病。④了解神经干细胞移植相关情况，对术中和术后可能会出现的不良反应等知情，并自愿签署手术同意书。

排除标准：①属于高度过敏体质者，或者存在严重过敏史者。②存在严重的出血、凝血功能障碍者。③处于妊娠期或哺乳期的女性。④存在全身性感染，或者存在头皮感染的患者。⑤受到患者心理状态或者精神因素以及其他原因的影响，无法配合检查和治疗者。

剔除标准：①不符合入选标准。②治疗依从性差，未按规定治疗或擅自服用可能影响疗效的药物。③出现严重不良反应。④患者自行退出试验。

入组患者均接受神经干细胞移植治疗，并按照治疗时机分为损伤后6个月以内组(60例)、损伤后6-12个月组(59例)、损伤后12个月以上组(59例)，分别在损伤后6个月以内、损伤后6-12个月、损伤后12个月以上进行神经干细胞移植治疗。对3组患者的年龄构成等基线资料进行统计学比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。试验相关内容和要点均经郑州大学附属郑州中心医院医学伦理委员会审核，治疗过程中的相关操作均严格遵守卫生部相关技术规定。

1.4 治疗方法

1.4.1 胚胎神经干细胞培养从郑州大学附属郑州中心医院标本室获得孕12-14周堕胎脑组织，孕妇健康状况良好，无传染性疾病和遗传性疾病，征得孕妇同意，自愿将流产胎儿交由医院进行科研。利用胰蛋白酶(上海普迈生物科技有限公司)对脑组织进行消化，DNAase液(杭州沃森生物技术有限公司)清洗3次，并进行机械吹打。接种在DMEM/F12培养基(上海源叶生物科技有限公司)中进行培养，接种浓度 2×5⁸ L^-¹，进行常规原代和传代培养。取传代24 h人胚胎神经干细胞，添加含有BrdU的DMEM/F12培养基进行培养，观察细胞状态，待大多数神经球均贴壁生长之后，利用BrdU抗体(上海国源生物技术有限公司)进行免疫组化检测，并制备细胞悬液。

1.4.2 移植前准备神经干细胞移植之前，做好相应的准备工作，指导患者完善各项检查，包括常规肝、肾功能和凝血情况检查以及经血传播性疾病检查。了解患者的精神和心理状态，如果患者出现过度紧张等情况，可酌情予以适当剂量镇静剂处理。对患者进行常规剃头备皮、禁食、禁水，对术区皮肤进行检查，确认无感染现象，并于术前0.5 h对患者应用抗生素予以预防感染。

1.4.3 神经干细胞移植在患者头部粘选取4个Mark 点标识，并实施头颅CT或MRI检查，计算机与立体定向仪(深圳市安科脑立体定向仪有限公司)连接成功后，将头颅CT或MRI影像传输入定向仪工作站。患者入手术室之后保持侧卧位，对患者头部予以妥善固定，立体定向仪机械臂定位针标记Mark点，使空间影像与CT或MRI影像相融合计算机工作站形成虚拟手术路径，确定手术靶点。对患者进行常规局部麻醉，根据标记位置，在患者头皮穿刺点切一长约5 mm切口，在颅骨处钻直径3 mm左右的小孔，在立体定向仪引导下将微电极置入靶点，达到靶点之后调整电阻，进行局部微毁损，退出微电极，改用2 mm带芯穿刺针注入5 mg地塞米松注射液，利用微量泵缓慢注入0.6 mL神经干细胞悬液。注射完毕退出穿刺针，检查伤口确认无明显出血之后予以缝合。每7 d移植1次，连续移植4次。移植后给予常规抗感染以及改善微循环治疗。

1.5 主要观察指标

1.5.1 疗效判定目前关于颅脑损伤后遗症无特效治疗方法，且缺乏明确、统一的疗效量化判定标准，主要以医师的临床查体情况为主要依据进行疗效判定。观察指标包括患者肌力和肌张力的改善情况，以及临床构音障碍、颈部活动、吞咽困难等改善情况，如果上述症状经观察均得到明显缓解，则视为有效。

1.5.2 功能独立性评定量表(functional independence measure，FIM)评分在第1次移植前以及第4次移植后3个月，分别对3组患者进行FIM评分。主要内容包括自我管理、排泄控制、行进、转移、交流、社会认知6个部分，一共18个小项，每项1-7分，总分126分。最终得分越高，表明患者的功能独立性越好。

1.5.3 不良反应发生情况在移植过程中和移植后对3组患者的不良反应发生情况进行记录，包括发热、头痛、恶心、切口感染和颅内血肿以及切口不愈合、应激性消化道出血、重要脏器功能损害等。

1.6 统计学分析治疗有效率和FIM评分、移植后不良反应发生率等实验数据均利用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料两两比较均予以t 检验，计数资料两两比较均予以χ²检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着社会的快速发展，各种交通事故的发生率也呈现出不断上升趋势，导致颅脑损伤发生率不断提高^[8]。颅脑损伤容易产生各种后遗症，严重影响到患者的日常生活。临床采用常规神经营养治疗、高压氧治疗以及康复锻炼等方式治疗颅脑损伤后遗症^[9-12]，虽然可以从一定程度上改善患者的神经功能，但往往无法获得理想的效果。分析出现这一结果的原因，是因为哺乳动物的中枢神经系统损伤之后无法再生^[13]。

神经干细胞相关理论及技术的发展，为颅脑损伤后遗症治疗提供了新的思路。神经干细胞移植后在患者体内分化成新的神经元，它们通过突触相互联接，形成新的神经环路，有效改善神经功能，提高其生活质量^[14-22]。通过立体定向技术，将神经干细胞准确的注射至病灶及其周边神经组织中^[23-25]。该技术具有定位准、手术创伤小、操作时间短等优点，可用于治疗脑出血后遗症、脑损伤后遗症、小儿脑瘫、局灶性脑梗死、帕金森病、阿尔茨海默病等。黎国雄等^[26]在体外环境下对胚胎神经干细胞进行培养，利用立体定向移植方式将神经干细胞悬液注射至脑损伤大鼠病灶内，可以显著改善脑损伤。研究学者还发现，大鼠脑组织切片中神经元数量显著增加，经BrdU免疫组化检测观察到移植的神经干细胞在大鼠颅内损伤区发生了存活和分化、迁移。

利用神经干细胞移植治疗颅脑损伤后遗症时，选择恰当的治疗时机至关重要^[27]。在颅脑损伤超早期阶段，患者的脑组织出现坏死或者变性水肿等，相应的微环境不利于神经干细胞的定居和生存，也不利于其修复作用的发挥^[28-30]。神经干细胞移植后能分泌神经营养因子以及局部病灶微环境等因素的影响，可以发生定向迁移^[31-32]。随着时间的不断推移，相应因子的分泌量逐步下降，移植细胞所发挥的替代和修复作用也会不断下降^[33-35]。为此，应选择合适的治疗时机，以保证移植神经干细胞的存活和修复作用的发挥^[36]。试验对入组患者分别在损伤后6个月以内、损伤后6-12个月、损伤后12个月以上进行神经干细胞移植治疗。经疗效判定发现，损伤后6个月以内组的治疗总有效率显著高于其他两组，损伤后6-12个月组和损伤后12个月以上组之间经比较差异无显著性意义。经FIM评分发现3组FIM评分均显著提高，且第4次移植后3个月，损伤后6个月以内组评分显著高于其他两组，损伤后6-12个月组和损伤后12个月以上组之间经比较差异无显著性意义。试验结果提示，不同时机移植神经干细胞均可以获得一定的效果，其中损伤后6个月以内是临床最佳治疗时机，移植治疗的效果明显优于损伤后6-12个月、损伤后12个月。陈昱等^[37]建立大鼠缺血性脑卒中后遗症模型，并通过立体定向移植方式，在不同时间(超早期、早期、晚期)注射神经干细胞，移植后8周，接受超早期以及晚期移植大鼠的神经损伤严重程度均显著高于早期移植治疗。由此认为，缺血性脑卒中后遗症早期移植治疗可以获得最佳的治疗效果，超早期或者晚期均不属于理想的治疗时机。Eriksson等^[38]也认为，脑组织损伤的超早期不适合进行神经干细胞移植，因为在这一阶段，受到低氧等因素的影响，脑内的微环境无法为神经干细胞的存活提供良好的条件。在颅脑损伤超早期，局部会出现组织缺血、缺氧等内环境失衡，并存在炎性反应以及氧化应激损伤等，不利于神经干细胞的存活^[39]。因此，在颅脑损伤后数月进行移植治疗，脑组织的内环境已经趋于稳定，干细胞移植后更容易存活，可以获得更好的治疗效果^[40]。