热休克处理骨髓Sca-1+细胞移植治疗小鼠心肌梗死

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来的研究发现，干细胞可以直接定向分化为成熟心肌细胞或促进其再生，为心肌梗死治疗提供一种全新的治疗策略，但是细胞移植率低使其向心肌细胞分化和执行心肌修复能力下降。
目的：探讨热休克Sca-1+细胞在小鼠心肌梗死治疗中的作用。
方法：磁珠分选骨髓中Sca-1+细胞，对Sca-1+细胞进行热休克处理3 h。建立心肌梗死小鼠动物模型，将其随机分为2组，分别经尾静脉注入1 mL热休克Sca-1+细胞悬液、1 mL非热休克Sca-1+细胞悬液。移植后检测细胞存活率、小鼠心脏功能恢复情况、心肌细胞凋亡数目、心肌纤维化程度以及左心室HSF、HSP70及miR-34a表达。
结果与结论：①热休克Sca-1+细胞移植组小鼠心脏sry基因表达显著高于非热休克Sca-1+细胞移植组。②热休克Sca-1+细胞移植组小鼠射血分数及左心室短轴缩短率显著高于非热休克Sca-1+细胞移植组，左心室的舒张末期内径以及收缩末期内径显著低于非热休克Sca-1+细胞移植组。③热休克Sca-1+细胞移植组小鼠的心脏纤维化程度及心肌细胞凋亡均显著低于非热休克Sca-1+细胞移植组。④热休克Sca-1+细胞移植组小鼠左心室HSF和HSP70表达明显高于非热休克Sca-1+细胞移植组，miR-34a表达明显低于非热休克Sca-1+细胞移植组。结果表明热休克Sca-1+细胞移植能够减少心肌细胞凋亡和心肌梗死面积，改善心脏功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 热休克, Sca-1+细胞, 小鼠, 心肌梗死

Abstract:

BACKGROUND: Recent studies have found that stem cells can directly differentiate into mature myocardial cells or promote their regeneration, providing a new therapeutic strategy for the treatment of myocardial infarction. However, the low cell transplantation rate reduces the myocardial differentiation ability and myocardial repair.
OBJECTIVE: To study the role of heat shock treatment in Sca-1+ cell transplantation for treatment of myocardial infarction in mice.
METHODS: Sca-1+ cells were isolated from the bone marrow of mice using magnetic bead sorting method, and were subjected to heat shock treatment. Animal models of myocardial infarction were made in mice, and then randomized into two groups: heat shock group and non-heat shock group, which were given 1 mL heat shock-treated Sca-1+ cells and 1 mL non-heat shock-treated Sca-1+ cells via the tail vein, respectively. After
transplantation, cell survival, heart function, myocardial cell apoptosis and myocardial fibrosis were detected. Meanwhile, the expressions of heat shock factor (HSP), HSP70 and miR-34a in the left ventricle were measured.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The expression of sry gene in the heat shock group was significantly higher than that in the non-heat shock group. (2) The left ventricular ejection fraction and fractional shortening in the heat shock group were significantly higher than those in the non-heat shock group. The left ventricular end-diastolic diameter and systolic diameter in the heat shock group were significantly lower than those in the non-heat shock group. (3) The cardiac fibrosis and myocardial cell apoptosis in the heat shock group were significantly lower than those in the non-heat shock group. (4) The HSF and HSP70 expression in the left ventricle was significantly higher in the heat shock group than the non-heat shock group, and the miR-34a expression in the left ventricle was significantly lower in the heat shock group than the non-heat shock group. These findings indicate that heat shock-treated Sca-1+ cell transplantation can reduce myocardial apoptosis and infarct size, and improve heart function of mice with myocardial infarction.

中图分类号:

R394.2

王丽辉，申亚晖，郭艳青，臧宾宾，李为. 热休克处理骨髓Sca-1+细胞移植治疗小鼠心肌梗死[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(50): 8149-8154.

Wang Li-hui, Shen Ya-hui, Guo Yan-qing, Zang Bin-bin, Li Wei . Heat shock improves Sca-1+ cell transplantation for treatment of myocardial infarction in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(50): 8149-8154.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析纳入小鼠22只，造模过程中死亡2只(死于心室颤动)，进入结果分析20只。实验流程见图1。

2.2 Sca-1+细胞形态 Sca-1+细胞为纺锤形的成纤维细胞样细胞，部分呈宽大扁平的多边形。
2.3 两组小鼠移植后心肌梗死区sry基因的表达在细胞移植4周，热休克Sca-1+细胞移植组小鼠心脏sry基因表达显著高于非热休克Sca-1+细胞移植组(2.58±0.12，0.97±0.06，P < 0.05)，表明热休克Sca-1+细胞在小鼠心肌梗死区的存活率高于非热休克Sca-1+细胞在小鼠梗死区的存活率。
2.4 两组小鼠移植后心功能变化细胞移植后4周，热休克Sca-1+细胞移植组小鼠的射血分数及左心室短轴缩短率显著高于非热休克Sca-1+细胞移植组(P < 0.05)；热休克Sca-1+细胞移植组小鼠的左心室舒张末期内径以及收缩末期内径均显著减少(P < 0.05)，表明热休克Sca-1+细胞移植能够明显改善心肌梗死小鼠的心脏功能(表1)。

2.5 两组小鼠移植后心脏纤维化程度移植后4周，热休克Sca-1+细胞移植组小鼠的心脏纤维化程度显著低于非热休克Sca-1+细胞移植组[心肌纤维化面积分别为(5.10±0.21)%，(11.30±1.19)%，P < 0.05]，见图2。

2.6 两组小鼠移植后心肌细胞的凋亡情况在移植后4周，热休克Sca-1+细胞移植组小鼠的心肌细胞凋亡明显低于非热休克Sca-1+细胞移植组[(212.3±9.8)个/mm2，(343.5±13.6)个/mm2，P < 0.05]。
2.7 两组小鼠移植后左心室HSF、HSP70及miR-34a表达移植后4周时，通过Western blot检测发现：热休克Sca-1+细胞移植组小鼠左心室HSF和HSP70表达明显高于非热休克Sca-1+细胞移植组(P < 0.05)；通过Q-PCR检测发现：热休克Sca-1+细胞移植组小鼠左心室miR-34a表达明显低于非热休克Sca-1+细胞移植组(P < 0.05)，见表2。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2013年7月至2014年12月在郑州大学第一附属医院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物实验选用体质量18-22 g、雄性小鼠23只，其中1只用于分离和培养Sca-1+细胞，另外22只用于细胞移植，均购买于河南省实验动物中心。
1.3.2 试剂胎牛血清、DMEM培养基(美国GIBCO公司)，抗 Hsp70抗体、抗 HSF抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，rabbit anti -Ⅷ Factor(北京博奥森)，0.25% Trpysin-EDTA、DAPI (美国Sigma公司)，miR-34a mimic(美国Dharmacon公司)，mouse anti-rat connexin43 (Millipore)，D-Hank’s(吉诺生物公司)，RNA提取试剂盒(美国Ambion公司)，山羊抗兔 CY-3 (美国Santa Cruz公司)，青霉素、链霉素(沈阳东药集团公司)，人淋巴细胞分离液(天津TBD公司)，rabbit anti-rat Troponin-T(Neomarkers)等。
1.3.3 仪器 SCV-4A1超净工作台(Esco公司)，电子天平(瑞典Mettler公司)，PCR电泳仪(大连捷迈科贸有限公司)，培养板、培养瓶(Corning)，PCR仪(美国Eppendorf公司)，移液枪头(上海生物工程公司)，酶标仪(奥地利Biocell公司)，倒置显微镜(日本 Nikon 公司)，小动物呼吸机(成都泰盟科技)，Leica DM IRBE 倒置荧光显微镜(德国 Leica公司)，Gel DoclOOO型凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)，pH 计(瑞典Mettler公司)，恒冷箱切片机(英国 SHANDON公司)，流式细胞仪(美国 BD 公司)，超低温冰箱(日本SANYO公司)，恒温CO2培养箱(德国WTB Binder公司)，低温摇床(美国Kelvinator公司)，恒温仪(上海实验仪器厂)，PCLAB-VE 生物医学信号采集系统(北京微信斯达科技)，80-2型离心机(江苏金坛市医疗仪器厂)等。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞分离小心吸出1只6-8周雄性小鼠骨髓，转移到75 cm2培养瓶中，加入DMEM培养基，放入恒温培养箱中培养，4 d后进行第1次换液，留取贴壁细胞，以后每隔 3 d进行1次换液，待细胞生长至80%以上时进行消化，按 1︰8的比例进行传代。培养后进行磁珠分选Sca-1+细胞株，流式细胞术确认分离得到的Sca-1+细胞具有较高纯度(99.4%)。
1.4.2 传代培养细胞生长达到完全融合时进行分瓶，用Trypsin-EDTA冲洗75 cm2培养瓶，孵化2 min，显微镜下观察细胞是否已从瓶壁上分离，如果仍有贴壁，则轻敲培养瓶使其分离下来，用DMEM终止消化，细胞转入离心管进行离心，吸去上清液，加入培养基吹打成单细胞悬液，将1 mL细胞悬液加入到准备好的75 cm2培养瓶中，使每瓶体积为15 mL。
1.4.3 冷冻保存在培养瓶中加入预热的Trypsin-EDTA液，孵化，加入DMEM终止消化，离心去上清，将沉淀置入冷存培养基中，将细胞移至冷冻管，再放入冷冻罐，置入-80 ℃冰箱。
1.4.4 复苏细胞在冰箱冷冻6-12 h后移到液氮罐，从液氮罐中取出复苏细胞，水浴中解冻，解冻后移入含有预热培养基的离心管中，离心去上清，沉淀物移入培养基中培养。
1.4.5 热休克将Sea-1+细胞接种到培养皿中培养24 h，然后把培养皿放入42 ℃烤箱进行热休克处理3 h。
1.4.6 心肌梗死模型建立小鼠固定手术台上，全身麻醉成功后，备皮消毒、剪开皮肤、分离组织肌肉和气管，进行气管插管，呼吸机通气。剪开胸部皮肤、肌肉，暴露胸膜，分离暴露心脏，剪开心包，距左心耳缘1 mm处结扎左前降支。造模过程中死亡2只，将剩余20只小鼠随机分为热休克Sca-1+细胞移植组和非热休克Sca-1+细胞移植组，每组10只。
1.4.7 细胞移植在建立小鼠心肌梗死模型后7 d进行细胞移植，麻醉小鼠后固定在手术台上，热休克Sca-1+细胞移植组小鼠经尾静脉注入1 mL含热休克Sca-1+细胞悬液(3×106个细胞)；非热休克Sca-1+细胞移植组小鼠经尾静脉注入1 mL含非热休克Sca-1+细胞悬液(3×106个细胞)。细胞移植后正常饲养，观察每天进食及活动情况。
1.4.8 超声心动图监测细胞移植成功后7，14，21，28 d分别对两组小鼠进行超声心动图监测，并记录测量数据。
1.4.9 左心室纤维化测定细胞移植后4周，小鼠心脏经甲醛固定，石蜡包埋，从左心室结扎处开始进行切片，进行Masson’s Trichrome染色，在显微镜下随机选取5个视野，采用全自动图像分析系统测量左心室面积及左心室纤维化面积。心肌梗死面积根据左心室纤维化面积占整个左心室面积的百分比计算。
1.4.10 Q-PCR检测sry、miR-34a基因表达细胞移植后4周，SYBR-Green Ⅰ染料与双链 DNA 结合发出荧光信号。应用 7300 Real-time PCR System来检测荧光信号。引物(10 μmol/L)分别为 5’-CAT CGA AGG GTT AAA GTG CCA-3’和5’-ATA GTG TGT AGG TTG TTG TCC-3’。miR-34a mimics正义链序列为5’-UGA GAU GAA GCA CUG UAG C-UC-3’，互补链序列为5’-UUA CUC UAC UUC GUG A-CAU CG-3’。每个待检样品中包含有10 μL的目标DNA、每条引物各 1 μL、12.5 μL的 Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司提供) 和0.5 μL DEPC水。循环条件是95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min。样品扩增后，用获得的熔解曲线来判定特异性产物及非特异性产物。
1.4.11 采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡细胞移植后4周，取梗死边缘区的心肌组织进行石蜡切片，采用TUNEL法检测凋亡的心肌细胞，染色阳性的凋亡细胞核呈棕褐色。每个样本随机取6个视野，统计凋亡心肌细胞数，心肌细胞凋亡指数以阳性细胞数占细胞总数的百分比表示。
1.4.12 Western blot检测HSF、HSP70蛋白表达细胞移植后4周，将凝胶上的蛋白转移到NC膜上，用含5%脱脂牛奶PBS 4 ℃过夜封闭，以1∶500稀释的抗HSP70抗体、抗HSF抗体为一抗，以1∶1 000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG为二抗，进行Western blot，用 ECL曝光显色，并在凝胶成相仪上观察结果。
1.5 主要观察指标细胞存活率、小鼠心脏功能恢复情况、心肌细胞凋亡数目、心肌纤维化程度以及左心室HSF、HSP70及miR-34a表达。
1.6 统计学分析所有数据输入SPSS 18.0软件进行处理，计量资料用x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

心肌梗死的发生机制为冠状动脉在机体缺氧的情况下发生痉挛，冠状动脉粥样硬化导致冠状动脉狭窄，冠状动脉粥样斑块破裂阻塞冠状动脉血流，从而由此引起的心肌缺血缺氧性坏死。心肌梗死的主要治疗方法有药物治疗、介入治疗、旁路移植治疗、溶栓治疗以及干细胞移植治疗等。骨髓间充质干细胞移植不仅可以代替坏死心肌，还可以促进血管新生，为临床治疗心肌梗死提供了新的思路和方法^[1]。
干细胞治疗技术是近年来迅速发展的治疗方法，骨髓间充质干细胞属于非造血干细胞，可以分化为心肌、神经、骨、脂肪等细胞^[2]，由于骨髓干细胞取材简单方便，来源丰富，免疫反应低，无伦理问题等优点，是目前治疗心肌梗死的理想干细胞来源。骨髓干细胞不同于造血干细胞，骨髓干细胞可以表达CD44、CD90、CD105、CD120a等特征性表面标记^[3-5]，具有自我更新和分化潜能，并能够归巢到梗死区^[6-8]。骨髓干细胞治疗心肌梗死是继药物治疗、介入治疗和外科治疗之后的新的治疗方法，移植的方式有经静脉、经冠状动脉、经心肌注射等，经静脉注射操作简单，但需要移植细胞数多，有发生细胞在血管内引起栓塞等缺点^[9]；经心肌注射骨髓干细胞短期内可以改善心脏功能^[10]，细胞薄膜技术作为新的注射技术在动物实验中取得良好效果^[11-12]，在临床中将有良好的应用前景。骨髓干细胞移植治疗心肌梗死的时机目前尚无统一标准，大多认为在心肌梗死后2周左右进行移植效果较好^[13-14]。虽然骨髓干细胞移植治疗发展迅速，但治疗效果并不十分显著，移植细胞的存活严重受到心肌梗死区缺血缺氧状态，因此如何增加骨髓干细胞移植后对缺血缺氧的耐受能力成为大家研究的目标。低氧预处理、药物联合干细胞移植、细胞因子联合干细胞移植以及基因转染等方法被认为可以增加干细胞移植后对缺血缺氧的耐受能力，能够提高其在体内的存活率。低氧预处理可以增加细胞蛋白激酶B、bcl-2的表达，并对抗活性氧对细胞的伤害，从而提高移植细胞的存活率。阿托伐他汀联合骨髓干细胞治疗对心肌梗死有协同作用，能够减少炎症反应，抑制心脏重构和纤维化，促进细胞分化，减少细胞凋亡^[15]，褪黑素联合骨髓干细胞治疗可能降低活性氧生成，发挥对心脏的保护作用^[16]，缺氧诱导因子DMOG对骨髓干细胞进行预处理也能够明显提高移植细胞的存活率，改善心脏功能^[17]。细胞因子如肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子和血管内皮细胞生长因子等联合骨髓干细胞移植治疗心肌梗死能够增加移植细胞的黏附和增殖能力，增加梗死区心肌细胞数量，增加梗死区血管密度，改善心肌功能^[18-19]。抗凋亡基因bcl-2和Akt转染的骨髓干细胞移植治疗心肌梗死能够减少细胞凋亡，改善心脏功能[20]，成纤维生长因子转染骨髓干细胞移植治疗心肌梗死能够减少心肌纤维化，增加血管再生，改善心脏功能^[21]，MicroRNA-23a在心肌梗死区骨髓干细胞的过表达能够减少细胞凋亡，减少梗死面积^[22]。
miRNA是近来发现的非编码RNA分子，通过抑制编码蛋白质调控基因的表达^[23]，在细胞核中经复合酶的处理形成前体RNA，前体RNA由细胞核转至细胞质^[24]，在细胞质中被剪切成双链RNA发挥作用。目前分子遗传水平的生物标记物仍在研究中，miRNA作为新的生物标记物被广泛应用^[25-27]。miRNA与急性心肌梗死有密切相关性，心肌梗死后miRNA-1、miRNA-133、miRNA-208的表达均显著升高^[28]，miR-663b和miR-1291预测心肌梗死的准确率比较高^[29]，增加心肌梗死患者miRNA-21的表达量能够减少心肌梗死面积^[30]，心肌梗死死亡患者血清中的miR-155和miR-380水平增加[31]。miRNA在心肌梗死基因层面的研究为心肌梗死患者的治疗带来了新的希望。
实验通过分离和培养骨髓Sca-1+细胞，并进行热休克处理，将热休克Sca-1+细胞和非热休克Sca-1+细胞分别移植到心肌梗死小鼠模型体内，观察发现：热休克Sca-1+细胞移植组小鼠心脏sry基因表达显著高于非热休克Sca-1+细胞移植组；热休克Sca-1+细胞移植组小鼠的射血分数及左心室短轴缩短率显著高于非热休克Sca-1+细胞移植组、而左心室的舒张末期内径以及收缩末期内径均较非热休克Sca-1+细胞移植组显著减少；热休克Sca-1+细胞移植组小鼠的心脏纤维化程度及心肌细胞凋亡均显著低于非热休克Sca-1+细胞移植组；热休克Sca-1+细胞移植组小鼠左心室HSF和HSP70表达明显高于非热休克Sca-1+细胞移植组；热休克Sca-1+细胞移植组小鼠左心室miR-34a表达明显低于非热休克Sca-1+细胞移植组。由此可见，热休克Sca-1+细胞移植后的存活率高，热休克Sca-1+细胞移植能够明显改善心肌梗死小鼠心脏功能，减少心肌纤维化程度和细胞凋亡，其机制可能为热休克Sca-1+细胞移植后HSF和HSP70表达上调，miR-34a表达下调，从而抑制细胞凋亡，减少心肌纤维化程度，改善心肌功能。HSF和HSP70表达上调、miR-34a表达下调抑制细胞凋亡的机制有待进一步研究明确。
综上所述，热休克Sca-1+细胞移植治疗心肌梗死小鼠能够减少心肌细胞凋亡，减少心肌梗死面积，改善心脏功能。