人脂肪间充质干细胞尾静脉移植治疗大鼠急性肝衰竭

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1630

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (9): 1416-1421.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1630

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人脂肪间充质干细胞尾静脉移植治疗大鼠急性肝衰竭

张德国，谭雪莹，唐楠，黄飞，史光军

青岛大学附属青岛市市立医院肝胆外科，山东省青岛市 266000

修回日期:2018-11-27 出版日期:2019-03-28 发布日期:2019-03-28
通讯作者: 史光军，博士，主任医师，青岛大学附属青岛市市立医院肝胆外科，山东省青岛市 266000
作者简介:张德国，男，1992年生，山东省青岛市人，汉族，青岛大学在读硕士，主要从事肝胆外科基础与临床方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81601617)，项目负责人：谭雪莹；山东省医药卫生科技发展项目(2015WS0324)，项目负责人：谭雪莹

Human adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation via the tail vein for acute liver failure in rats

Zhang Deguo, Tan Xueying, Tang Nan, Huang Fei, Shi Guangjun

Department of Hepatobiliary Surgery, Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China

Revised:2018-11-27 Online:2019-03-28 Published:2019-03-28
Contact: Shi Guangjun, MD, Chief physician, Department of Hepatobiliary Surgery, Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China
About author:Zhang Deguo, Master candidate, Department of Hepatobiliary Surgery, Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81601617 (to TXY); the Medical and Health Science and Technology Development Program of Shandong Province, No. 2015WS0324 (to TXY)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
肝衰竭：是多种因素引起的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血功能障碍、黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。肝衰竭分为急性肝衰竭、亚急性肝衰竭、慢加急性(亚急性)肝衰竭和慢性肝衰竭。近年来，干细胞技术的不断发展，为急性肝衰竭的治疗拓宽了道路。
糖原合成酶激酶3β：是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞周期调节、细胞凋亡以及炎症反应中发挥着关键性作用。近期研究发现糖原合成酶激酶3β能够在急性肝衰竭中发挥免疫学调控作用，且抑制糖原合成酶激酶3β能够有效缓解肝损伤，提示糖原合成酶激酶3β可能成为治疗急性肝衰竭的潜在靶点。

摘要
背景：间充质干细胞对肝衰竭大鼠的肝脏具有保护及修复作用，但具体机制尚未完全明确。
目的：观察人脂肪间充质干细胞尾静脉注射对急性肝衰竭大鼠肝脏损伤的保护作用，并探讨其可能的机制。
方法：将36只SD大鼠(购自青岛市大任富成畜牧有限公司)随机等分为对照组、模型组和移植组。模型组和移植组大鼠通过腹腔注射D-氨基半乳糖建立急性肝衰竭模型。造模1 d后，移植组注射人脂肪间充质干细胞悬液，模型组注射等量生理盐水。细胞移植1 d和3 d，检测血清中丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总胆红素水平。细胞移植3 d，检测血清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素10水平；苏木精-伊红染色观察肝脏病理形态学变化；Western blot检测肝组织中糖原合成酶激酶3β蛋白的表达。
结果与结论：①与模型组相比，移植组血清中丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素10水平降低(P < 0.05)；②移植组肝脏组织炎症反应和变性坏死程度较模型组减轻；③移植组肝组织中糖原合成酶激酶3β活性较模型组减弱(P < 0.05)；④结果表明，人脂肪间充质干细胞可以减轻急性肝衰竭大鼠肝脏炎症反应和病理损伤，改善肝脏功能，其机制可能与抑制糖原合成酶激酶3β活性有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-6926-2354(史光军)

关键词: 肝功能衰竭, 人脂肪间充质干细胞, 脂肪间充质干细胞移植, 血清肿瘤坏死因子α, 糖原合成酶激酶3β, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells can protect and repair the liver of rats with liver failure, but the mechanisms are not completely clear.
OBJECTIVE: To explore the protective effects and related mechanisms of intravenous injection of human adipose-derived mesenchymal stem cells on acute liver failure in rats.
METHODS: Thirty-six Sprague-Dawley rats (provided by Qingdao Daren Fucheng Animal Husbandry Co., Ltd. in China) were randomly divided into control group, model group and transplantation group. Animal models of acute liver failure were established by intraperitoneal injection of D-galactosamine in the model group and the transplantation group. One day after modeling, the rats in the transplantation group were injected with human adipose-derived mesenchymal stem cell suspension, and those in the model group were injected with the same amount of saline. After 1 and 3 days of cell transplantation, the serum levels of alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, and total bilirubin were measured. Three days after cell transplantation, the serum levels of tumor necrosis factor-α, interleukin-6 and interleukin-10 were detected, the pathological changes of the rat liver were observed by hematoxylin-eosin staining, and the activity of glycogen synthase kinase-3β protein in the liver tissue was detected by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, there was a significant reduction in the serum levels of alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, total bilirubin, tumor necrosis factor-α, interleukin-6 and interleukin-10 in the transplantation group (P < 0.05). Inflammation and necrosis of liver tissues in the transplant group were alleviated compared with the model group. The activity of glycogen synthase kinase 3β in the liver tissue of the transplanted group was lower than that of the model group (P < 0.05). Overall, these results indicate that human adipose-derived mesenchymal stem cells can alleviate hepatic inflammation and pathological injury, and improve the liver function in rats with acute hepatic failure. Moreover, the mechanism may be related to the inhibition of glycogen synthase kinase 3β activity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Liver Failure, Acute, Glycogen Synthase Kinase 3, Tissue Engineering

中图分类号:

张德国，谭雪莹，唐楠，黄飞，史光军. 人脂肪间充质干细胞尾静脉移植治疗大鼠急性肝衰竭[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(9): 1416-1421.

Zhang Deguo, Tan Xueying, Tang Nan, Huang Fei, Shi Guangjun. Human adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation via the tail vein for acute liver failure in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(9): 1416-1421.

图/表（结果） 2

2.1 人脂肪间充质干细胞的培养及鉴定结果 分离培养的人脂肪间充质干细胞原代接种于培养瓶，3 d后细胞呈短梭形；5 d后细胞数量增加，呈成纤维细胞样，散在生长；10 d后可见细胞融合达80%左右，呈漩涡状排列，见图1。流式细胞仪检测结果显示人脂肪间充质干细胞高表达CD29、CD49d、CD90，阳性率分别为99.7%，99.5%，99.1%；低表达CD34、CD45，阴性率分别为1.4%，0.1%，见图2。

2.2 实验动物数量分析 每组12只大鼠参加实验，最终36只大鼠进入结果分析。

2.3 各组大鼠肝功能指标变化 模型组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总胆红素水平升高，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。移植组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总胆红素与对照组相比升高，但与同期模型组相比均有明显下降，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.4 各组大鼠血清炎性因子指标变化 模型组大鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素10水平升高，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。移植组大鼠血清炎性因子水平与模型组相比下降，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.5 各组肝脏病理组织学形态 对照组肝脏颜色均匀，肝小叶结构完整清晰，未见坏死及炎性细胞浸润。模型组肝小叶结构破坏明显，肝细胞充血、水肿，可见肝细胞弥漫性坏死，大量炎性细胞浸润。移植组肝细胞坏死程度减轻，炎性细胞浸润减少，见图5。

2.6 各组大鼠肝脏组织糖原合成酶激酶3β表达 糖原合成酶激酶3β第9位丝氨酸位点磷酸化越强，活性越弱。Western blot结果显示，模型组糖原合成酶激酶3β的磷酸化水平较对照组减弱，移植组较模型组的磷酸化水平升高，而总糖原合成酶激酶3β水平无明显改变，见图6。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年5月至2018年5月在青岛市市立医院肝胆外科细胞移植实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康雄性SD大鼠36只，6-8周龄，体质量190-210 g，购自青岛市大任富成畜牧有限公司。

1.3.2 实验用主要试剂及仪器 α-MEM培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)；Ⅰ型胶原酶(美国Sigma公司)；大鼠肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素10酶联免疫吸附检测试剂盒(武汉博士德生物公司)；鼠抗人CD29、CD34、CD45、CD49d、CD90单抗(美国eBioscience公司)；兔抗大鼠糖原合成酶激酶3β、磷酸化糖原合成酶激酶3β抗体(美国Cell Signaling公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；恒温培养箱(美国Thermo公司)；离心机(德国Eppendorf公司)；显微镜(日本Nikon公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人脂肪间充质干细胞的分离与培养 取手术后废弃的人体腹部脂肪组织(已签署知情同意协议书)，PBS洗涤3次去除杂质后剪碎至糊状；加入0.1%Ⅰ型胶原酶，37 ℃恒温下置于摇床振荡消化60 min；终止消化后用200目筛网过滤，所获得的细胞悬液以2 500 r/min离心10 min后弃上清，沉淀用含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM完全培养基重悬，接种于25 cm²培养瓶中，置于37 ℃含体积分数为5% CO₂培养箱中培养；每2 d更换1次培养基，待细胞生长至80%融合时，用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化传代。

1.4.2 流式细胞仪检测脂肪间充质干细胞表面分子标记 取第3代人脂肪间充质干细胞，用胰酶消化后制成单细胞悬液，分别加入由FITC标记的小鼠抗人CD29、CD34、CD45、CD49d、CD90单抗，通过流式细胞仪检测细胞表面分子标记的表达。

1.4.3 动物分组及模型建立 将36只SD大鼠随机分为对照组、模型组和移植组，每组12只。模型组、移植组大鼠以1.4 g/kg的剂量通过腹腔注射D-氨基半乳糖建立大鼠肝衰竭模型，对照组腹腔注射等量的生理盐水。

1.4.4 脂肪间充质干细胞移植 造模1 d后，移植组经尾静脉注射人脂肪间充质干细胞悬液1 mL(含细胞数量约3.0×10⁶个)，模型组尾静脉注射等量生理盐水，对照组不予处理。

1.5 主要观察指标

1.5.1 肝功能及炎性因子水平 细胞移植后1 d和3 d，每组每个时间点分别麻醉处死6只大鼠，取下腔静脉血，用全自动分析仪检测不同时间点血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总胆红素水平。细胞移植后3 d，酶联免疫吸附法检测血清炎性因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素10水平。

1.5.2 肝脏组织病理形态 细胞移植后3 d，取大鼠相同部位肝脏组织用体积分数为4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片后苏木精和伊红染色，光学显微镜下观察肝脏组织病理学变化。

1.5.3 肝脏组织糖原合成酶激酶3β活性 细胞移植后3 d，取大鼠肝脏组织加入预冷的RIPA裂解液，冰浴下充分匀浆，4 ℃下12 000 r/min离心15 min，BCA试剂盒测定蛋白浓度。取40 μg蛋白上样，12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白转膜；封闭液室温下封闭2 h，一抗(1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次；二抗室温孵育1 h，TBST漂洗后加入适量ECL发光试剂显影。通过Image J软件分析蛋白条带灰度值，以磷酸化糖原合成酶激酶3β/糖原合成酶激酶3β的比值计算蛋白相对表达水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 23.0统计软件进行数据处理，实验数据以x(_)±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，各组之间的两两比较用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

急性肝衰竭病程进展快、并发症多、治疗难度大，导致患者病死率高、预后差。急性肝衰竭发病机制非常复杂，是当前肝病研究的热点和难点。大量研究表明，肝衰竭的发病机制主要为肝细胞的直接损伤和免疫损伤^[9-10]。在致病因素对肝细胞直接损伤的基础上，以细胞因子大量分泌为代表的免疫损伤是急性肝衰竭发病的中心环节^[11]。

近年来，随着组织工程研究的不断深入和发展，干细胞移植成为一种新兴的治疗方法。间充质干细胞来源广泛，可从脂肪、骨髓、胎盘等多种人体组织中分离获得。与其他间充质干细胞相比，脂肪间充质干细胞具有取材容易、扩增能力强、不存在伦理问题等优点，因而具有更加广阔的临床应用前景^[12]。然而，间充质干细胞的鉴定尚无统一标准，目前主要通过细胞形态、细胞表面分子以及细胞诱导后具有成骨、成脂多向分化能力等方面进行鉴定。该实验体外分离得到的人脂肪间充质干细胞能够贴壁生长，呈长梭形，融合时可见漩涡状生长，与前期研究报道的形态特征基本一致。通过流式细胞仪检测发现，分离得到的人脂肪间充质干细胞高表达分子CD29、CD49d、CD90，几乎不表达分子CD34、CD45，符合国际细胞治疗协会对间充质干细胞定义的鉴定标准^[13-14]，从而证明实验分离获得的为脂肪间充质干细胞。

相关动物实验和临床试验研究表明，注射间充质干细胞后可以通过以下几个方面发挥作用：①间充质干细胞迁移到肝组织，通过分化成肝细胞或与肝细胞融合修复受损肝脏；②间充质干细胞可以对多种细胞发挥调节作用，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞，从而改善肝脏炎症反应；③间充质干细胞可以合成多种生长因子和细胞因子，并且可通过旁分泌作用促进坏死肝细胞的再生^[15-17]。间充质干细胞治疗肝衰竭的具体机制尚未完全明确，其安全性和有效性还需进一步的研究。该研究采用腹腔注射D-氨基半乳糖建立大鼠急性肝衰竭模型，与对照组相比，模型组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和总胆红素水平明显升高，肝组织苏木精-伊红染色有明显的变性坏死，提示模型建立成功。在移植人脂肪间充质干细胞后，大鼠肝功能指标逐渐恢复，血清炎性因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素10水平下降，肝细胞坏死程度明显减轻，这与之前的研究结果相同^[18-20]。上述结果说明人脂肪间充质干细胞可抑制炎症反应及肝细胞变性坏死，对大鼠急性肝衰竭具有一定的治疗作用。

糖原合成酶激酶3β是一种丝氨酸/苏氨酸类激酶，广泛存在于真核生物中，该酶通过使底物磷酸化而参与调节物质代谢、细胞生长及炎症反应等多种细胞活动，在细胞凋亡、细胞分化和炎症反应等方面扮演着重要的角色^[21-24]。研究表明，糖原合成酶激酶3β能够通过激活NF-κB炎症信号通路、增强IRF3固有免疫反应、促进氧化应激以及抑制自噬等多种机制调控急性肝衰竭免疫炎症反应，在急性肝衰竭发生中发挥着重要作用^[25]。在由脓毒症和脂多糖诱导的急性肝衰竭以及病毒感染相关性急性肝衰竭中，肝细胞坏死的同时糖原合成酶激酶3β的活性增高；而给予糖原合成酶激酶3β抑制剂抑制活性后，肝细胞的坏死程度明显减弱，肝脏功能明显好转^[26-30]。研究表明，抑制糖原合成酶激酶3β活性减少了促炎因子白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的产生并且增加了抗炎因子白细胞介素10的产生，从而抑制炎症反应和缓解肝脏损伤，保护肝脏功能^[26^，^30]。该研究结果发现，随着大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和总胆红素水平的升高，急性肝衰竭大鼠肝组织糖原合成酶激酶3β活性增强，同时促炎因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6以及抗炎因子白细胞介素10水平增加，从而促进了肝脏炎症反应和肝功能的恶化。而移植人脂肪间充质干细胞后，大鼠肝组织中糖原合成酶激酶3β活性下降，降低了促炎因子的产生，肝功能指标好转，提示人脂肪间充质干细胞能够抑制糖原合成酶激酶3β活性，从而改善急性肝衰竭大鼠的免疫状况，减轻肝组织炎性损伤，促进肝功能恢复。

综上所述，腹腔注射D-氨基半乳糖建立大鼠急性肝衰竭模型，人脂肪间充质干细胞尾静脉注射可以减轻急性肝衰竭大鼠肝脏炎症反应和病理损伤，改善肝脏功能，其机制可能与抑制糖原合成酶激酶3β活性有关，进一步明确了干细胞的治疗机制，为干细胞移植治疗急性肝衰竭提供了理论依据。

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