白细胞介素1受体相关激酶4活性在皮瓣缺血再灌注损伤中的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.017

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (36): 5836-5841.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.017

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白细胞介素1受体相关激酶4活性在皮瓣缺血再灌注损伤中的作用

郑梁¹，吴小蔚¹，宋海臣¹，简麒超²，刘迎迎¹，赵相宜¹，张黎明¹

1武汉大学人民医院整形外科，湖北省武汉市 430060
2黄石市第一人民医院皮肤外科，湖北省黄石市 435000

修回日期:2014-07-25 出版日期:2014-08-30 发布日期:2014-08-30
通讯作者: 吴小蔚，主任医师，硕士生导师，武汉大学人民医院整形外科，湖北省武汉市 430060
作者简介:郑梁，男，1988年生，湖北省十堰市人，汉族，武汉大学在读硕士，主要从事移植皮瓣保护及机制的研究。
基金资助:
湖北省自然科学基金项目(2011CDB501)

Role of interleukin-1 receptor-associated kinase 4 activity in flap ischemia-reperfusion injury

Zheng Liang¹, Wu Xiao-wei¹, Song Hai-chen¹, Jian Qi-chao², Liu Ying-ying¹, Zhao Xiang-yi¹, Zhang Li-ming¹

1Department of Plastic Surgery, Renmin Hospital, Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China
2Department of Dermatologic Surgery, Huangshi Municipal First People’s Hospital, Huangshi 435000, Hubei Province, China

Revised:2014-07-25 Online:2014-08-30 Published:2014-08-30
Contact: Wu Xiao-wei, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Plastic Surgery, Renmin Hospital, Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China
About author:Zheng Liang, Studying for master’s degree, Department of Plastic Surgery, Renmin Hospital, Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Hubei Province, No. 2011CDB501

摘要/Abstract

摘要：

背景：白细胞介素1受体相关激酶4活性引发炎症及感染的作用已得到广泛认可，但其对皮瓣缺血再灌注损伤是否有影响尚无文献报道。
目的：探讨白细胞介素1受体相关激酶4活性在皮瓣缺血再灌注损伤中的意义。
方法：将36只雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、缺血再灌注损伤组、白细胞介素1受体相关激酶4抑制剂组，每组12只。制备右下腹岛状皮瓣缺血再灌注损伤模型，白细胞介素1受体相关激酶4抑制剂处理组于再灌注前腹腔注射1 mL白细胞介素1受体相关激酶1/4 抑制剂(100 μmol/L)，分别采集缺血再灌注后1，2，4，6 h的皮瓣行组织病理学观察，取缺血再灌注后1 h的皮瓣组织行白细胞介素1受体相关激酶4的蛋白表达量，并于术后7 d计算皮瓣存活比例。
结果与结论：组织病理学观察显示，与缺血再灌注损伤组相比，白细胞介素1受体相关激酶4抑制剂组中性粒细胞浸润及组织水肿程度明显改善，白细胞介素1受体相关激酶4的蛋白表达量逐渐降低。术后7 d缺血再灌注损伤组皮瓣存活比例为(51.70±7.62)%，白细胞介素1受体相关激酶4抑制剂组皮瓣存活比例高达(86.56±12.23)%，两组比较差异有显著性意义(P < 0.01)。提示大鼠皮瓣缺血再灌注损伤后，可以通过抑制白细胞介素1受体相关激酶4活化提高移植皮瓣的成活率。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 白细胞介素1受体相关激酶4, 皮瓣组织, 缺血再灌注损伤, 湖北省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Interleukin-1 receptor-associated kinase 4 activity-induced inflammations and infection have been extensively accepted. However, there was no report concerning its effects on flap ischemia-reperfusion injury.
OBJECTIVE: To explore the significance of interleukin-1 receptor-associated kinase 4 activity in flap ischemia-reperfusion injury.
METHODS: A total of 36 adult male Sprague-Dawley rats were randomized into sham-operated group (n=12), ischemia-reperfusion group (n=12) and interleukin-1 receptor-associated kinase 4 group (n=12). The models of right lower abdominal island flap ischemia-reperfusion injury were set up. Interleukin-1 receptor-associated kinase 4 group was intraperitoneally injected with 1 mL of interleukin-1 receptor-associated kinase 4 (100 μmol/L) before reperfusion. The flaps were collected at 1, 2, 4, and 6 hours after ischemia-reperfusion injury for histopathhological observation. At 1 hour after ischemia-reperfusion, protein expression of interleukin-1 receptor-associated kinase 4 was detected in flaps. The proportion of flap survival was calculated at 7 days after surgery.
RESULTS AND CONCLUSION: Histopathological observation demonstrated that compared with the ischemia-reperfusion injury group, neutrophil infiltration and edema was evidently improved, and the protein expression of interleukin-1 receptor-associated kinase 4 was gradually reduced in the interleukin-1 receptor-associated kinase 4 group. Flap survival proportions were respectively (51.70 ±7.62)% and (86.56±12.23)% in the ischemia-reperfusion injury group and interleukin-1 receptor-associated kinase 4 group at 7 days after surgery. There were significant differences in the flap survival proportion between the two groups (P < 0.01). These results showed that after flap ischemia-reperfusion injury, the inhibition of interleukin-1 receptor-associated kinase 4 activities could elevate the survival rate of transplanted flap.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: interleukin-1 receptor-associated kinases, surgical flaps, reperfusion injury, models, animal

中图分类号:

R318

郑梁，吴小蔚，宋海臣，简麒超，刘迎迎，赵相宜，张黎明. 白细胞介素1受体相关激酶4活性在皮瓣缺血再灌注损伤中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(36): 5836-5841.

Zheng Liang1, Wu Xiao-wei, Song Hai-chen, Jian Qi-chao, Liu Ying-ying, Zhao Xiang-yi, Zhang Li-ming . Role of interleukin-1 receptor-associated kinase 4 activity in flap ischemia-reperfusion injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(36): 5836-5841.

图/表（结果） 2

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引言

近些年，随着显微外科的发展，移植皮瓣修复软组织缺损在外科手术中得到了广泛的应用^[1-5]。目前普遍认为，缺血再灌注损伤为导致移植皮瓣部分或全部坏死的重要原因之一，因此减轻缺血再灌注损伤可提高皮瓣移植成活率。关于缺血再灌注损伤的确切发生机制目前尚不完全清楚，多认为是多细胞参与、多种递质共同发挥作用的复杂病理生理过程^[6]。已有资料表明，活性氧代谢产物增多、钙超载、微循环障碍、血液流变性改变和凝血酶的激活等是导致该损伤的主要机制^[7-9]。氧自由基是介导缺血再灌注损伤的重要因素之一^[10]，对细胞的任何成分均能造成损伤，主要攻击细胞膜性结构，引起膜脂质过氧化，形成脂质过氧化物及其降解产物。因此其降解产物水平直接反映了脂质过氧化程度并间接反映自由基水平，是组织细胞损伤的重要标志，而其水平增加取决于再灌注损伤的严重程度^[11]。同时缺血再灌注损伤也使依赖于正常细胞结构存在的自由基清除剂失活或者变性，依赖于膜结构的各类离子通道反常或逆转，以致细胞内外离子水平的反常，最终导致细胞结构和功能破坏。缺血再灌注损伤的治疗措施有很多种，如缺血预处理、再灌注后适应、药物预适应、高压氧预适应及低浓度氧预适应治疗等^[12]。

目前作者的研究已证实Toll样受体4信号通路在皮瓣缺血再灌注损伤中具有关键的调控作用^[13]，但研究仅局限于Toll样受体4本身而对做为Toll样受体4信号转导通路中关键的因子白细胞介素1受体相关激酶4在皮瓣缺血再灌注损伤中是否发挥作用，目前尚未见文献报道。最近发现的一种新的白细胞介素1受体相关激酶4不仅可促使白细胞介素1受体相关激酶1磷酸化，还是白细胞介素1受体相关激酶1募集于Toll样受体/白细胞介素1受体复合物的必要条件，从而成为调控白细胞介素1受体相关激酶1生物活性以及内毒素胞内信号转导的最关键分子^[14]。充分认识白细胞介素1受体相关激酶4的作用机制，将有助于设计出新的针对炎症反应的应对策略保障缺血再灌注后移植皮瓣的成活率。现国内外都已有文献报道白细胞介素1受体相关激酶4在脑组织、肝脏及心脏等脏器缺血再灌注后对其的影响，如大鼠额顶叶皮质组织白细胞介素1受体相关激酶4在脑缺血性损伤早期表达迅速上调，可能参与了脑缺血后炎性反应的调控，早期抑制其功能可以发挥显著脑保护作用等^[15]。但在皮瓣组织中的作用尚未见报道，文章通过应用白细胞介素1受体相关激酶4抑制剂观测大鼠皮瓣缺血再灌注损伤后皮瓣组织的病理学改变，研究白细胞介素1受体相关激酶4活性在大鼠皮瓣缺血再灌注损伤中的作用及意义。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2013年6至12月在武汉大学动物实验中心完成。

材料：

实验动物：无特定病原体SPF级雄性SD大鼠36只，购自武汉大学动物实验中心，12周龄，体质量(250±20) g，在无特定病原体三级条件下，由武汉大学动物饲养中心代为饲养，每笼饲养6只，恒温(25±2) ℃，恒湿(50±5)%，给予明、暗各12 h人工光照，自由摄入经过严格消毒灭菌的饲料及水。大鼠在动物饲养中心进行适应性饲养1周后，再行下一步实验。实验过程中对动物处理符合动物伦理学标准。

实验方法：

右下腹岛状皮瓣缺血再灌注损伤大鼠模型制备：将所有大鼠进行编号，将36只成年健康雄性SD大鼠按随机数字表法分成3组：缺血再灌注损伤组、白细胞介素1受体相关激酶4抑制剂组及假手术组，每组12只。白细胞介素1受体相关激酶4抑制剂组和缺血再灌注损伤组又分为术后1，2，4，6 h 4组，于相应时间点取组织标本。手术前用备皮刀剔除腹壁脱毛，备皮范围5 cm×8 cm。术前夜禁食，自由饮水，术前1 h分别腹腔注入干预剂：10 mL/kg生理盐水(假手术组和缺血再灌注损伤组)；1 mL白细胞介素1受体相关激酶1/4抑制剂(100 μmol/L)(白细胞介素1受体相关激酶4抑制剂组)。1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，术中每隔1 h注射20 mg/kg维持麻醉状态。麻醉成功后仰卧位固定，参照Cetinkale等^[16]的方法制作以右侧腹壁浅血管为蒂的岛状皮瓣，大小4 cm×5 cm。用2V无创伤显微血管夹阻断血管蒂。显微镜下，观察腹壁浅静脉无血液回流证实皮瓣血运阻断。4 cm×5 cm硅橡胶薄膜置于皮瓣下方，并与创缘皮下组织间断缝合固定，以防止自创底和边缘的毛细血管长入(图1)。假手术组掀起皮瓣后，5-0尼龙缝线连续原位直接缝合皮瓣。缺血再灌注损伤组和白细胞介素1受体相关激酶4抑制剂组缺血8 h后，经切口下缘移除血管夹，开始再灌注，显微镜下确认皮瓣血管蒂脉冲性搏动恢复。整个实验过程中，维持动物体温于36-37 °C之间。分别于再灌注1，2，4，6 h，取皮瓣中部1 cm×1 cm皮瓣组织留做标本。取完后处死动物^[14]。

Western blotting蛋白印迹分析^[17]：取再灌注后1 h的皮瓣组织标本约100 mg与RAPI蛋白裂解液混合置于匀浆器内，最大转速匀浆30 s，静止15 min后离心取50 μg上样，用10%SDS-PAGE电泳分离蛋白，再以350 mA恒流转印至PVDF膜；膜置于含有5%脱脂牛奶室温封闭1 h；再用相应的兔抗鼠白细胞介素1受体相关激酶4(1∶1 000)及羊抗兔β-actin(1∶2 000)抗体4 ℃孵育过夜，次日以TBS/T洗涤3次，15 min/次，与HRP标记的羊抗兔IgG(1∶2 000)抗体37 ℃孵育1 h后，再TBS/T洗涤3次，15 min/次，ECL显色系统定影显色照相。

皮瓣组织苏木精-伊红染色^[18]：严格按照苏木精-伊红染色的实验步骤，对所取得皮瓣组织标本进行标本石蜡切片, 苏木精-伊红染色。

主要观察指标：

白细胞介素1受体相关激酶4蛋白对比：通过Western蛋白印迹分析对比3组皮瓣组织中，白细胞介素1受体相关激酶4蛋白含量的变化。

皮瓣组织病理学观察：光镜下观察组织中中性粒细胞浸润及水肿程度的变化。

皮瓣存活比例测定：于术后第7天，应用富士800万象素照机对皮瓣组织照相，再应用Image-Pro Plus 6.0软件对皮瓣范围及坏死部位面积进行吸光度(A)值分析，求出皮瓣存活面积与总面积之比，即为皮瓣存活比例(%)。

主要观察指标：皮瓣组织中白细胞介素1受体相关激酶4蛋白变化，皮瓣组织病理学改变，7 d后皮瓣存活比例。

统计学分析：宋海臣、刘迎迎等应用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，数据用x(_)±s表示，两组间比较采用F 检验。

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讨论

炎症反应触发的信号通路在缺血再灌注损伤过程中具有重要的意义^[19]，因为对于初始信号的干预可能会影响组织损伤及坏死的结果，即在某一阶段的组织损伤有关的细胞或其他影响因素可能对于随后阶段的炎症反应的严重程度和组织修复发挥重要影响。例如：补体系统作为免疫应答的初始阶段重要参与因素，同时它也参与损伤组织清除甚至组织修复^[20]。参与炎症反应的细胞成分有中性粒细胞、巨噬细胞等，它们在损伤的初始阶段就发挥作用，同时也为后期损伤的终止提供必要的信号^[21]。在急性缺血组织中这些炎症因子的具体作用仍然需要进一步阐述，但是它们的产生均被认为是导致组织坏死的关键因素。目前国内外研究发现，缺血后处理能显著减轻组织缺血再灌注损伤的炎症反应，抑制炎症触发信号的释放，减轻炎性因子的浸润^[22-24]。

白细胞介素1受体相关激酶4是最新发现的IRAK家族成员^[25]，在现已发现的4个成员中，即白细胞介素1受体相关激酶1、白细胞介素1受体相关激酶2、白细胞介素1受体相关激酶M及白细胞介素1受体相关激酶4中，只有白细胞介素1受体相关激酶1、白细胞介素1受体相关激酶4有激酶活性，白细胞介素1受体相关激酶4通过自身磷酸化反应使其底物白细胞介素1受体相关激酶1磷酸化后与肿瘤坏死因子受体相关因子6形成复合物，导致肿瘤坏死因子受体相关因子6发生低聚反应，进而通过一系列酶促反应使磷酸化的IKB(核因子)被降解导致核因子κB活化，最终活化的核因子κB进入细胞核引起促炎细胞因子基因的转录和表达造成缺血再灌注损伤^[26]。有研究证明相对于白细胞介素1受体相关激酶1，白细胞介素1受体相关激酶4分子在Toll样受体信号通路中的作用更为关键^[27]。首先，白细胞介素1受体相关激酶l被白细胞介素1受体相关激酶4磷酸化是Toll样受体通路髓性分化蛋白88依赖途径最早的活化环节，故其与受体复合物的形成和下游关键信号分子的激活关系密切。其次，白细胞介素1受体相关激酶4基因敲除小鼠Toll样受体通路下游细胞因子严重缺失，白细胞介素1受体相关激酶4基因缺失或突变的患者对外源性髓性分化蛋白88依赖的Toll样受体配体反应严重减低^[28-29]。因此白细胞介素1受体相关激酶4可使白细胞介素1受体相关激酶1活化的同时也是白细胞介素1受体相关激酶1募集于髓性分化蛋白88的必要条件，选择白细胞介素1受体相关激酶4作为调控由缺血再灌注损伤引起的炎性反应靶点，对炎性反应瀑链式产生会有很好的抑制作用。如在肝脏，内毒素信号首先经肝脏细胞的Toll样受体4胞内段与髓性分化蛋白88C末端的Toll样受体结构域相作用^[30]，进而白细胞介素1受体相关激酶1、白细胞介素1受体相关激酶4均结合到受体复合物，并导致白细胞介素1受体相关激酶1磷酸化。活化后的白细胞介素1受体相关激酶1与受体复合物的亲和力下降而分离，并与肿瘤坏死因子受体相关因子6形成复合物，导致肿瘤坏死因子受体相关因子6发生低聚作用，最终激活核转录因子核因子κB，导致肿瘤坏死因子α等一系列炎症细胞因子基因的转录和表达。所以白细胞介素1受体相关激酶4是白细胞介素1受体相关激酶1磷酸化及募集于受体复合物的必要条件，因而也是调控LPS细胞信号转导的最关键分子。

有研究表明Toll样受体4/髓性分化蛋白88信号通路可以激活核因子κB活性^[31]，上调炎性细胞因子表达，促使中性粒细胞浸润向皮瓣组织聚集，导致组织器官缺血再灌注损伤损伤发生。而白细胞介素1受体相关激酶4已被证实做为核因子κB和Toll样受体4之间的因子在动物模型多种组织、器官缺血再灌注损伤损伤中如脑、肝脏，心脏等中也发挥了重要作用^[32-34]。故通过对白细胞介素1受体相关激酶4的表达进行调控来减轻皮瓣缺血再灌注损伤损伤，提高皮瓣存活率是可行的。从本实验结果提示，当皮瓣缺血再灌注损伤损伤时中性粒细胞向皮瓣组织内浸润，作者通过在皮瓣缺血再灌注损伤损伤前应用白细胞介素1受体相关激酶4抑制剂，能明显减轻局部组织中性粒细胞浸润及内皮坏死，组织水肿，并且缺血再灌注组和白细胞介素1受体相关激酶4抑制剂组的白细胞介素1受体相关激酶4蛋白水平明显高于假手术组，白细胞介素1受体相关激酶4抑制剂组的白细胞介素1受体相关激酶4蛋白表达水平与缺血再灌注组比较显著降低，皮瓣存活比例有所提高，可以推测白细胞介素1受体相关激酶4抑制剂通过抑制白细胞介素1受体相关激酶4的活化调控Toll4样受体信号转导, 从而抑制核因子κB的激活, 进一步减少中性粒细胞向皮瓣组织浸润及活化, 减轻组织水肿程度，提高皮瓣存活率。

综上所述，本实验结果表明在皮瓣缺血再灌注损伤过程中皮瓣组织易形成炎性浸润，而应用白细胞介素1受体相关激酶4抑制剂可通过抑制白细胞介素1受体相关激酶4活化，阻断中性粒细胞介导的炎症反应。通过抑制白细胞介素1受体相关激酶4活化，对产生炎症递质的总体环节进行控制，可能为以后防治皮瓣缺血再灌注损伤损伤基础研究提供依据。也可能成为今后临床上防治皮瓣缺血再灌注损伤损伤的有效手段之一。另外，白细胞介素1受体相关激酶4基因突变与疾病也存在相关的联系^[35]。Toll样受体/白细胞介素1受体家族在各种感染性疾病诱发的免疫反应起着中枢性的调节作用，白细胞介素1受体相关激酶4是募集白细胞介素1受体相关激酶1于受体复合物并激活的必要条件，其激酶活性还是经Toll样受体/白细胞介素1受体通路的最佳信号传递所必须，但关于白细胞介素1受体相关激酶4激活与失活的具体过程和机制仍不十分清楚，充分研究其调控机制对于很多感染性和炎症性疾病的治疗意义重大。如能阐明白细胞介素1受体相关激酶4的晶体结构，设计出针对白细胞介素1受体相关激酶4特异性的药物，或者通过基因治疗手段干预白细胞介素1受体相关激酶4表达水平，阻断白细胞介素1受体相关激酶4激酶活性或者阻碍其和髓性分化蛋白88的结合，都将为移植组织缺血再灌注损伤的防治开辟一条新的道路。

白细胞介素1受体相关激酶4活性在皮瓣缺血再灌注损伤中的作用

Role of interleukin-1 receptor-associated kinase 4 activity in flap ischemia-reperfusion injury

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