恒河猴肝移植模型移植后急性排斥反应时肿瘤坏死因子α的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.003

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (36): 5752-5757.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.003

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恒河猴肝移植模型移植后急性排斥反应时肿瘤坏死因子α的变化

张熙冰，冉江华，刘静，张升宁，李来邦，陈奕明，高杨，李望，李立

昆明医科大学附属甘美医院肝胆胰外科，云南省器官移植研究所肝移植研究中心，云南省昆明市 650011

修回日期:2014-07-11 出版日期:2014-08-30 发布日期:2014-08-30
通讯作者: 冉江华，博士，教授，硕士生导师，昆明医科大学附属甘美医院肝胆胰外科，云南省器官移植研究所肝移植研究中心，云南省昆明市 650011
作者简介:张熙冰，男，1985年生，陕西省商洛市人，汉族，昆明医科大学在读硕士，主要从事肝胆胰外科及器官移植等方面的研究。
基金资助:
昆明市科技局重大项目(08S100304)

Variation of tumor necrosis factor-alpha during acute rejection after liver transplantation in a rhesus monkey

Zhang Xi-bing, Ran Jiang-hua, Liu Jing, Zhang Sheng-ning, Li Lai-bang, Chen Yi-ming, Gao Yang, Li Wang, Li Li

Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, the Affiliated Ganmei Hospital of Kunming Medical University, Liver Transplantation Center of Organ Transplantation Institute of Yunnan Province, Kunming 650011, Yunnan Province, China

Revised:2014-07-11 Online:2014-08-30 Published:2014-08-30
Contact: Ran Jiang-hua, M.D., Professor, Master’s supervisor, Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, the Affiliated Ganmei Hospital of Kunming Medical University, Liver Transplantation Center of Organ Transplantation Institute of Yunnan Province, Kunming 650011, Yunnan Province, China
About author:Zhang Xi-bing, Studying for master’s degree, Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, the Affiliated Ganmei Hospital of Kunming Medical University, Liver Transplantation Center of Organ Transplantation Institute of Yunnan Province, Kunming 650011, Yunnan Province, China
Supported by:
Major Program of Kunming Municipal Science and Technology Department, No. 08S100304

摘要/Abstract

摘要：

背景：肿瘤坏死因子α是一种炎性细胞因子，参与移植免疫反应并增加移植物抗原表达，并在其中发挥着重要作用。
目的：分析恒河猴肝移植后肝组织中肿瘤坏死因子α的变化与急性排斥反应的关系。
方法：采用改良血管袖套+胆道支撑管+动脉吻合法建立稳定的恒河猴肝移植模型，将其随机分为实验组(围手术期不给予免疫抑制治疗)和对照组(围手术期给予免疫抑制治疗)。分别在移植后6，12，24和72 h 4个时间点分别收集血清及肝脏组织，检测肝功指标变化，通过苏木精-伊红染色Banff评分评定其移植排斥反应情况，并最终应用免疫组织化学技术、蛋白印迹分析分别检测肿瘤坏死因子α的表达水平。
结果与结论：实验组和对照组肿瘤坏死因子α的表达在移植后6 h即开始增高，至12 h时达到高峰，24-72 h降低，并且实验组变化最明显。移植后6，12，24和72 h 4个时间点组实验组肿瘤坏死因子α蛋白表达明显高于对照组(P < 0.05)，此变化早于肝组织病理学及肝功能的改变。提示肝移植后肝组织肿瘤坏死因子α的表达水平变化，对肝移植后急性排斥反应的早期诊断具有重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 肝移植, 早期, 急性排斥反应, 恒河猴, 肿瘤坏死因子α

Abstract:

BACKGROUND: Tumor necrosis factor-α is an inflammatory cytokine involved in the immune response and increasing graft antigen expression.
OBJECTIVE: To investigate the relationship between tumor necrosis factor-α in the liver tissue and acute rejection after liver transplantation in a rhesus monkey.
METHODS: Liver transplant models in rhesus monkey were constructed by the improved vascular dual cuff, supporting tube of biliary tract and artery anastomosis method. The successful models were randomly divided into experimental group (no immunosuppressant treatment in perioperative period) and control group (treated by immunosuppressant in perioperative period). Then the blood samples and liver tissue were collected at 6, 12, 24, and 72 hours after surgery. Allograft rejections of liver transplantation were monitored by liver function tests, hematoxylin-eosin staining and Banff score. Finally, the expression level of tumor necrosis factor-α was detected by western blot analysis and immunohistochemistry technique.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression of tumor necrosis factor-α in the experimental group and control group began to increase at 6 hours, reached the peak at 12 hours, and then decreased at 24-72 hours. The changes of expression level were the most obvious in the experimental group. At 6, 12, 24 and 72 hours, the expression of tumor necrosis factor-α in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). This change appeared earlier than pathological changes in the liver and liver function. Variations in the expression of tumor necrosis factor-α after liver transplantation have important implications for early diagnosis of acute rejection after liver transplantation.

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Key words: liver transplantation, acute rejection, tumor necrosis factor-α

中图分类号:

R318

张熙冰，冉江华，刘静，张升宁，李来邦，陈奕明，高杨，李望，李立. 恒河猴肝移植模型移植后急性排斥反应时肿瘤坏死因子α的变化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(36): 5752-5757.

Zhang Xi-bing, Ran Jiang-hua, Liu Jing, Zhang Sheng-ning, Li Lai-bang, Chen Yi-ming, Gao Yang, Li Wang, Li Li. Variation of tumor necrosis factor-alpha during acute rejection after liver transplantation in a rhesus monkey[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(36): 5752-5757.

图/表（结果） 4

2.1 恒河猴肝移植后肝功能的变化 实验组和对照组分别于移植后同时点比较血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸转氨酶和总胆红素3个指标，其中实验组在移植后24，72 h明显高于对照组(P < 0.05)，由于实验组未使用抗免疫排斥药物，而移植后也未使用激素等原因导致肝细胞受到机体炎性细胞的攻击损伤较对照组的严重。随着时间的延长，两组移植后丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸转氨酶和总胆红素，均呈增加趋势，其中6，12 h这3个指标水平比较接近，两组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。随着时间的延长，移植后6，12，24和72 h的肝功能呈逐渐上升趋势，因而两组组内比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。此外，实验组比对照组变化大，尤其在肝移植后24-72 h的变化趋势最为明显，见图1。

2.2 恒河猴肝移植后肝脏组织病理学观察结果 实验组和对照组在移植后6 h，镜下观察：肝组织基本正常，未见排斥反应，见图2中A、E。移植后12 h，苏木精-伊红染色镜下观察：实验组有轻度的排斥反应，Banff评分Ⅰ-Ⅱ级；对照组分级不明确，Banff评Ⅰ-Ⅱ级，见图2中B、F。移植后24 h，苏木精-伊红染色镜下观察：实验组有中度至重度排斥反应，Banff评分Ⅱ-Ⅲ级；对照组有轻度急性排斥反应，Banff评分0-Ⅰ级，见图2中C、G。移植后72 h，苏木精-伊红染色镜下观察：实验组有重度排斥反应，Banff评分Ⅲ级；对照组有轻度急性排斥反应，Banff评分0-Ⅰ级，且该时点两组Banff评分比较，实验组排斥反应程度重于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2中D、H。

2.3 恒河猴肝移植后肿瘤坏死因子α的免疫组织化学的变化 肿瘤坏死因子α的免疫组织化学的变化定位于细胞浆。移植后6 h，两组染色率均明显升高，见图3中A、E。移植后12 h，两组染色率均有所升高，但是实验组较对照组升高更为明显，见图3中B、F。移植后24 h，两组染色率均有所下降，但对照组下降更为明显，见图3中C、G。移植后72 h，两组染色率均有所升高，但是实验组升高更为明显，见图3中D、H。

2.4 恒河猴肝移植后肿瘤坏死因子α蛋白表达变化 肿瘤坏死因子α条带(M_r60 000)，见图4A。与相应β-actin (M_r 42 000)做比值后得到的数据进行统计学分析。整体变化趋势：实验组和对照组，均在6 h开始明显升高，至12 h达到高峰，24，72 h逐渐下降，而实验组虽然在12 h表达达高峰，但24 h突然下降，但72 h又一次出现表达高峰。6，12，24和72 h 4个时间点组实验组肿瘤坏死因子α蛋白表达明显高于对照组，而且同一时间点差异有显著性意义(P = 0.028，0.004，0.002，0.001，< 0.05)，见图4B。

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引言

随着外科手术技术、围手术期处理方法以及免疫抑制剂的发展，肝移植已经成为治疗终末期肝病最有效的方法，它已经被认为是医学发展史上划时代的里程碑。然而移植后急性排斥反应是导致早期移植肝功能障碍和二次移植的主要原因，急性排斥反应的发生和如何早期诊断成为器官移植界需要解决的主要问题^[1-3]。

肿瘤坏死因子是由激活的巨噬细胞和淋巴细胞产生的一类蛋白质细胞因子，由前者产生的是肿瘤坏死因子α，后者产生的称肿瘤坏死因子β(或称淋巴毒素-Lymphoto-xin)。人的肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β基因位于第6对染色体的短臂，小鼠位于第17对染色体上，在Ⅰ类和Ⅲ类主要组织相容性复合物基因的交界处，所有种系的肿瘤坏死因子β基因总是位于肿瘤坏死因子a基因的5’侧。这种连接方式对可溶性分子发挥作用并对调节执行细胞表面识别功能的分子具有重要意义^[4]。成熟的肿瘤坏死因子α由157个氨基酸组成，肿瘤坏死因子β由171个氨基酸组成，在变性情况下，人类肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β的相对分子质量分别为17 000和25 000^[5]。肿瘤坏死因子α主要由巨噬细胞和T细胞分泌，是一种介导移植后免疫排斥反应重要的细胞因子，在肝移植后发生急性排斥反应时，机体肿瘤坏死因子α的变化对于早期诊断急性排斥反应具有重要的意义^[6-7]。

许多细胞因子可影响肿瘤坏死因子的生成，内毒素脂多糖、白细胞介素2、干扰素-γ、补体特别是C5a等可刺激肿瘤坏死因子mRNA的转录和翻译过程，白细胞介素4、白细胞介素6、糖皮质激素和己酮可可碱等可抑制肿瘤坏死因子的合成。肿瘤坏死因子一旦释放，其半衰期仅为7 min(小鼠)和14-18 min(人类)，许多器官如肝、皮肤、胃肠、肾、肺、脾既是肿瘤坏死因子的黏附部位，又是肿瘤坏死因子的降解场所^[8]。

本实验主要探讨恒河猴肝移植术后急性排斥发生时机体肿瘤坏死因子α的变化。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2009年9月至2010年9月在昆明医科大学外总实验室、实验动物中心及昆明医科大学第二附属医院重点实验室完成。

材料：

实验动物：供、受体均为健康的恒河猴，共16只，年龄2-5岁，体质量7.2-11.5 kg，其中受体体质量大于供体。实验动物均由昆明医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(滇)2009-0004，饲养于该中心动物房中，自由进食、水。供体术前不禁食、水，但控制其食物量；受体术前禁食12 h，禁水6 h，受体术前给予头孢唑林钠0.1 g/kg。实验过程中对动物的处置参照国家科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》^[9]。

药品及试剂：实验中使用的甲基泼尼松龙来源于辉瑞制药有限公司；他克莫司来源于安斯泰来制药有限公司；肿瘤坏死因子α多肽抗体购自美国Millipore；肿瘤坏死因子α免疫组织化学检测试剂盒购于美国R＆D公司。

实验方法：

恒河猴原位肝移植模型的建立：采用二袖套法+胆道支撑管建立恒河猴原位肝移植模型^[10-11]。

实验分组：建立恒河猴肝移植模型8例，并随机分为2组，每组4例。实验组(急性排斥组)，肝移植成功后，不给予任何抗排斥处理。对照组，在移植过程中给予甲基泼尼松龙250 mg静脉注射，移植后给予他克莫司抗免疫排斥药物，剂量为0.1 mg/(kg•d)^[12]，分2次给药。

标本采集：实验组和对照组分别在肝移植后6，12，24和72 h 4个时间点各取4个动物样本。麻醉下取标本，抽取静脉血3-5 mL，血样离心(4 ℃，3 000 r/min 10 min)，取上清液，入-80 ℃超低温冰箱保存待测，待标本齐备后，行肝功能、细胞因子等检测。腹壁切开一小切口，取肝脏边缘约0.5 cm×0.5 cm×1 cm大小肝组织4份(遇在各时点前后30 min内死亡的受体动物，亦取同样大小的肝组织及等量下腔静脉血列入该时点样本)，用体积分数4%甲醛固定，苏木精-伊红染色及免疫组织化学检测肿瘤坏死因子α水平。

肝功能检测：取-80 ℃保存待测血清标本行肝功能检测。全自动生化分析仪，用直接活力测定法测定血清丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)及血清总胆红素(total bilirubin，TBIL)的表达变化情况。

组织病理学检查：将固定于甲醛中的肝脏组织制成石蜡切片，用苏木精-伊红染色，光镜下观察急性排斥反应，并根据目前国际公认死亡Banff系统评估标准，将急性免疫排斥反应的病理改变分为4级^[13-14]。

肝组织肿瘤坏死因子α应用免疫组织化学检测：采用免疫组织化学试剂盒按SP法进行肝组织肿瘤坏死因子α免疫组织化学染色^[15]，切片制备完成后在光镜下统一观察染色情况，并进行摄片分析。每张切片随机选取8个×100视野，计算肿瘤坏死因子α免疫组织化学细胞浆着色比率。
肝组织肿瘤坏死因子α应用Western blot检测：采用肿瘤坏死因子α多肽抗体，按Western blot检测方法进行肝组织肿瘤坏死因子α检测^[16]。利用图像分析软件Image-Pro Plus6测定显影条带灰度值，并进行结果分析。
主要观察指标：移植后恒河猴肝脏功能的变化、移植肝组织苏木精-伊红染色排斥反应程度，以及应用免疫组织化学及Western blot检测移植后肝组织中肿瘤坏死因子α表达水平。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示。所有数据分析均采用SPSS 17.0统计软件进行，两组均数比较采用t 检验， P < 0.05为差异有显著性意义。各组病理学AR Banff评分的比较采用秩和检验。

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讨论

在研究肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β的分子结构，发现二者的氨基酸序列组成有35%相同，50%为同源性基因，作用于同一细胞膜受体，产生非常相似的生物学效应，但二者引起生物效应的机制却不同。Matsunaga等^[17-18]研究得出的初步结论为：肿瘤坏死因子β以不同于肿瘤坏死因子α的CAMP蛋白激酶的信息传递途径，将胞外信息传递至胞浆及胞核，然后直接或间接调节基因的表达，抑制对自由基产生起抑制作用的酶(如谷肤甘肽还原酶和超氧化物歧化酶等)的活化，使胞内自由基增加，从而产生细胞毒作用。肿瘤坏死因子的主要生物学作用有：第一，抗肿瘤作用^[19]，其机制可归纳为：①肿瘤坏死因子对肿瘤细胞的直接细胞毒性和细胞阻抑作用。②血管阻塞所致的缺血性坏死。③肿瘤坏死因子对毛细血管内皮细胞的直接细胞毒性作用导致血管损伤。④免疫调节功能。第二，对人类多形核中性白细胞的作用及免疫调节作用^[20-21]：肿瘤坏死因子可刺激多形核中性白细胞，使其吞噬功能明显增强，具有杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞和其他细胞的功能；肿瘤坏死因子可以替代T辅助细胞诱导B淋巴细胞成熟，诱导NK细胞和巨噬细胞使其毒性作用增强，诱导干扰素-γ和白细胞介素的产生等而发挥免疫调节作用。

基于肿瘤坏死因子的上述生物学作用，作者在恒河猴肝移植后的实验组和对照组采用免疫组织化学和Western blot技术检测移植的肝组织的肿瘤坏死因子α的变化情况。结果显示其整体变化趋势：实验组和对照组，均在6 h开始明显升高，至12 h达到高峰，24，72 h逐渐下降，而实验组虽然在12 h表达达高峰，但24 h突然下降，但72 h又一次出现表达高峰。6，12，24和72 h 4个时间点组实验组明显高于对照组，而且同一时间点有显著性差异。与此同时，实验组和对照组术后6，12，24和72 h血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸转氨酶和总胆红素指标在移植后24 h和72 h明显高于对照组。病理学组织活检依然是目前确诊急性排斥反应的金标准，结果实验组在移植后72 h实验组肝脏急性排斥反应组织学表现明显重于对照组，Banff分级评分高于对照组，由此可见急性排斥反应发生时肝功能变化和病理活检均滞后于肿瘤坏死因子α的发生。

受体接受供体移植物后，异体抗原刺激受体的各种免疫活性细胞如巨噬细胞、淋巴细胞、单核细胞等产生系列的细胞因子，重要的有肿瘤坏死因子、白细胞介素2、白细胞介素2R、及干扰素-γ等。这些细胞因子通过^[22-23]：①触发免疫细胞至抗原激活部位。②激活免疫活性细胞。③增加细胞表面抗原包括主要组织相容性复合物Ⅰ类和Ⅱ类的表达。④引发中介细胞因子的产生等过程对移植物产生直接毒性损伤作用和对血管内皮细胞的损伤等，而且常常在免疫细胞激活的早期释放，并可能在周围循环中检测到。因此，测定细胞因子可能成为免疫排斥反应的早期诊断指标。

检测肝移植后急性排斥反应时肿瘤坏死因子的变化有众多文献报道。Kita等^[24-31]发现患者移植后急性排斥反应时血中肿瘤坏死因子α水平增加或表达增强，提示对急性排斥反应的早期诊断价值。Imagawa等^[32]发现肝移植后以少量环孢素A时若肿瘤坏死因子水平为570 ng/L，则诊断急性排斥反应的敏感性为67%，特异性为95%。若以408 ng/L为诊断水平，则敏感性增加到89%，特异性降为88%，并且发现肿瘤坏死因子α水平的升高出现在急性排斥反应的临床诊断前一两天，同时还发现连续监测肝移植患者第1周肿瘤坏死因子α峰值水平有助于预测移植物最终结果。当血浆第1周肿瘤坏死因子α峰值水平>950 ng/L时，78%的患者移植物失功能，与Fuggerl等^[33]一样认为血清肿瘤坏死因子α水平增高提示需尽早行免疫抑制治疗。同样，Bathgate等^[34]和Flach等^[35]检测肝移植后患者血中及移植肝细胞的肿瘤坏死因子α，结果显示肿瘤坏死因子α的基因表达对判定急性排斥反应有较高价值。随着免疫学和分子学生物学检查技术的发展，使得从分子水平研究急性排斥反应的诊断成为现实。目前，国外已应用这些技术检测肝移植急性排斥反应时多种细胞因子的表达，但结果往往相差较大，对急性排斥反应的诊断价值尚不能确定。作者认为造成这种局面的原因主要是研究对象、样本、检测方法和条件存在较大差异。

总之，肝移植后急性排斥反应是一个多因素调控、多环节参与且随术后时间的延长而发生变化的复杂过程，肿瘤坏死因子α的表达变化可作为急性排斥反应早期诊断的参考指标，同时综合各项指标及临床表现来判断是否发生了急性排斥反应及其严重程度，继而为临床治疗提供一定理论依据。

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Variation of tumor necrosis factor-alpha during acute rejection after liver transplantation in a rhesus monkey

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