单中心两种方法检测280例群体反应性抗体的对比分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.05.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：液态芯片技术(Luminex)检测方法是近年来兴起的检测方法，应用液相芯片技术检测抗群体反应抗体，具有灵敏度高，特异性强，检测干扰少，高通量等优点。

目的：比较ELISA和Luminex两种方法对肾脏病患者血清标本中群体反应性抗体的检测差异及灵敏度。

方法：选取280例肾脏病患者血清标本，同时应用ELISA和Luminex两种方法检测群体反应性抗体阳性率，并运用配对四格表资料的χ²检验进行统计学分析。

结果与结论：ELISA法检测群体反应性抗体阳性率为18.9%，Luminex法检测群体反应性抗体阳性率为33.6%。ELISA法检出抗HLA-Ⅰ类抗体和抗HLA-Ⅱ类抗体阳性率分别为12.8%和12.5%；Luminex法检出抗HLA-Ⅰ类抗体和抗HLA-Ⅱ类抗体阳性率分别为25.0%和20.7%。Luminex法的阳性检出率明显高于ELlSA法且Luminex法能准确检测到低浓度抗体。配对四格表资料的χ²检验P < 0.01，显示两种方法检测肾脏病患者群体反应性抗体结果差异有显著性意义。结果显示与ELISA法相比，Luminex技术具有更高的灵敏度和准确性，更适合应用于临床检测。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 肾移植, Luminex, ELISA, 群体反应性抗体, 肾脏病患者

Abstract:

BACKGROUND: Liquid chip techniques (Luminex) is a recently rising method for detecting anti-panel reactive antibody, which is characterized by high sensitivity, and strong specificity, less interference and high flux.

OBJECTIVE: To compare the sensitivity and detection difference of panel reactive antibody in serum of kidney disease patients detected by enzyme-linked immunosorbent assay and Luminex.

METHODS: Serum samples of 280 patients with kidney disease were selected. The enzyme-linked immunosorbent assay and Luminex methods were used to measure positive rate of panel reactive antibody. Chi-square test for fourfold table data was utilized for statistical analysis.

RESULTS AND CONCLUSION: The positive rates of panel reactive antibody were respectively 18.9% and 33.6% as detected by enzyme-linked immunosorbent assay and Luminex method. The positive rates of anti-HLA-I antibody and anti-HLA-II antibody were respectively 12.8% and 12.5%, as detected by enzyme-linked immunosorbent assay. The positive rates of anti-HLA-I antibody and anti-HLA-II antibody were respectively 25.0% and 20.7%, as detected by Luminex method. Positive detection rate was significantly higher in the Luminex group than that in the enzyme-linked immunosorbent assay group. Moreover, Luminex method could precisely detect the low-concentration antibody. Chi-square test for fourfold table data showed P < 0.01. Significant differences in the differences of panel reactive antibody of kidney disease patients were detected between the two methods. Results demonstrated that compared with enzyme-linked immunosorbent assay, Luminex method is more sensitive and accurate, and more suitable for clinical detection.

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Key words: kidney transplantation, enzyme-linked immunosorbent assay, microchip analytical procedures, HLA antigens

中图分类号:

R318

匡国杰，武洪文，周文强，肖漓. 单中心两种方法检测280例群体反应性抗体的对比分析[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(5): 767-772.

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图/表（结果） 2

2.1 两种方法检测群体反应性抗体的阳性率比较 选取的280例血清样本中，Luminex-PRA阳性(Ⅰ类阳性且/或Ⅱ类阳性)血清样本94例，占总数的33.6%；ELISA-PRA阳性(Ⅰ类阳性且/或Ⅱ类阳性)血清样本53例，占总数的18.9%；Luminex-PRA法的阳性检出率明显高于ELlSA-PRA法(χ² =15.51，P < 0.01，表1)。

2.2 两种方法检测HLA-Ⅰ类抗体的阳性率比较 Luminex检测抗HLA-Ⅰ类抗体阳性为70例，占总数的25.0%，ELISA检测抗HLA-Ⅰ类抗体阳性为36例，占总数的12.8%，两种方法检测抗HLA-Ⅰ类抗体结果的符合率为87.8%(246/280)。配对卡方检验(McNemar Test)，显示两种方法所测结果差异有显著性意义(χ²=13.45，P < 0.01，表1)。这与王庆华等^[17]研究结果一致。

2.3 两种方法检测HLA-Ⅱ类抗体的阳性率比较 Luminex方法检测抗HLA-Ⅱ类阳性为58例，占总数的20.7%，ELISA检测抗HLA-Ⅱ类阳性为35例，占总数的12.5%，两种方法检测抗HLA-Ⅱ类抗体的结果符合率为91.78%(257/280)。配对χ²检验(McNemar Test)，显示两种方法所测结果差异有显著性意义(χ² =6.82，P < 0.01，表1)。

初筛检测HLA-Ⅰ类抗体，ELISA-PRA阴性/ Luminex-PRA阳性血清34例，分别应用PRA/Luminex方法做确定，Luminex检测结果百分比值最高值34%，最低值10%，其中1例免疫荧光强度(BCM)值为9 563，其余均< 4 000(即弱阳性)，而ELISA确定检测为阴性。

检测HLA-Ⅱ类抗体，ELISA-PRA阴性/Luminex-PRA阳性血清23例，Luminex检测结果百分比值最高为20%、最低为6%，平均荧光强度(BCM)值均< 3 652(即弱阳性)，ELISA确定结果为阴性。由此得出酶联免疫吸附方法对低浓度的HLA抗体不敏感。

作者还发现了1例应用Luminex技术进行单抗原微珠抗体检测到了DQ位点，这是酶联免疫吸附试验无法检测到的。

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引言

群体反应性抗体(panel reactive antibody，PRA)是指群体反应性抗人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)的抗体。接受器官移植、输血、妊娠是产生群体反应性抗体的重要因素^[1-2]。按照不同分类标准，抗HLA抗体可有多种类型：Ⅰ类抗体、Ⅱ类抗体，IgG，IgM，供体特异性、供体非特异性等^[3]。本研究主要检测HLA-Ⅰ类抗体，HLA-Ⅱ类抗体。最近的一些研究认为Ⅰ类、Ⅱ类抗HLA抗体出现都与急性排斥反应、慢性排斥反应有关^[4-8]。目前，群体反应性抗体在器官移植中，特别是在肾脏移植中得到广泛的重视。

群体反应性抗体是决定肾移植患者手术是否可行及预测肾移植后急性排斥反应的良好指标。移植前致敏，即移植前群体反应抗体或淋巴毒交叉试验阳性的患者，移植后排斥反应的发生率会明显增加，导致移植物存活率下降^[3-4^，^9-11]。国内外研究表明，肾移植前对受者抗HLA抗体进行监测，对预测移植风险、避免排斥反应的发生等具有重要意义^[12]。当受者体内预存HLA抗体，特别是有供者特异性HLA抗体时，若移植前能够及时检测出此类抗体，在选择供者上可避开具有相应抗原的供者，则可避免潜在的免疫反应的发生^[13-14]。而在肾移植后出现HLA抗体，则大多会发生排斥反应，如治疗延缓则可导致移植失败^[1]。所以能够及时准确的检测出肾移植受者手术前后群体反应性抗体的水平及特异性，对指导临床选择合适供者、监测免疫状态具有重要意义。

目前临床上多应用酶联免疫吸附方法(ELISA法)检测群体反应性抗体，随着科学技术水平的提高，液态芯片技术(Luminex)成为一种新型的检测技术逐渐应用于临床。液态芯片，是美国Luminex公司在流式细胞技术、ELISA技术和芯片技术和芯片技术基础上推出的多重分析技术平台，其最大特点是一次反应最多可同时检测500种指标，是惟一得到美国FAD批准的，也是惟一被纳入美国临床实验室质控网络的高通量诊断技术^[15]，被国际世界专家评价为临床诊断趋势性技术之一。随着抗HLA抗体检测方法灵敏度的进一步提高，移植受者体内抗HLA抗体的检出率上升到95%，几乎所有的移植排斥反应均可检测到抗HLA抗体^[16-17]。本试验的目的在于初步比较Luminex法与ELISA法检测血清标本中群体反应性抗体的效果。

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材料方法

设计：观察性实验。

时间及地点：于2013年1至7月在解放军第309医院器官移植研究室完成。

材料：

血清标本：选取2013年1至7月在解放军第309医院等待肾移植患者和肾移植后患者血清标本共280例。

仪器：

ELISA：瑞士TECAN公司酶标测试仪M200、北京东方荣盛生物科技有限公司提供的 Wellwash 4 MK2 全自动洗板机。

Luminex：美国Luminex100、江苏麒麟医用微量震荡器。

试剂：

ELISA：美国GTI公司提供的HLA筛查试剂盒(QUIKSCREEN针对HLA-Ⅰ类抗体、 B-SCREEN针对HLA-Ⅱ类抗体)；HLA抗体确定试剂盒(QUIK-ID CLASSⅠ、C2ID CLASSⅡ)。

Luminex：美国Luminex提供的LIFECODES LMX试剂盒；LIFECODES ID CLASSⅠ、LIFECODES ID CLASSⅡ试剂盒。

方法：

ELISA法操作步骤：选取ddH₂O稀释10×洗脱液，每孔区250 μL润板10 min；弃去洗脱液，在微孔内加入 50 μL稀释液稀释后的患者血清，封膜后在电热恒温箱孵育30 min。应用Wellwash 4 MK2 全自动洗板机洗板4次，甩干，再加入由碱性磷酸盐标记的抗人免疫球蛋白试剂(Anti-IgG)50 μL，电热恒温箱孵育30 min。重复洗板4次，甩干，加入用ddH₂O溶解好的PNPPhe底物按1∶100的浓度稀释，每孔取100 μL显色15-20 min，在加入氢氧化钠终止液使反应停止。最后，使用瑞士TECAN公司酶标测试仪M200于405 nm波长处读取数据。采用GTI公司提供的电脑软件分析ELISA阳性血清中的HLA抗体特异性及百分比值。

Luminex法操作步骤：在Millipore反应孔中加入ddH₂O润湿滤膜2-5 min。真空泵抽掉ddH₂O(控制真空压力，压力过强会使珠子与膜粘连无法悬浮，从而导致 Luminex读珠子数失败，抽真空时，使用的压力大小以能够使孔内液体下降较缓慢为宜)，每个反应孔中加入20 μL Wash Buffer，相应孔中加入7 μL样本血清以及3 μL阴阳性对照血清。每孔加入2.5 μL Beads(用前充分混匀微珠，以保证每个反应孔都加入足量的微珠，否则会影响上机读板时间以及结果的判读)，平板振荡器室温避光孵育30 min；应用真空泵洗涤除去没有结合的抗体或其他杂质，再加入PE标记的二抗，置于平板振荡器室温避光孵育30 min，应用Wash buffer洗涤Millipore微孔板(洗涤不充分，会降低二抗与微珠上结合IgG的能力，导致假阴性结果)，再用真空泵抽掉液体，此步骤重复3次。最后通过Luminex平台获取特异性结合微珠的荧光信号，再利用软件分析得到特异性抗原类型。

主要观察指标：①两种方法检测出群体反应性抗体阳性的范围(即阳性百分比)。②Luminex检测出抗体的平均荧光强度值。

统计学分析：应用SPSS 13.0软件，对比ELISA法和Luminex法检测HLA-Ⅰ类、Ⅱ类结果，运用配对四格表资料的χ²检验，P < 0.01为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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讨论

群体反应性抗体一直是器官移植学科的研究重点。有研究表明即使预存少量的供者特异性抗体也能导致移植后短期内发生急性体液性排斥反应，影响移植肾的存活率^[18-19]。还有研究报道，发生严重排斥反应的受者群体反应性抗体(PRA)升高，移植前群体反应性抗体> 50%的肾移植受者，移植肾存活率只有59%，1年存活率比群体反应性抗体<50%者低26%。所以移植前检测抗群体反应抗体有助于减少排斥反应的发生，移植后有助于及时判断排斥反应的类型，有利于做出相应的治疗方案。目前在器官移植临床和科研实践中，液相芯片技术(Luminex)广泛用于检测受者血清中抗同种异体移植物的相关抗体，其灵敏度远高于常规的补体介导的细胞毒试验和ELISA等方法^[20]。

酶联免疫吸附试验(ELISA)检测群体反应抗体，是将已知的抗原吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。本方法操作步骤复杂，灵敏度不高，低浓度的抗体不易检出，并且容易因受到试剂、标本、人工操作和环境等各方面因素的影响，而出现假阳性或假阴性结果。后来的研究发现，EIISA法不能灵敏准确的检测出所有抗HLA抗体^[21]。

Luminex方法是集流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术^[22-26]。该方法是在微米级聚合物微球中装入不同发光波长和强度水平组合的荧光材料，根据两种染料比例的不同可以将微球分成100种，每一种拥有一个编号^[27-28]，每种微球因为内部荧光比例的不同，具有特定的光谱特征，可被激光特异的识别^[²⁹^]；分析过程中，不同编号的微球包被不同的探针分子，检测样品中的目的分子，目的分子再与带有荧光的报告分子结合(图1)。检测时，同流式细胞仪相似，Luninex100检测系统将反应微球单个排列送入检测通道，每一个微球单独检测。该仪器同时发射红色和绿色两种激光，同时检测微球上的红色分类荧光和报告分子上绿色荧光强度，红色激光用于鉴别微球，即可知探针种类，绿色激光用于分析报告分子，并将结果通过光电倍增体系转换成数值输出，系统对微球得到的信号值进行统计，确定检测物的种类和数量。由于每种微球具有特定的荧光光谱，可被特异的识别出来，所以可以将不同编码的微球标记不同的探针分子，混合在一个反应体系中。检测一个样本，最大限度可以同时使用100种微球标记100种探针分子，检测一个样本中100种目的分子。

液相芯片与固相芯片最大区别在于，液相芯片完全在液相中进行生物反应，反应环境更接近于自然状态，有利于保持生物分子的空间构象和生物活性，反应动力学好，反应充分，速度快，无需洗涤；固相芯片只有一种分子处于游离状态可以自由移动，需要一个固相溶解沉积过程，反应速度慢，不充分。Luminex液相芯片主要有以下优点^[30-33]：①高通量：可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行实时、定性、定量分析。根据荧光素的比例不同可以将微球分成100种，每种荧光微珠包被着不同的纯化的HLA抗原，从而可识别100种不同的抗体，获得比较精确的检测结果，采用真空抽滤洗涤的方法有效避免了多次洗板等人工操作带来的误差。而传统免疫分析法一次只能检测一个项目。②样本用量少：由于在同一个反应孔中可以同时完成100种不同的生物学反应，所以显著节省了样本用量，此种试验方法仅需要少量的血清(7 μL)就可以同时检测群体反应Ⅰ类和Ⅱ类的抗体，故此方法应用于群体反应抗体检测是抗体检测技术的一大进步。③操作简单、快速^[34]：由于是基于液相反应动力学，因此反应速度快，孵育时间比传统的固相检测短。④灵敏度高：微球表面积大，每个微球上可包被100 000个捕获抗体，如此高密度的捕获抗体保证了能够最大程度地与样本中的抗原分子结合，提高检测灵敏度^[35-36]。⑤准确性高：微球上的报告分子荧光强度与结合的待测分子成正比。由于液相芯片技术的检测范围大，因此不需要像ELISA检测中那样需将样本多倍稀释，从而减小了误差。⑥重复性好：这是由于：第一，与ELISA依靠酶放大作用的比色读数相比，液相芯片技术中的荧光读值更加直接、稳定、灵敏；第二，每种微球检测100个，最终取荧光强度的中值作为结果，这相当于对每个样本重复检测了100次，而ELISA仅为双复孔或三复孔，因此液相芯片检测结果的准确性和重复性是ELISA无法比拟的。⑦费用低：同时检测一个样本中的多项指标可节约时间、样本、试剂、耗材和劳动，降低检测成本。由于液相芯片具有上述优势，其在药物筛选、临床诊断以及基础研究中得到广泛的应用。目前，液相芯片检测领域包括细胞因子、病原微生物、基因突变以及HLA、基因表达分析、细胞信号转导途径研究等方面^[37-39]。

人类白细胞抗原(HLA)是一组免疫系统中通过多态性表现功能性的糖蛋白，在人类免疫系统中起着重要的作用。然而，作为一个高度多态性的系统，HLA分子可以成为在器官移植后排斥反应的过程中产生的抗体反应的目标。这些特异性抗体对移植物的存活起着重要的影响。实验将待测血清与包被了特异性抗原的微珠加入到Millipore微孔板中，经过孵育，若血清中存在HLA抗体则可与微珠上的抗原结合，利用抽真空方法洗涤去没有结合的抗体或其他杂质，再加入PE标记的二抗染色，孵育后，通过Luminex平台获取特异性结合微珠的荧光信号，再利用软件分析得到特异性抗原类型。检测结果以免疫荧光强度均值(BCM)表示，其值>1 000为阳性，1 000-4 000为弱阳性，4 000-10 000为中阳性，>10 000为强阳性。将检测出现单抗原微珠抗体的位点与供者的HLA位点进行比较，从而判断是否进行移植手术。

文献报道，Luminex技术灵敏度和特异性都远远高于以ELISA为代表的传统检测受者抗HLA抗体水平的技术^[⁴⁰^-⁴²^]。这两种方法都是将纯化的HLA抗原固定在固体介质上。ELISA-PRA方法将抗原固定在聚苯乙烯微量滴定板上，Luminex-PRA方法将抗原固定在微球上，待测血清与之混合孵化，再加带标记的二抗(山羊-抗-人IgG)放大反应的信号，区别在于ELISA方法采用酶标二抗，酶标仪检测酶催化底物反应的颜色，而Luminex-PRA方法是采用更准确的液相芯片技术直接检测结合上二抗的微球荧光。从方法学上分析，两者原理类似，结果具有相关性，但Luminex-PRA方法在技术上决定了最后的信号的检测更灵敏和准确。

目前最常用ELISA方法检测抗HLA抗体，其结果不受IgM的干扰和其他因素的影响，定型和定量同时完成，受到I临床的高度重视。但有资料表明，ELISA阴性的患者在接受移植后，依然会发生超急性排斥反应或急性排斥反应，不能灵敏准确的检测出所有的抗HLA抗体^[43]。国内王庆华等^[44]以接受亲属活体肾移植的34例受者为研究对象，术前采集受者血清，同时应用Luminex技术与ELISA方法进行抗HLA-Ⅰ类、Ⅱ类抗体检测，并且记录术后早期急性排斥反应发生情况。结果用Luminex技术检测抗HLA-Ⅰ类抗体阳性率为41.2%(14/34)，检测抗HLA-Ⅱ类抗体阳性率为38.2%(13/34)；用ELISA方法检测抗HLA-Ⅰ类抗体阳性率为2.9%(1/34)，检测抗HLA-Ⅱ类抗体阳性率为8.8%(3/34)；两种方法检测抗HLA-Ⅰ类、Ⅱ类抗体阳性率的差异有显著性意义(P < 0.05)。用Luminex技术检测18例术前抗体阳性者中有8例术后早期发生急性排斥反应(占44.4%)；16例术前抗体阴性者中，有2例术后早期发生急性排斥反应(占12.5%)。用ELISA方法检测例术前抗体阳性者中，有3例术后早期发生急性排斥反应(占75.0%)；30例术前抗体阴性者中，有7例术后早期发生急性排斥反应(占23.3%)。结果显示Luminex技术检测肾移植受者抗HLA抗体的检出阳性率高于ELISA方法，对于移植后早期急性排斥反应的监测可以提供有用的信息。本文通过对比两种方法所测结果可以发现，Luminex-PRA方法的阳性检出率33.6%(Ⅰ类25.0%，Ⅱ类20.7%)明显高于ELISA-PRA方法的阳性检出率18.9%(Ⅰ类12.8%，Ⅱ类12.5%)，配对卡方检验(McNemarTest)P < 0.01，二者检测PRA结果差异显著。HLA-Ⅰ类抗体的结果，ELISA-PRA阴性/Luminex-PRA阳性血清34例，PRA结果百分比值集中在10%-34%之间。HLA-Ⅱ类抗体的结果，ELISA-PRA阴性/Luminex-PRA阳性血清23例，PRA结果百分比值集中在6%-20%之间。由此得出酶联免疫吸附方法对低浓度的抗HLA抗体不敏感。两种方法检出差异主要集中在低浓度区。在此低浓度区很可能存在抗供者特异性抗体，移植前预存有抗供者特异性抗体，将影响术后移植肾功能和长期存活^[⁴^5-⁴^7]。Luminex准确分析出供者特异性抗体，帮助排除不合适的供者，尤其是对于活体肾移植中有捐肾意愿的亲属，可以避免不必要的损失，减少供体肾资源的浪费，保证良好的社会效益^[⁴^8]。两种方法在检测群体反应抗体结果有统计学意义，证实了Luminex技术使群体反应抗体分析的敏感性得到进一步提高，移植前检测出低浓度的群体反应抗体，能更准确的预测移植物功能的丧失和免疫学排斥反应事件的发生，保障真正的群体反应抗体阴性获得安全性系数更高的移植^[⁴⁹^]。

Luminex检测技术与ELISA法相比，具有特异性好、高通量、高敏感、重复性好、成本低、检测样本用量少、客观可靠等优点^[50]，能为临床提供更精准，更具体的信息。为临床提供了一种可靠的预测体液性排斥的指标，对于减少移植后排斥反应，提高移植成功率具有一定的临床意义。