1.1 设计 细胞学体外实验。
1.2 时间及地点 实验于2013年4月至2015年4月在广东医科大学东莞校区实验科研平台完成。
1.3 材料 DMEM液体培养基、胎牛血清购自Hyclone公司、胰蛋白酶购自sigma公司、兔抗鼠β-actin单克隆抗体购自abcam公司,HRP-兔抗鼠IgG、p-FoxO1抗体,FoxO1抗体,p-Akt抗体和Akt抗体购自CST公司、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒。SPF级新生两三天的SD乳鼠8只,体质量5-10 g,由广东医科大学实验中心提供。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠表皮成纤维细胞的分离及扩增培养 无菌条件取新生两三天SD乳鼠麻醉下脱臼处死后,用体积分数75%的乙醇浸泡消毒5 min;取背腹部皮肤(尽量除去皮下组织)PBS清洗2次,眼科剪将皮肤剪成0.5-1.0 mm3大小;加入0.25%胰蛋白酶,37 ℃水浴锅中轻微震荡消化 15 min;取悬液离心2 000 r/min 10 min,弃上清液,剩余组织再次加入新的0.25%胰酶消化,操作连续3次;再加入2.0-3.0 mL细胞培养液,用枪头轻轻吹打;将组织块加入细胞培养瓶中,含有体积分数10%胎牛血清100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养液中,置于37 ℃体积分数5%CO2恒温培养箱中培养,常规两三天更换1次培养基。实验用细胞为第4-8代细胞。
1.4.2 MTT法检测辣椒素对大鼠表皮成纤维细胞生长增殖的影响 对数生长期的大鼠表皮成纤维细胞,胰酶消化后制成细胞悬液,用含体积分数10%胎牛血清的DMEM稀释成细胞浓度为1×107L-1的细胞悬液,96孔培养板内每孔加入100 µL细胞悬液,确定每孔含细胞5 000个;待细胞贴壁后吸出培养基,各实验组添加辣椒素溶液并使其终质量浓度分别为0.5,1,2,4,8 mg/L,阴性对照组加相同体积培养液。实验组每个剂量设9个平行孔,阴性对照孔6孔;置于37 ℃,体积分数5% CO2恒温培养箱分别培养24 h后,每孔加入10% MTT溶液继续培养2 h,在波长490 nm的酶标免疫检测仪上测定各孔光吸收值;每组A490的A值为平行孔的平均A值,结果取3次实验平均值。
1.4.3 Hoechst 33258染色检测凋亡细胞 PBS洗涤处理后的细胞2次(每次5 min),加入新鲜配制的40 g/L多聚甲醛,4 ℃固定10 min。PBS洗涤3次后(每次5 min),Hoechst33258染色液(5 mg/L)染色10 min,PBS洗涤细胞3次后(每次5 min),封固后荧光显微镜观察、随机选择3个视野拍照。
1.4.4 流式细胞术检测细胞周期 处理后的细胞离心 1 000 r/min×5 min,弃上清,预冷的PBS洗细胞2次。加入预冷体积分数70%乙醇,于4 ℃固定过夜。离心收集细胞,PBS洗细胞1次,加入500 µL PBS含50 mg/L溴化乙锭(PI),100 mg/L RNase A,0.2%Tritonx-100,4 ℃避光孵育 30 min。流式细胞仪检测的结果用细胞周期拟合软件ModFit分析。
1.4.5 Annexin V-FITC双染法检测细胞凋亡 取对数生长期大鼠表皮成纤维细胞,胰酶消化后计数,在细胞培养瓶中接种5×105细胞;在37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱中培养至细胞贴壁后,吸除培养基,加入无血清的DMEM培养基,培养细胞24 h至细胞同步化;各培养皿中加入不同质量浓度的辣椒素,依次为2,4 mg/L,对照组加入等量的普通培养液,培养24 h;吸出内培养基,用PBS小心洗涤2遍,再用不含EDTA的0.25%胰酶消化,注意胰酶消化时间不宜过长,离心收集细胞;加入500 µL的Binding Buffer悬浮细胞;加入5 µL Annexin V-FITC混匀后,加入 5 µL Propidium Iodide,混匀;室温,2-8 ℃下避光反应15 min;于流式细胞仪上检测细胞凋亡率。实验重复3次。
1.4.6 Western blot检测Akt-FoxO1信号通路蛋白的表达 不同质量浓度的辣椒素(0,2,4,8,16 mg/L)处理大鼠表皮成纤维细胞24 h后,PBS洗细胞,裂解液裂解细胞获取总蛋白,BCA试剂盒测定总蛋白浓度。10% SDS-PAGE分离总蛋白,PVDF膜转膜,5%的脱脂奶粉室温封闭1h,用0.1%TBST洗涤膜3次,每次10 min。孵育一抗,洗膜,孵育二抗,凝胶成像系统显影并拍照。
1.5 主要观察指标 ①大鼠表皮成纤维细胞形态学观察;②大鼠表皮成纤维细胞增殖和凋亡情况;③大鼠表皮成纤维细胞的细胞周期;④大鼠表皮成纤维细胞的蛋白表达。
1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理,计量资料以x±s表示,两组计量资料之间的比较采用t 检验;组间计量资料均值的比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK法,均以P < 0.05为差异有显著性意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点:组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程