Exendin-4对不同热缺血时间心死亡供体大鼠胰岛功能的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.002

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (36): 5747-5751.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.002

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Exendin-4对不同热缺血时间心死亡供体大鼠胰岛功能的影响

车彦鹏¹，刘永锋²，宋文卿¹，梁世博¹

1大庆龙南医院普外科，黑龙江省大庆市 163453
2中国医科大学附属第一医院普通外科教研室肝胆外科，辽宁省沈阳市 110001

修回日期:2014-06-04 出版日期:2014-08-30 发布日期:2014-08-30
通讯作者: 刘永锋，博士，主任医师，博士生导师，中国医科大学附属第一医院普通外科教研室肝胆外科，辽宁省沈阳市 110001
作者简介:车彦鹏，男，1975年生，黑龙江省大庆市人，汉族，2011年中国医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事肝胆外科及胰岛移植方面的研究。

Exendin-4 effect on pancreatic islet function of donor rats with cardiac death at different heat ischemia time

Che Yan-peng¹, Liu Yong-feng², Song Wen-qing¹, Liang Shi-bo¹

1Department of General Surgery, Daqing Longnan Hospital, Daqing 163453, Heilongjiang Province, China
2Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China

Revised:2014-06-04 Online:2014-08-30 Published:2014-08-30
Contact: Liu Yong-feng, M.D., Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
About author:Che Yan-peng, Master, Associate chief physician, Department of General Surgery, Daqing Longnan Hospital, Daqing 163453, Heilongjiang Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：心死亡供体大鼠供胰的利用不可避免地经过热缺血损伤，因此热缺血时间的长短对获得的胰岛数量及功能有重要影响。
目的：观察Exendin-4对不同热缺血时间心死亡供体大鼠胰岛功能的影响。
方法：大鼠胰岛细胞体外培养，根据实验条件随机分为3大组：热缺血0，30和45 min组，每组又分为2亚组，其中对照组为胰岛细胞培养24 h；实验组为10 nmol/L Exendin-4与胰岛细胞培养24 h。应用双硫踪染色来计算分离胰岛数目并判断所提胰岛的纯度；丫啶橙/溴乙啶染色检测胰岛存活，胰岛素释放实验检测胰岛功能。
结果与结论：随着热缺血时间的延长各组获得胰岛细胞的数量、纯度、存活率及功能逐渐降低。热缺血0 min组、30 min组、45 min组加入10 nmol/L Exendin-4培养24 h后分离、纯化的胰岛数量及纯度、活性均比未加入Exendin-4培养的对照组有所提高，热缺血30 min及热缺血45 min组中的实验组与对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05)。提示Exendin-4对不同热缺血时间心死亡供体大鼠胰岛细胞具有保护作用，能减少胰岛细胞凋亡，改善胰岛的存活与功能；Exendin-4的使用可能成为胰岛移植早期缺血的边缘供体预处理的有效方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 胰岛细胞, 热缺血时间, Exendin-4, 胰岛移植, 心死亡供体

Abstract:

BACKGROUND: The use of donor rat of cardiac death inevitably experiences warm ischemia injury, so the length of warm ischemia time plays a significant role on the number and function of pancreatic islet obtained.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Exendin-4 on pancreatic islet function of donor rats with cardiac death at different heat ischemia time.
METHODS: Islet cells from Wistar rats were cultured in vitro and randomly divided into three groups according to the experimental conditions: 0, 30, 45 min heat ischemia groups. Each group was further assigned into two subgroups, control group was cultured for 24 hours while experimental group wad cultured with 10 nmol/L Exendin-4 for 24 hours. The number of isolated pancreatic islets was calculated with diphenylthiocarbazone staining, and the purity of the extracted islets was adjusted. The viability of the islets was examined by AO/EB staining, and insulin secretion index assay was used to detect the function of the islets.
RESULTS AND CONCLUSION: With the time of heat ischemia increasing, the number, purity, viability and function of islet cells obtained were decreased. After the cells in heat ischemia 0, 30, 45 min groups were cultured with 10 nmol/L Exendin-4 for 24 hours, the number, purity and viability of isolated and purified islets were increased compared to the group without added Exendin-4. There was significant difference between experimental group and control group in 30-minute and 45-minute ischemia groups (P < 0.05). Exendin-4 can protect pancreatic islet cells in donor rats with cardiac death at different heat ischemia times, reduce the apoptosis, and improve islet survival and functions. The use of Exendin-4 can be an effective pretreatment method at early ischemia phase of islet transplantation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: islets of langerhans, warm ischemia, islet transplantation

中图分类号:

R318

车彦鹏，刘永锋，宋文卿，梁世博. Exendin-4对不同热缺血时间心死亡供体大鼠胰岛功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(36): 5747-5751.

Che Yan-peng, Liu Yong-feng, Song Wen-qing, Liang Shi-bo . Exendin-4 effect on pancreatic islet function of donor rats with cardiac death at different heat ischemia time[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(36): 5747-5751.

图/表（结果） 2

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引言

糖尿病目前已成为严重威胁人类健康的重大公共卫生问题，其患病率逐年增加，医疗费用投入比例日益增高。糖尿病己经成为继心血管疾病和肿瘤之后的第三大疾病，全球目前约有3亿多的糖尿病患者，其中30%-50%的糖尿病患者合并各种并发症，进而导致生活质量下降，生存期缩短，医疗费用增加^[1]。糖尿病患者持续的高血糖水平是合并并发症的决定性危险因素^[2]。因此，只有建立安全有效的治疗方案，长期维持正常的血糖水平，才能给糖尿病患者带来健康、良好的生活。

糖尿病控制和并发症试验(DCCT)指出，一个熟练的糖尿病治疗小组，再施以精确的胰岛素控制，能够使患者的血糖接近正常水平，并保持数年。但是，这种接近完美的办法比现行的常规治疗方法需要更多的关注和医疗服务^[3]，给患者增加了负担，难以向更多的患者推广，同时也增加了并发严重低血糖的风险。目前，达到并维持正常血糖，同时避免低血糖危险的惟一途径，就是胰岛替代治疗：胰腺移植或者胰岛移植。目前，全世界胰腺移植已经超过18 000例，胰岛素不依赖率1年为85%，3年为80%^[4]。胰岛移植属于细胞移植范畴，虽然胰岛移植后对外源性胰岛素依赖性的解除不如胰腺移植后高，但与胰腺移植相比具有手术创伤性小、可重复性好、安全、并发症少等优势^[5-6]。但是，当前的胰岛移植仍存在供胰需要量大，胰岛移植物存活率低等问题，因此，胰岛移植的远期疗效仍不乐观^[7-8]。

造成这些问题的主要原因有：移植早期供胰岛缺血缺氧损伤、氧化应激，胰岛入血后即刻发生的血液介导的炎性反应以及免疫攻击等。随着胰岛移植例数的逐年增加，心死亡供体器官的利用成为热点问题，心死亡供体供胰不可避免地经历了一段热缺血损伤^[9]。众多研究普遍认为，热缺血时间超过30 min，对大鼠胰岛分离纯化可产生明显影响，胰岛产量会减少，可以导致自体移植的功能衰竭。而如何防止缺血缺氧诱导的细胞死亡并提高胰岛细胞功能成为胰岛移植早期的关键。

胰高血糖素样肽1是一种由小肠产生的肠激素，它能促进胰岛素的产生和分泌，减少胰高血糖素的分泌，延缓胃排空，最显著的作用是在啮齿类动物中通过刺激β细胞再生和抑制凋亡来增加β细胞的数量。然而，在体内胰高血糖素样肽1分泌数分钟后就被二肽酶(DPP-Ⅳ)降解，限制了其临床应用。因此为了提高其治疗上的功效，研究胰高血糖素样肽1的类似物阻止二肽酶的降解应运而生。

Exendin-4是从蜥蜴唾液腺中提取的生物活性肽，是一种胰高血糖素样肽1受体激动剂，与胰高血糖素样肽1具有53%的同源性，与胰高血糖素样肽1有相似的药理学和生物学特性，半衰期长，在保护胰岛细胞、胰岛移植方面有良好的应用前景。目前研究表明，Exendin-4可以激活磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(PKB/Akt)、蛋白激酶A(PKA)等信号分子并通过调节前凋亡蛋白[如caspase-3和多(ADP)核糖聚合酶]和抗凋亡蛋白(如Bcl-2和Bcl-xL)抑制胰岛细胞凋亡^[10-11]。但对于Exendin-4抗β细胞凋亡的信号通路还未完全阐明。本实验在体外应用Exendin-4与热缺血胰岛细胞培养，观察Exendin-4对热缺血胰岛细胞是否有保护，改善胰岛的存活与功能。针对胰岛移植早期缺血的边缘供体如何处理提供有效方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2010年3月至2011年3月在中国医科大学肝胆外科实验室完成。

材料：
实验动物：普通级封闭群成年雄性Wistar大鼠18只，体质量200-250 g，购自中国医科大学动物部。

实验方法：

心死亡供体大鼠热缺血模型的建立：体质量250-300 g雄性Wistar大鼠称质量后，腹腔注射麻醉。腹部正中切口进腹，剪开膈肌，用血管钳夹闭心脏基底部致使心脏停搏，阻断胸主动脉，造成心死亡供体的热缺血模型。

大鼠胰岛分离纯化：采用明尼苏达大学改良法分离、纯化大鼠胰岛。大鼠术前禁食不禁水，将冷的胶原酶V溶液(1.0 g/L)经胆总管逆行注入胰管内，快速完整切取胰腺，再于37 ℃水浴消化15 min。之后采用Ficoll不连续密度梯度离心纯化胰岛，取样用双硫腙染色鉴定，计数并估计纯度，再用丫啶橙/溴乙啶荧光染色法显示细胞存活率。胰岛按公式换算为胰岛当量(IEQ)计数，1 IEQ相当于直径为 150 μm的胰岛团。

胰岛培养及分组：将胰岛接种于RPMI-1640完全培养基中，培养24 h后转皿，除去纤维细胞。完全培养基内含有体积分数10%小牛血清和青霉素100 U/mL，链霉素 100 U/mL；条件为37 ℃，体积分数5%CO₂，95%空气。再将胰岛按20 IEQ/每孔的密度接种于24孔培养板中，根据实验条件随机分为3大组(n=6)，每组包括2个亚组：

胰岛计数：将获取的胰岛取样用双硫腙染色。用加样器在胰岛制备物中重复取3次，50 μL/次，以3∶1的比例与双硫腙混合，室温孵育5-10 min，于倒置显微镜下观察染色情况，并计数被双硫腙染成猩红色的细胞团(用方格测微尺测量，不计数小于50 μm的胰岛)。胰岛按公式换算为胰岛当量(IEQ)计数，1 IEQ相当于直径为150 μm的胰岛团。胰岛数(IEQ)=3次样品中双硫腙阳性细胞团数÷3×20×样本总量(mL)。

胰岛存活率鉴定：用丫啶橙/溴乙啶荧光染色法检测胰岛细胞存活率。丫啶橙为浸润性染料，可侵入活细胞发出绿色荧光；溴乙啶为排斥性染料，不能进入活细胞，与已死亡或正在死亡的细胞的核酸结合，对死细胞染色呈桔黄色或桔红色荧光。存活率=活细胞总数÷(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

胰岛功能检测：通过胰岛素释放实验检验胰岛功能。将10 IEQ胰岛用含低浓度葡萄糖(2.8 mmol/L)的Kreb’s-Hank’s液孵育2 h，再用含有高浓度葡萄糖 (16.7 mmol/L)的Kreb’s-Hank’s液孵育1 h，收集第2小时和第3小时的培养液，检测培养液中胰岛素含量。计算胰岛素释放指数(SI)：SI=第3小时胰岛素含量/第2小时胰岛素含量。实验中设5个复孔。

主要观察指标：①大鼠胰岛的获得量、纯度以及活性鉴定。②大鼠胰岛功能检测结果。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，使用SPSS 17.0统计软件进行方差分析和t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

胰岛移植治疗糖尿病可以实现生理性调节血糖，并且安全简便，利于体外修饰，已经引起了广泛重视^[12]。但胰岛移植仍面临着需要供胰量大、存活率较低等问题。2006年，Shapiro等总结了严格以Edmonton方案为基础的胰岛移植，发现仅有58%的患者获得了胰岛移植成功；而且，长期随访发现，2年后胰岛素不依赖率降至31%^[13]，因此，胰岛移植远期疗效仍不乐观。目前已发现导致胰岛移植效果不理想的原因有很多，主要包括胰岛移植物在制备过程中，即胰岛分离纯化中遭到的损失和破坏；胰岛入血后即刻发生的血液介导的炎性反应；移植早期供胰岛缺血缺氧损伤、氧化应激，以及免疫攻击等。在胰岛分离期间，胶原酶消化和抗凋亡治疗固然十分重要^[14-16]，但是，供胰的缺血性损伤也不容忽视，而心死亡供体器官的利用不可避免地经历了一段热缺血损伤，有效的防止缺血损伤可提高胰岛细胞的生存率和胰岛移植的成功率。

近年来研究发现，胰高血糖素样肽1能刺激胰岛β细胞的增殖和分化，抑制其凋亡，具有促进胰岛素释放，降低血糖，改善糖耐量的作用^[17]。其生物学作用包括^[18-20]：①促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌，有利于组织对葡萄糖的摄取。②抑制餐后胰高血糖素的分泌，减少肝糖的释放。③增强胰岛素的敏感性。④减慢胃的排空。⑤抑制食欲。Exendin-4作为胰高血糖素样肽1的类似物，与胰高血糖素样肽1作用类似，但Exendin-4半衰期较长，因此具有较好的临床应用前景^[21]。多个实验室的工作证实，Exendin-4在体内外均具有促进胰岛β细胞生长和增殖的效应，抑制β细胞凋亡，促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌。使其在临床上用于治疗显性糖尿病、预防糖耐量减低发展为糖尿病以及在促进胰岛移植成功等方面均发挥重要作用^[22-39]。

实验针对大鼠胰岛热缺血时间的研究的基础上，进一步探讨Exendin-4对不同热缺血时间心死亡供体大鼠胰岛细胞是否有保护并改善胰岛的功能。目前为止对供胰耐受热缺血时限仍缺乏定论，但国内外学者研究普遍认为热缺血的安全时限<30 min。本文结果显示在热缺血0，30，45 min 3组中加入10 nmol/L Exendin-4培养24 h后，获得胰岛的数量、纯度、存活率及胰岛的功能均有所提高。热缺血0 min组加入10 nmol/L Exendin-4培养24 h后虽然有所提高，但差异无显著性意义(P > 0.05)，而热缺血30，45 min组加入10 nmol/LExendin-4培养组与未加入Exendin-4培养组相比差有显著性意义(P < 0.05)。这表明，Exendin-4能够对热缺血胰岛细胞进行保护，抑制其凋亡，促进胰岛细胞的葡萄糖依赖性胰岛素分泌。热缺血45 min胰岛细胞加入 10 nmol/L Exendin-4培养组与热缺血30 min单纯培养组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，提示Exendin-4能够延长胰岛热缺血时间。

结论：Exendin-4对不同热缺血时间心死亡供体大鼠胰岛细胞具有保护作用，改善胰岛的存活与功能。其对胰岛移植早期缺血边缘供体的预处理提供有效的方法。

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