两种富血小板纤维蛋白对人牙龈成纤维细胞增殖活性影响的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0589

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (7): 1007-1012.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0589

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两种富血小板纤维蛋白对人牙龈成纤维细胞增殖活性影响的比较

王灿莉1，2，焦志立2，孙勇1，2，孙嵩3

(1西南医科大学口腔医学院，四川省泸州市 646000；2四川口腔医院，四川省成都市 610015；3成都市第一人民医院，四川省成都市 610000)

收稿日期:2018-10-28 出版日期:2019-03-08 发布日期:2019-03-08
通讯作者: 孙勇，教授，主任医师，硕士生导师，四川口腔医院，四川省成都市 610015
作者简介:王灿莉，女，1993年生，四川省会理县人，汉族，西南医科大学在读硕士，医师，主要从事口腔种植修复的基础与临床研究。
基金资助:
全军“十二五”科研面上课题(CWS11J024)

Comparison of the effects of two kinds of platelet-rich fibrins on the proliferation activity of human gingival fibroblasts

Wang Canli1,2,Jiao Zhili2,Sun Yong1,2,Sun Song3

(1School of Stomatology, Sichuan Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Sichuan Hospital of Stomatology, Chengdu 610015, Sichuan Province, China; 3Chengdu First People’s Hospital, Chengdu 610000, Sichuan Province, China)

Received:2018-10-28 Online:2019-03-08 Published:2019-03-08
Contact: Sun Yong, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, School of Stomatology, Sichuan Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Sichuan Hospital of Stomatology, Chengdu 640015, Sichuan Province, China
About author:Wang Canli, Master candidate, Physician, School of Stomatology, Sichuan Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Sichuan Hospital of Stomatology, Chengdu 640015, Sichuan Province, China
Supported by:
the ”Twelfth Five-Year” Plan Program of Chinese PLA (General Program), No. CWS11J024

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
富血小板纤维蛋白：2001年由Choukroun等学者提出的第2代富血小板浓缩物，为一种富含大量生长因子、血小板、白细胞的血液制品，可压制成膜状、块状或剪成碎片，在组织再生中能够为细胞生长、迁徙提供支架和空间，降低局部炎症反应，促进软硬组织的再生修复。
改良型富血小板纤维蛋白：2014年由Ghanaati等学者提出经过改良和调整的富血小板浓缩物制品，这是一种细胞分布、生长因子含量、纤维蛋白微观结构及机械性能等均与富血小板纤维蛋白有所不同的新型富血小板纤维蛋白。

摘要
背景：自体血液制成的富血小板纤维蛋白在促进软组织再生修复方面成为研究热点。
目的：对比2种富血小板纤维蛋白对人牙龈成纤维细胞生长速度的影响，为临床中选择口腔软组织再生修复材料提供参考。
方法：阻生牙拔除同期取患牙周围健康龈瓣(8例)，组织块培养法获取人牙龈成纤维细胞并进行鉴定。抽取对应患者静脉血分别制成改良型富血小板纤维蛋白、富血小板纤维蛋白，8例样本均取第5代细胞分改良型富血小板纤维蛋白、富血小板纤维蛋白、空白组3组进行培养，于第1，3，5及7天，CCK-8法检测细胞增殖活性。
结果与结论：①培养的人牙龈成纤维细胞Vimentin染色阳性，Cytokeratin染色阴性；②成功获得2种富血小板纤维蛋白凝胶；与富血小板纤维蛋白相比，改良型富血小板纤维蛋白颜色较深，膜更厚，韧性更好；③CCK-8结果显示，第1天，3组细胞增殖活性无显著差异(P > 0.05)；第3天，改良型富血小板纤维蛋白和富血小板纤维蛋白组的细胞增殖活性显著高于空白组(P < 0.05)；第5和7天，细胞增殖活性表现为改良型富血小板纤维蛋白组>富血小板纤维蛋白组>空白组(P < 0.01，P < 0.05)；④结果提示，改良型富血小板纤维蛋白、富血小板纤维蛋白均能提高成纤维细胞增殖活性，且改良型富血小板纤维蛋白促细胞增殖效果明显优于富血小板纤维蛋白。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-4392-3628(王灿莉)

关键词: 富血小板纤维蛋白, 改良型富血小板纤维蛋白, 人牙龈成纤维细胞, 软组织缺损, 引导组织再生, 细胞增殖, 组织块培养, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Platelet-rich fibrin (PRF) prepared by autologous blood has become the hotspot in regeneration and repair of soft tissues.
OBJECTIVE: To compare the effect of two kinds of PRFs on the proliferation activity of human gingival fibroblasts (HGFs), so as to provide reference for the selection of oral soft tissue regeneration and repair materials in the clinic.
METHODS: Healthy gingival flaps from eight patients were collected when mandibular impacted teeth were removed. HGFs were obtained using tissue explant method, and then identified. The venous blood of the corresponding patients was drawn and made into advanced PRF and PRF, respectively, and passage 5 HGFs were divided into advanced PRF, PRF and blank groups for culture. The cell proliferation activity was detected by cell counting-kit 8 assay at 1, 3, 5, and 7 days.
RESULTS AND CONCLUSION: The HGFs were positive for Vimentin staining and negative for Cytokeratin staining. Two kinds of PRFs were prepared successfully. The advanced PRF exhibited the deeper color, more thick membrane and better flexibility compared with the general PRF. Cell counting-kit 8 assay results revealed that at 1 day after culture, there was no significant difference in the proliferation activity among groups (P > 0.05). At 3 days, the cell proliferation activity in the advanced PRF and PRF groups was significantly higher than that in the blank group (P < 0.05). At 5 and 7 days, the order of cell proliferation activity was as follows: advanced PRF group > PRF group > blank group (P < 0.01, P < 0.05). To conclude, both advanced PRF and PRF can increase the proliferation activity of HGFs, especially the former.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Fibrin, Soft Tissue Injuries, Fibroblasts, Guided Tissue Regeneration, Cell Culture Techniques, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R453.9

王灿莉, 焦志立, 孙勇, 孙嵩. 两种富血小板纤维蛋白对人牙龈成纤维细胞增殖活性影响的比较[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1007-1012.

Wang Canli, Jiao Zhili, Sun Yong, Sun Song. Comparison of the effects of two kinds of platelet-rich fibrins on the proliferation activity of human gingival fibroblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(7): 1007-1012.

图/表（结果） 3

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引言

在引导骨组织再生、拔牙即刻种植及一些复杂的牙周组织再生手术中，局部软组织炎症及缺损是创口关闭不全的主要原因，术后可能出现创口裂开、软组织进一步萎缩等并发症，最终导致移植材料暴露、组织再生失败或种植体周围炎的形成，面对这些局部软组织状况不佳的患者，临床医生需要找到有效的手术方法或生物材料来促进创伤区软组织的愈合及再生^[1-2]。创伤愈合包括4个不同而又彼此重叠的阶段，即血凝块形成阶段、炎症反应阶段、细胞增殖阶段和组织重塑阶段^[3]。创伤愈合需要各种细胞因子和生长因子的参与，其中生长因子参与调节细胞有丝分裂、细胞趋化、细胞分化、细胞代谢等关键过程^[4]。且研究表明，在创伤愈合早期，血小板在释放生长因子方面起首要作用，血小板浓缩物这一自体制品开始引起学者们的观注^[5]。

至今，血小板浓缩制品主要有第1代富血小板血浆、第2代富血小板纤维蛋白、第3代浓缩生长因子。其中富血小板血浆制备复杂且因牛凝血酶的加入会导致患者出现致命性的过敏反应，使得其临床运用受到限制^[6]。富血小板纤维蛋白在2001年由Choukroun等报道，其克服了富血小板血浆制备复杂及致敏性的缺点^[7]。临床中可将富血小板纤维蛋白压制成膜状、块状、碎片等形式供不同组织缺损所需，并在改善牙龈萎缩的牙周手术、拔牙即刻种植中软组织创面的关闭、引导骨组织再生、上颌窦提升以及上颌窦瘘修补术中起到关闭创面并促进软组织再生的作用^[8-11]。但也有部分研究结果显示富血小板纤维蛋白对细胞增殖存在一定不良反应，且关于离心力和离心时间对富血小板纤维蛋白三维空间结构及其中网络的细胞数量及成分影响的对比研究仍不完善。2014年，Ghanaati等^[12]通过适当地降低离心速度和延长离心时间获得改良型富血小板纤维蛋白，因离心参数的改变使得改良型富血小板纤维蛋白的细胞分布、生长因子含量、纤维蛋白微观结构及机械性能等均与富血小板纤维蛋白有所不同。

目前关于改良型富血小板纤维蛋白生物学作用方面的研究较为少见，且暂未能查到关于改良型富血小板纤维蛋白与富血小板纤维蛋白促进细胞增殖效果的对比研究。故当前研究通过对比这2种富血小板纤维蛋白对自体成纤维细胞增殖活性的影响，探讨二者的差异并分析原因，为临床医生选择促进软组织愈合及再生的生物材料提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外对比观察实验。

1.2 时间及地点于2016年9至12月在成都军区机关医院和四川省里来生物科技有限公司完成。

1.3 材料

1.3.1 实验取材 8例健康成年人牙龈，男女各4人，年龄19-24岁，平均年龄22岁，拔牙前血液检查各项指标均正常，女性患者避开月经期、孕期，戒烟酒2个月以上，无其他系统疾病。已签署拔牙及实验知情同意书，并获得伦理审查。

1.3.2 实验用主要试剂及仪器胎牛血清(CLARK)，MEM培养基(Hyclone)，鼠抗人Vimentin、Cytokeratin单抗(abcam)，浓缩型DAB试剂盒(中衫金桥)，CCK-8 (Biosharp)，倒置生物显微镜及配套摄像系统(型号AE31，麦克奥迪)，CO2培养箱(型号MCO-15AC，三洋)，富血小板纤维蛋白专用采血管、工具盒及专用离心机(PC-02，法国Nice)，培养板(24、96孔，Corning)。

1.4 方法

1.4.1 人牙龈成纤维细胞的获得与培养阻生牙拔除同期取患牙周围健康龈瓣，共8例。采用组织块培养法，以PBS反复荡洗标本3次，剪去上皮部分，保留下层结缔组织，分别剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小平铺于培养瓶底， 37 ℃，体积分数5% CO₂培养箱中倒置培养3 h后翻转培养瓶，沿瓶壁加入MEM培养基至浸没组织，继续倒置培养，每天于倒置相差显微镜下观察并记录细胞生长状况。在细胞生长至80%-90%融合时用体积分数0.25%胰蛋白酶消化，并以1∶3进行传代培养。

1.4.2 人牙龈成纤维细胞鉴定取第3代牙龈细胞制成细胞浓度为3×10⁸L^-1的单个细胞悬液，接种于24孔培养板中(1 mL/孔)，于37 ℃、体积分数5%CO₂孵箱孵育，第3天漂洗、固定、干燥后，按常规免疫荧光法进行波形丝蛋白和细胞角蛋白染色，按先后顺序滴加一抗(鼠抗人Vimentin单抗)和二抗(鼠抗人Cytokeratin单抗)，DAB显色，苏木精复染，漂洗，脱水，透明，封固，光镜观察。

1.4.3 改良型富血小板纤维蛋白、富血小板纤维蛋白的制备预约提供牙龈的志愿者，分别以改良型富血小板纤维蛋白、富血小板纤维蛋白专用采血管采集血液，并立即置于专用离心机内，配平后分别按以下条件离心：改良型富血小板纤维蛋白(1 500 r/min，14 min)，见图1A，富血小板纤维蛋白(2 700 r/min，12 min)，见图1D。离心结束后可见试管内血液分为较为明显的3层，即为实验所需富血小板纤维蛋白凝胶部分，见图1B，E。静置3 min后，取出凝胶并置于富血小板纤维蛋白专用工具盒中压制15 s，形成厚度均匀的膜状，将所得膜纵向均匀对称裁剪为4条，并于电子天平上多次称质量及精细修剪使得膜质量一致，后将修剪好的膜置于无菌皿内备用，见图1C，F。

1.4.4 分组与细胞培养分别取8个样本培养得来的第5代牙龈细胞制成细胞浓度为3×10⁸ L^-1的单细胞悬液备用。8个样本来源细胞均各自分为3组进行培养：①改良型富血小板纤维蛋白组：先将改良型富血小板纤维蛋白膜置于培养板底部，再于培养板中接种备好的细胞悬液，每孔1 mL，每样本设3个复孔；②富血小板纤维蛋白组：先将富血小板纤维蛋白膜置于培养板底部，其余同改良型富血小板纤维蛋白组；③空白组：直接于培养板中接种细胞悬液，其余同上。并将所有分组置于相同条件下的CO₂培养箱中培养。

1.4.5 细胞增殖活性检测在细胞培养的1，3，5及7 d，取CCK-8溶液加入培养板，每孔50 μL，3 h后，低速振荡培养箱10 min，然后在24孔板中每孔吸取300 μL上清溶液于96孔板中，每孔150 μL，用酶联免疫检测仪在450 nm处对各孔的吸光度值进行测量，取3个复孔吸光度值的均值作为该样本最终的吸光度值进行统计。

1.5 主要观察指标 ①人牙龈成纤维细胞的培养与鉴定；②人牙龈成纤维细胞的增殖活性。

1.6 统计学分析用SPSS 17.0统计软件进行统计。以L-evene法进行方差齐性检验，若方差齐，则采用单因素方差分析，并以SNK法进行组间两两比较；若方差不齐，则采用t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义，检验水准为双侧α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

临床中，局部牙龈软组织萎缩或牙龈组织质量不佳患者并不少见，面对这些患者，局部软组织创面的关闭以牙龈软组织的再生成为困扰手术医生的主要问题之一。人牙龈成纤维细胞是人牙龈结蹄组织中的主要细胞，主要存在于牙龈固有层中，其主要功能是合成胶原纤维、弹性纤维及基质，具有较活跃的自身更新能力，在牙周软组织的自身修复及创伤愈合中起着至关重要的作用^[13]。随着近年来组织工程方面研究的进一步深入，人牙龈成纤维细胞凭借其来源丰富、取材方便且具有合成纤维蛋白基质等优势作为新兴的“种子细胞”被越来越多的学者们用于牙周组织工程、种植体周围组织工程、口腔黏膜炎和系统性免疫相关疾病的干细胞治疗等^[14-15]。富血小板纤维蛋白及改良型富血小板纤维蛋白作为第2代血小板浓缩制品，富含生长因子，且其取材来自于患者自身，避免了免疫及伦理相关问题，目前国内外虽有较多研究表明富血小板纤维蛋白具有促进口腔软硬组织再生方面的潜能，但关于改良型富血小板纤维蛋白的相关研究较少见^[16-17]。

当前实验根据前人的制取方法，分别成功获得了富血小板纤维蛋白凝胶，这是一种富含白细胞的血小板浓缩制品，故也叫富含白细胞的富血小板纤维蛋白、改良型富血小板纤维蛋白凝胶^[18-19]。因离心力大小和作用时间不同，这2种凝胶中的微观结构及颜色质地均存在一定差异。Ghanaati等^[12]研究发现通过降低离心速度和适当延长离心时间获得的改良型富血小板纤维蛋白，相较于富血小板纤维蛋白而言，拥有更加疏松的纤维网状结构，其中网络了更多的血小板、白细胞和生长因子，在体外释放生长因子和降解的时间更长，因而更能促进体外培养的成纤维细胞的增殖、迁移等；而且在凝胶的远端发现了中性粒细胞，而在制取富血小板纤维蛋白的试管中，中性粒细胞因为较大的离心力沉积在了红细胞层，在体内环境下，这些细胞及生长因子的释放能通过影响创伤后单核/巨噬细胞等系统的反应，从而促进软硬组织的愈合。练轶等^[20]的研究也进一步证实了改良型富血小板纤维蛋白的纤维网状结构比富血小板纤维蛋白更疏松，纤维蛋白间网格间隙更大。因此，可以解释当前实验中二者在外观形态和力学性能上的差异，离心力的适当降低使可以适当降低试管中的纤维蛋白凝结的紧密程度，从而获得更加疏松的结构，离心时间的适当延长，可以使这一结构更加稳定，故最终获得的改良型富血小板纤维蛋白相对较厚、质地较韧且使用时不易卷曲粘连。

当前实验中细胞培养的第3天开始，富血小板纤维蛋白、改良型富血小板纤维蛋白对成纤维细胞的增殖相较于空白对照组起到明显促进作用，实验第5-7天，改良型富血小板纤维蛋白组相较于富血小板纤维蛋白组和空白对照组对细胞增殖有更明显的促进作用，且存在明显差异，证明富血小板纤维蛋白、改良型富血小板纤维蛋白对细胞增殖的促进作用，且改良型富血小板纤维蛋白促进成纤维细胞增殖的能力优于富血小板纤维蛋白。这一实验结果与前人的研究结果一致^[21-23]。Kobayashi等^[24]在富血小板纤维蛋白与改良型富血小板纤维蛋白的体外对比研究中发现改良型富血小板纤维蛋白在15 min、1，8 h等多个时间点释放的生长因子量超过富血小板纤维蛋白，且改良型富血小板纤维蛋白在整个实验周期内释放生长因子总量更多，释放时间更长。

然而，当前实验结果与Vahabi等^[3]的研究报道存在一定差异的是，该研究表明富血小板纤维蛋白在与人牙龈成纤维细胞共同培养的48-72 h时间段对细胞的增殖活性有负面影响，细胞增殖活性低于阴性对照组，作者分析原因可能为个体间血液成分的差异、pH值、血小板浓缩物中各种具有刺激作用和抑制作用的生长因子的差异性释放等。Liu等^[25]学者研究认为低细胞增殖活性与pH值有关，高浓度的血小板聚集改变了局部环境的pH值，从而对细胞增殖活性产生负面影响。有研究证实，当所获得的血小板制品中血小板浓度是血液中的2.5倍时能获得最佳的促进效果，更高浓度的血小板浓缩物将起到抑制效果，会降低细胞增殖活性，这可以一定程度上解释不同学者获得不同结果的原因^[26]。另一方面，经查阅文献发现以往文献中报道的与富血小板纤维蛋白共同培养的细胞多为动物细胞或商业化的细胞，研究者认为通过原代细胞培养可一定程度上消除免疫应答中白细胞等对培养细胞的潜在影响，但仍不能完全排除不同来源细胞间的反应这一因素对细胞增殖的负面影响^[27-28]。当前实验使用志愿者的富血小板纤维蛋白来培养取自于志愿者的牙龈成纤维细胞，且严格控制志愿者筛选条件，这样可以避免不同来源的培养细胞和富血小板纤维蛋白中细胞间的不良反应并尽量减小个体差异带来的误差。同时，考虑到以往学者对富血小板纤维蛋白、改良型富血小板纤维蛋白降解规律、成纤维细胞生长特性、牙龈组织的愈合规律的研究结果及富血小板纤维蛋白与细胞培养存在的感染风险等因素，实验将细胞培养时间限制在7 d且由同一实验组完成细胞培养，尽量减少培养过程中其它无关因素对细胞增殖的影响^[29]。

实验的不足：①因实验时间限制，实验取材来源于8个志愿者，虽严格控制筛选条件，但因样本量不够大，统计结果可能存在一定偏差；②暂未能对成纤维细胞具体生长和蛋白表达情况做出检测；③脱离了复杂的口腔环境，不能考虑到口腔卫生、口腔菌群、唾液情况等多方面因素影响；④对改良型富血小板纤维蛋白、富血小板纤维蛋白两种膜生长因子释放情况及其在液体培养基中降解的具体情况暂未能做出比较。

综上，实验进一步研究了人改良型富血小板纤维蛋白和富血小板纤维蛋白在体外促进人牙龈成纤维细胞增殖的生物学效果，并证实在细胞培养的第5-7天改良型富血小板纤维蛋白相较于富血小板纤维蛋白对成纤维细胞具有更加明显的促增殖作用这一生物学优势，这一实验结果将为进一步研究改良型富血小板纤维蛋白与富血小板纤维蛋白在促进牙龈组织再生的临床实验研究中提供理论依据，同时为临床医生选择软组织再生材料提供新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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