三氟拉嗪干预兔耳增生性瘢痕模型：降低瘢痕厚度的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：增生性瘢痕常规的治疗手段包括手术切除、类固醇激素、抗代谢药、免疫抑制剂和放射疗法等，大多容易重复发作或有较严重的反应而限制了其在临床方面的使用。近年来应用钙离子阻断剂治疗增生性瘢痕取得了较为理想的进展，且不良反应小。
目的：观察钙通道阻滞剂三氟拉嗪对兔耳增生性瘢痕产生的影响。
方法：选取大耳白兔24只为实验对象，适应性饲养1周后，参照Morris和李荟元等方法建立兔耳瘢痕模型，按照随机数字表法分为3组，每组8只。造模后30 d瘢痕形成后，三氟拉嗪组、曲安奈德组分别给予三氟拉嗪、曲安奈德注射液，空白对照组不做处理。对比观察各组瘢痕增生变化情况，瘢痕增生指数，瘢痕基质金属蛋白酶2、金属蛋白酶抑制因子2、转化生长因子β1、α-平滑肌肌动蛋白及增殖细胞核抗原水平。
结果与结论：分别用药10，20 d后，3组兔耳都有肉眼可见的皮肤隆起，且无兔毛生长。三氟拉嗪组兔耳较曲安奈德组发生明显软化，颜色偏暗红；空白对照组兔耳瘢痕明显，颜色偏红。三氟拉嗪组与曲安奈德组在用药20 d后，瘢痕厚度、瘢痕指数均低于空白对照组；与空白对照组比较，三氟拉嗪组、曲安奈德组基质金属蛋白酶2的表达明显升高；金属蛋白酶抑制因子2、增殖细胞核抗原以及转化生长因子β1的表达明显降低。提示三氟拉嗪治疗兔耳瘢痕增生效果良好，有降低瘢痕厚度的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 三氟拉嗪, 兔耳增生性瘢痕, 基质金属蛋白酶2, 金属蛋白酶抑制因子2, 增殖细胞核抗原

Abstract:

BACKGROUND: Conventional treatments for hypertrophic scars include excision, steroid hormones, anti-metabolite drugs, immunosuppressive agents and radiation therapy. Easy to relapse or serious reaction limits their clinical use. In recent years, application of calcium channel blockers in treatment of hypertrophic scars has made more good progresses, but little adverse reactions are obtained.
OBJECTIVE: To explore the effects of calcium channel blocker trifluoperazine on hypertrophic scar of rabbit ears.
METHODS: A total of 24 rabbits were enrolled in this study. After 1 week of accommodation, models of rabbit ear scar were established in accordance with the method of Morris and Li et al. Rabbit models were randomly assigned to three group (n=8). At 30 days after model induction, when scar formed, trifluoperazine and triamcinolone acetonide groups received trifluoperazine and triamcinolone acetonide injection. Blank control group was left intact. Changes in hyperplastic scar, hypertrophic index, levels of matrix metalloproteinase-2, tissue inhibitor of metalloproteinase-2, transforming growth factor β1, α-smooth muscle actin and proliferating cell nuclear antigen were compared and observed in each group.
RESULTS AND CONCLUSION: At 10 and 20 days after treatment, in the three groups, skin bulge was visible in rabbit ears and no rabbit hair grew. Rabbit ears had obvious softening in the trifluoperazine group compared with the triamcinolone acetonide group, showing dark red. In the blank control group, rabbit ear scar was evident and showed red color. At 20 days after treatment, scar thickness and scar index were lower in the trifluoperazine and triamcinolone acetonide groups than in the blank control group. Matrix metalloproteinase 2 expression was significantly higher, but tissue inhibitor of metalloproteinase-2 and transforming growth factor β1 levels were lower in the trifluoperazine and triamcinolone acetonide groups than in the blank control group. Results indicated that trifluoperazine obtained good proliferative effects on rabbit ear scar, and could decrease scar thickness.

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Key words: trifluoperazine, cicatrix, matrix metalloproteinase-2, transforming growth factor beta 1, proliferating cell nuclear antigen

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 5

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引言

瘢痕组织是创伤愈合的必然产物，除少数情况外，真皮层受创伤的伤口均以瘢痕形式愈合。增生性瘢痕的治疗一直是临床上困扰皮肤科医师的问题，目前对增生性瘢痕的治疗主要有以下几种方式^[1]：药物治疗、压迫治疗、激光治疗等。

钙调素是钙离子信号转导途径中的主要信号分子，通过影响胞内钙离子依赖酶和激酶的活性而在细胞增殖、分化以及凋亡过程中起着重要调节作用。作为特异性的钙调素抑制剂三氟拉嗪在相关的研究领域中得到了广泛的应用，研究显示三氟拉嗪能够识别钙离子的疏水区，通过改变钙调素的构象，从而改变受体后钙调素-CaMIK(calmodulin protein kinases)信号转导通路的功能状况，产生其生物学效应及相应的药理作用。己有的研究表明三氟拉嗪对白血病细胞具有抗增殖活性而对正常淋巴细胞没有任何影响。

钙通道阻滞剂三氟拉嗪能够抑制成纤维细胞的黏附和增殖。真皮成纤维细胞上表达有钙离子通道，对于增生性瘢痕成纤维细胞这种非兴奋性细胞，钙内流对细胞有着多方面的作用：①补充钙库，使细胞可对下一个刺激产生相应的效应。②使外界刺激所产生的信号扩大并延续。③活化钙依赖性酶，从而产生多种细胞的功能性活动，如某些基因的转录及细胞的分泌。④介导各信号系统间的相互作用，如使cAMP介导的信号增强。⑤参与其他离子通道的调节，调控细胞的反应。

在细胞球形化过程中，钙拮抗剂使肌动蛋白丝解聚，但是并不破坏微管。α-平滑肌肌动蛋白的解聚导致成纤维细胞由双极形向球形转变，同时也能开启正常人真皮成纤维细胞的前胶原酶基因的表达，而且这种肌动蛋白丝解聚导致的细胞球形变并不减弱细胞的存活能力。钙拮抗剂提高间质金属蛋白酶的活性基质金属蛋白酶在创面愈合及组织重塑中起着不可忽视的作用。基质金属蛋白酶是一组含有9种甚至更多的具有很高同源性的含锌或其他金属离子的内源性多肽，其中基质金属蛋白酶2可分解Ⅴ，Ⅶ型胶原，弹性蛋白，纤维粘连蛋白及蛋白多糖的蛋白核心；细胞内低钙水平导致基质金属蛋白酶2的蛋白水解活性增高。钙拮抗剂能抑制组织金属蛋白酶抑制因子的转录组织金属蛋白抑制因子作为基质金属蛋白酶的特异性抑制因子，在维持结缔组织的动态平衡中起重要作用。而基质金属蛋白酶2和其较特异的抑制因子金属蛋白酶抑制因子2，认为二者间的平衡对瘢痕的结局有重要影响。研究发现，钙通道阻滞剂可抑制人肺血管平滑肌细胞和成纤维细胞血小板源性生长因子BB依赖金属蛋白酶抑制因子2的转录。

转化生长因子β1的主要功能是促进成纤维细胞的增殖并促进其合成胶原等细胞外基质，同时抑制蛋白酶和基质酶的活性，从而促进细胞外基质沉积，通过人和动物的研究表明，适量的转化生长因子β1有益于组织愈合，转化生长因子β1的过度表达可能导致瘢痕和纤维化形成。

为探索增生性瘢痕的有效治疗方法，文章对三氟拉嗪对增生性瘢痕产生的作用及其机制进行探究。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2013年7至9月在佳木斯大学实验室完成。

材料：选取大耳白兔24只，由佳木斯大学实验中心提供。雌性11只，雄性13只，体质量2.3-2.5 kg，平均(2.4± 0.1) kg；兔耳健全，分笼进行饲养。按照随机数字表法分为3组，每组8只；所有大白兔雌雄、体质量等一般资料比较差异无显著性意义。

方法：

瘢痕模型的建立：将动物适应性饲养1周后，瘢痕模型的制作参照Morris等和李荟元等方法^[2]，并加以改良，用 30 g/L戊巴比妥钠(30 mg/kg)作耳缘静脉麻醉，兔耳腹侧面皮肤碘伏、乙醇消毒，严格无菌操作技术下，在兔耳腹侧中段沿长轴避开可见血管，作1 cm×1 cm大小创面，创面间隔1 cm以上，去掉兔耳全层皮肤并用刮勺彻底刮除软骨膜，创缘用电烙铁烧灼，每耳6处，共288个创面，术后创面暴露，待其自行愈合。

实验药物注射：造模后30 d，待兔耳创面瘢痕形成后，取皮痕标本做切片，苏木精-伊红和VG染色证实是瘢痕组织，三氟拉嗪组和曲安奈德组分别注射三氟拉嗪注射液和曲安奈德注射液，空白对照组不做处理，每组8只。用药方法：用微量注射器从创面周围的正常皮肤进针向创面基底部及创面灶内局部注射，注射量50 μL/创面，每3 d 给药1次，共6次。

瘢痕指数测量：用药后10，20 d，观察瘢痕增生变化情况，测量瘢痕增生指数HI(HI=瘢痕厚度SH/正常皮肤厚度DH)记录数据，并作统计学分析(图1)。

标本染色：用药后20 d，用3%戊巴比妥钠1.5 mg/kg作耳缘静脉麻醉，在无菌技术下用手术刀切取标本。用液氮快速冰冻，以后转为深低温冰箱-80 ℃保存；用体积分数4%中性甲醛固定，作苏木精-伊红、VG染色；用2.5%的戊二醛液固定，显微镜观察^[3]。

标本检测方法：瘢痕基质金属蛋白酶2、金属蛋白酶抑制因子2、转化生长因子β1、α-平滑肌肌动蛋白及增殖细胞核抗原水平采用ELISA法检测，按照试剂盒操作步骤进行。操作步骤：①准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30 min。②配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。③加标准品和瘢痕组织提取液：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、瘢痕组织提取液和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50 μL；待测样本孔中先加入待测样本 10 μL，再加样本稀释液40 μL；空白对照孔不加。④温育：37 ℃水浴锅温育30 min。⑤洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次。⑥加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50 μL，空白对照孔不加。⑦温育：37 ℃水浴温育30 min。⑧洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次。⑨显色：每孔先加入显色剂A液50 μL，再加入显色剂B液 50 μL，用手轻轻震荡混匀30 s，37 ℃避光显色15 min。⑩终止：取出酶标板，每孔加终止液 50 μL，终止反应(颜色由蓝色立转黄色)。?测定：以空白孔调零，在终止后 15 min内，用450 nm波长测量各孔的吸光值(A值)。

主要观察指标：瘢痕增生变化情况，瘢痕增生指数，电镜观察结果，瘢痕基质金属蛋白酶2、金属蛋白酶抑制因子2、转化生长因子β1、α-平滑肌肌动蛋白及增殖细胞核抗原水平。

统计学分析：由本实验参与者共同进行数据整理分析，采用SPSS 14.0软件包进行数据处理，计数资料比较采用χ²检验，计量资料比较采用t 检验，检验结果以P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

皮肤损伤之后伤口愈合，瘢痕增生可发展成增生性瘢痕。增生性瘢痕突出的皮面，形状不规则，高低不平，潮红充血，质地实韧伴有加剧燃烧感和瘙痒，在临床上给患者生理以及心理上带来了极大的痛苦；增生往往持续数月或数年后逐渐发生退行性改变，颜色转暗，充血消退，柔软。部分患者最终可能会愈合，瘙痒症状明显减轻或消失。病理性瘢痕和正常瘢痕的区别在于深瘢痕胶原纤维增厚，呈旋涡形或缠绕成绳状。涡流绳状或胶原沉积往往粘蛋白瘢痕变成坚硬的固体块。增生性瘢痕的形成，主要是由于胶原蛋白的新陈代谢会超过分解代谢的速度，在相当长的一段时间，大量形成胶原纤维导致^[4-14]。瘢痕产生与种族、遗传、身体素质、瘢痕增生等因素相关，但确切发生机制有待进一步研究。

三氟拉嗪为吩噻嗪抗精神病药，在肝脏中代谢，主要活性代谢物为硫氧化物，N-去甲基化和7-羟基代谢物。三氟拉嗪在动物以及人体体内外实验中都表现出其抗病毒性，并且在进行动物实验时，显示其生物安全性高，因此，大多数学者致力于三氟拉嗪对一些皮肤病产生的疗效研究，研究结果显示，其对皮肤病存在潜在的治疗价值。目前，对于三氟拉嗪对瘢痕治疗的报道日益增多，用于瘢痕疙瘩切除后的辅助治疗，防止复发。其对瘢痕组织内细胞的凋亡起到了促进作用，还可促进基质金属蛋白酶2、增殖细胞核抗原细胞因子的合成，抑制金属蛋白酶抑制因子2、转化生长因子β1，使胶原组织的合成降低^[15-31]。

以胶原为主的细胞外基质过度沉积是增生性瘢痕的重要病理特征，也是增生性瘢痕得以生长的主要物质。转化生长因子β1是成纤维细胞的强效趋化因子，可以通过旁分泌和自分泌直接或间接、单独或协同、同时或不同时作用于炎症及修复细胞，产生细胞的趋化性迁移、增生分化，以及细胞外基质合成与分泌3类重要的生物学效应。转化生长因子β1对细胞外基质的作用中，促进成纤维细胞中葡萄糖与氨基酸的转运和糖酵解的进行，导致细胞外基质合成显著增加。同时，通过抑制基质降解酶的产生，促进该酶降解物的产生，并加强基质与细胞的结合等，导致局部纤维组织增生^[32-39]。

基于以往对三氟拉嗪作用于瘢痕组织的研究，本文将兔耳增生性瘢痕动物模型作为基础，探究三氟拉嗪对兔耳增生性瘢痕模型的作用。探究结果显示，三氟拉嗪组在瘢痕厚度以及瘢痕指数的情况上均比曲安奈德组、空白对照组良好，说明三氟拉嗪的使用能够让瘢痕组织软化，使瘢痕厚度降低，但仍不能是瘢痕组织完全消失。

综上所述，三氟拉嗪用于增生性瘢痕的治疗有一定的效果，但其作用机制仍需进一步探究。