羧甲基壳聚糖对体外培养许旺细胞增殖及核因子κB表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.03.010

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明羧甲基壳聚糖对多种细胞具有促增殖作用，但其对许旺细胞增殖的影响及具体作用机制有待进一步探索。
目的：观察羧甲基壳聚糖对许旺细胞的促增殖作用，以及其对许旺细胞内核因子κB表达及活性的影响。
方法：取对数生长期的SD乳鼠许旺细胞细胞悬液接种于96孔板，分别以PBS、0，10，50，100，200，500，1 000 mg/L羧甲基壳聚糖培养24 h，采用CCK-8法检测细胞增殖。取对数生长期的SD乳鼠许旺细胞，胰酶消化后制备成细胞悬液，接种于6孔细胞培养板内，分别加入50 mg/L羧甲基壳聚糖、100 mg/L羧甲基壳聚糖、200 mg/L羧甲基壳聚糖、PBS培养24 h，进行BrdU、Real-time PCR及Western blot法检测。
结果与结论：CCK-8及BrdU检测结果表明羧甲基壳聚糖在50-1 000 mg/L范围内可促进许旺细胞增殖，200-500 mg/L时促增殖效应最明显。Real-time PCR及Western blot结果表明50-200 mg/L羧甲基壳聚糖可促进许旺细胞内核因子κB mRNA及蛋白的表达，且具有浓度依赖性。表明羧甲基壳聚糖可促进体外培养许旺细胞的增殖及其核因子κB的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 组织工程神经材料, 羧甲基壳聚糖, 许旺细胞, 增殖, 核因子κB, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Carboxymethylated chitosan is shown to promote some kinds of cells proliferation, but its effects on proliferation of Schwann cells need further studies.
OBJECTIVE: To investigate the effects of carboxymethylated chitosan on proliferation of Schwann cells and expression of nuclear factor-κB in cultured Schwann cells.
METHODS: Schwann cells from Sprague-Dawley rats at logarithmic growth phase were seeded in 96-well plates, and cultured respectively with PBS, 0, 10, 50, 100, 200, 500, 1 000 mg/L carboxymethyl chitosan for 24 hours. Cell proliferation was detected using the cell counting kit-8 assay. After trypsin digestion, Schwann cells from Sprague-Dawley rats at logarithmic growth phase were used to prepare cell suspensions, which were seeded in 6-well cell culture plates and cultured respectively with 50, 100 and 200 mg/L carboxymethyl chitosan and PBS for 24 hours. Then, 5-bromo-2-deoxyuridine, real-time PCR and western blot assay were performed.
RESULTS AND CONCLUSION: Cell counting kit-8 and 5-bromo-2-deoxyuridine detection results showed that carboxymethyl chitosan at 50-1000 mg/L, especially at 200-500 mg/L, could promote Schwann cell proliferation. Real-time PCR and western blot results showed 50-200 mg/L carboxymethyl chitosan could promote nuclear factor κB mRNA and protein expression in Schwann cells in a dose-dependent manner, suggesting carboxymethyl chitosan can promote Schwann cell proliferation and expression of nuclear factor-κB in Schwann cells cultured in vitro.

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Key words: biocompatible materials, chitosan, cell proliferation, NF-kappa B

中图分类号:

R318

贺斌，陶海鹰，卫爱林，刘世清. 羧甲基壳聚糖对体外培养许旺细胞增殖及核因子κB表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(3): 389-394.

He Bin, Tao Hai-ying, Wei Ai-lin, Liu Shi-qing . Carboxymethylated chitosan effects on proliferation of Schwann cells and expression of nuclear factor kappa B[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(3): 389-394.

图/表（结果） 3

2.1 许旺细胞的体外培养及鉴定结果 根据Theodor Schwann于1939年首次对许旺细胞进行的报道，许旺细胞在光镜下呈梭形、体积小、有两极，胞核明显、呈卵圆形，通过倒置显微镜观察发现实验所得细胞形态(图1A)。倒置荧光显微镜观察S-100免疫荧光染色标记许旺细胞，发现阳性细胞>95%(图1B)。

2.2 羧甲基壳聚糖对许旺细胞增殖的影响 各组分别加入0，10，50，100，200，500，1 000 mg/L羧甲基壳聚糖，加入羧甲基壳聚糖前各组细胞均经过无血清培养24 h，使各组细胞均处于同一细胞周期，加入羧甲基壳聚糖后 24 h通过CCK-8检测羧甲基壳聚糖对许旺细胞增殖的影响，结果表明羧甲基壳聚糖在50-1 000 mg/L范围内可促进体外培养许旺细胞增殖，其最佳作用质量浓度为200- 500 mg/L(图3A)。

BrdU检测结果表明，羧甲基壳聚糖在50-200 mg/L范围内可增加BrdU染色阳性细胞，进一步表明羧甲基壳聚糖可促进许旺细胞增殖(图2，图3B)。

2.3 羧甲基壳聚糖对许旺细胞内核因子κB mRNA表达的影响 使用Real-time PCR技术对核因子κB基因mRNA进行扩增，结果表明羧甲基壳聚糖在50-200 mg/L范围内可使核因子κB mRNA表达上调，并且随着羧甲基壳聚糖质量浓度的增加，核因子κB mRNA表达增高，差异有显著性意义(P < 0.05)(图4A)。

2.4 羧甲基壳聚糖对许旺细胞内核因子κB蛋白表达的影响 使用Western blot免疫印迹法检测羧甲基壳聚糖对许旺细胞内核因子κB蛋白表达的影响，结果表明羧甲基壳聚糖在50-200 mg/L范围内可增加许旺细胞内核因子κB蛋白的表达，且随着羧甲基壳聚糖质量浓度的增加，核因子κB蛋白表达增高，差异有显著性意义(P < 0.05)(图4B)。

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引言

材料方法

设计：细胞增殖检测、细胞因子表达检测。

时间及地点：实验于武汉大学人民医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：出生三四天SD大鼠鼠婴20只，由武汉大学医学部实验动物中心提供，动物质量合格证号：SYXK(鄂)2003-0013。实验过程中对动物的处置符合科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》中的有关规定^[19]。

实验方法：

许旺细胞的培养及纯化：取SD大鼠鼠婴，如Brockes等^[20]的描述，分离双侧坐骨神经，用灭菌PBS冲洗3次，然后置于青瓶内，加入D-Hank’s液漂洗3次，于青瓶内加入适量混合酶(0.25%胰酶+0.03%Ⅱ型胶原酶)将坐骨神经组织剪碎，置于37 ℃环境下消化30 min，离心，弃上清。加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基约 5 mL，于37 ℃，含体积分数5%CO₂培养箱中培养30 min，通过差速贴壁、10^-5 mmol/L阿糖胞苷及不同胶原酶处理纯化许旺细胞^[21]。

许旺细胞的鉴定^[9]：取生长良好的六孔板培养许旺细胞，PBS洗涤细胞3次，加入40 g/L预冷多聚甲醛，冰上放置10 min；PBS再次洗涤细胞3次，每次5 min；将1% Triton-100溶液5 mL加入到细胞培养板内，置于37 ℃环境下孵育20 min，灭菌常温PBS洗涤细胞3次，加入正常羊血清3 mL于培养板内，置于37 ℃封闭5 min，加入灭菌常温PBS洗涤1次；滴入稀释后的兔抗鼠S-100抗体2.0- 3.0 mL(1∶200)，置于4 ℃冰箱内过夜；加入灭菌常温PBS洗涤细胞3次，每次5 min；加羊抗兔IgG-FITC抗体，室温避光室温孵育30 min，PBS洗涤3次，每次5 min；倒置荧光显微镜下观察并计数，胞浆呈绿色者为阳性细胞^[22]。

CCK-8检测细胞增殖^[9]：取处于对数生长期的传2代许旺细胞，0.25%胰蛋白酶消细胞化制成单细胞悬液， 1 000 r/min离心5 min，离心半径6 cm，弃上清，加入含有体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，调整细胞浓度为1×10⁷ L^-1，将细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后，加入无血清培养基培养24 h。分别加入PBS及不同质量浓度羧甲基壳聚糖，调整羧甲基壳聚糖的终浓度为0，10，50，100，200，500，1 000 mg/L，置于37 ℃培养箱中培养24 h，在终止培养前2 h每孔细胞加入CCK-8试剂20 μL，于酶标仪上检测450 nm波长下各孔的吸光度(A)值；如此重复6次。采用以下公式计算各组增殖：细胞增殖率=(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%

BrdU检测细胞增殖：实验通过BrdU免疫荧光染色测定羧甲基壳聚糖对许旺细胞内DNA合成的影响。取处于对数生长期的传2代许旺细胞，细胞浓度为(4.0-5.0)×10⁹ L^-1，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37℃含体积分数5%CO₂的培养箱中培养，实验分为4组，分别加入等量PBS(空白对照组)、50，100，200 mg/L羧甲基壳聚糖培养24 h，无血清培养过夜，加入200 mmol/L BrdU染色液培养16 h，PBS洗涤细胞3次，40 g/L多聚甲醛溶液室温固定 10 min，利用Triton X-100破膜，加入DNase Ⅰ(0.5 U/mL)于37 ℃孵育30 min，PBS洗涤3次，加入抗BrdU一抗4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3遍，加入二抗置于室温孵育1 h，Hoehcst33342细胞核染色15 min，PBS洗涤3遍，倒置荧光显微镜下观察BrdU染色情况，计数阳性细胞数目。

Real-time PCR检测细胞核因子κB mRNA的表达：取处于对数生长期的传2代许旺细胞，细胞浓度为(4.0-5.0)× 10⁹L^-1，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37 ℃含体积分数5%CO₂的培养箱中培养，实验分为4组，分别加入等量PBS(空白对照组)、50，100， 200 mg/L羧甲基壳聚糖，培养24 h后提取RNA。使用Trizol法提取，将RNA溶于DEPC处理的无菌水中，测定RNA的浓度(A₂₆₀/A₂₈₀>1.8)以确保RNA的纯度。应用大连宝生物工程有限公司提供的RT试剂盒，将提取的mRNA反转录为cDNA。采用SYBR Green Ⅰ染料进行标记，通过ABI 7500 Real-time PCR系统对核因子κB 的表达进行分析。PCR反应条件为：95 ℃变性10 s；95 ℃ 5 s，循环40次后；60 ℃延伸30 s，然后得到标准曲线。在实验中GAPDH作为内参，通过与内参的比较来得到各种基因的相对表达量。结果以Ct值表示，通过ΔΔCt 法进行分析。

Western blot检测核因子κB蛋白表达：取传2代许旺细胞，细胞浓度为(4.0-5.0)×10⁹ L^-1，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37 ℃含体积分数5% CO₂的培养箱中培养，实验分为4组，分别加入等量PBS(空白对照组)、50，100，200 mg/L羧甲基壳聚糖，作用24 h后提取总蛋白。加入细胞裂解液100 μL于细胞培养板，冰上裂解5 min，4 ℃低温12 000 r/min离心5 min，离心半径6 cm，使用BCA蛋白定量试剂盒行蛋白定量。取样品约 15 μg加入SDS-PAGE凝胶电泳中，转膜，加入5%PBS-M 5 mL，室温封闭1 h，加入兔抗鼠NF-κB及β-actin一抗 (1∶200)，置于4 ℃过夜。0.1% PBS-T漂洗3次，每次 10 min；加入HRP标记羊抗兔二抗(1∶10 000)，室温孵育2 h，PBS-T漂洗3次，每次10 min；ECL化学发光剂反应、曝光，Bio-Rad图像分析软件处理。

主要观察指标：羧甲基壳聚糖对许旺细胞增殖及其核因子κB表达的影响。

统计学分析：由第二作采用SPSS 16.0软件进行统计处理，数据以x(_)±s表示，应用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

许旺细胞是周围神经系统最主要的胶质细胞，许旺细胞具有重要生物学活性，能分泌多种蛋白，如神经生长因子、睫状神经营养因子、脑源性神经生长因子、成纤维细胞生长因子等，这些因子对周围神经的生长发育、再生和修复起着关键作用。运用组织工程技术移植许旺细胞修复损伤周围神经成为近年来的研究热点，初步研究证实其颇具应用前景^[23-26] 。如前所述，许旺细胞增殖缓慢一直是该技术领域研究的难点，因此寻找一种合适的许旺细胞增殖促进因子对组织工程修复神经损伤意义深远。羧甲基壳聚糖是壳聚糖的水溶性衍生物，是具有多种理化特性的生物分子，具有良好的生物兼容性^[27] ，可促进细胞增殖^[28-29] ，而且还可促进体外坐骨神经的修复^[30] 。前期研究表明羧甲基壳聚糖可以防止骨关节炎软骨细胞发生退变，并可抑制骨关节炎软骨细胞发生凋亡。羧甲基壳聚糖可促进急性肝衰竭肝脏细胞的再生^[31] ，对胰岛素抵抗具有一定的治疗作用^[32] 。
实验中体外分离培养、纯化许旺细胞，并通过S-100免疫荧光染色标记鉴定，发现培养的细胞为S100标记阳性细胞，说明实验培养及纯化许旺细胞的方法可行。由于许旺细胞增殖在周围神经损伤再生及组织工程中起着重要作用，因此实验通过CCK-8及BrdU等方法检测不同质量浓度羧甲基壳聚糖对体外培养许旺细胞增殖的影响，结果均表明羧甲基壳聚糖在50-200 mg/L范围内可促进许旺细胞增殖，并呈递增趋势，当羧甲基壳聚糖质量浓度为200 mg/L时促许旺细胞增殖效应最明显。在实验中通过CCK-8检测中发现当羧甲基壳聚糖质量浓度为50-1 000 mg/L时能够明显刺激许旺细胞的增殖，且当其在50-200 mg/L范围时许旺细胞的增殖细胞百分比随羧甲基壳聚糖质量浓度的增加而显著增加，但当羧甲基壳聚糖质量浓度超过200 mg/L达到500 mg/L时，许旺细胞的增殖细胞百分比没有明显上升，且进一步增加羧甲基壳聚糖质量浓度达到1000 mg/L时，许旺细胞的增殖细胞百分比反而有所下降，因此确定BrdU、PCR、Western blot检测中羧甲基壳聚糖质量浓度为50-200 mg/L。
核因子κB是近年来研究发现的一个重要的细胞内基因转录调控蛋白，越来越受到广大学者的研究与重视，核因子κB广泛参与细胞增殖、细胞分化、免疫、炎症反应等过程。研究表明核因子κB具有抗凋亡、促增殖的生物学作用。核因子κB信号转导通路是细胞内重要的信号传递通路[33]。核因子κB为一个转录因子蛋白家族，包括5个亚单位：Rel (cRel)、p65 (RelA, 核因子κB3)、RelB和p50(核因子κB1)、p52(核因子κB2)。其中p65/p50异源二聚体是核因子κB的典型结合形式，其中p50的主要作用是与DNA结合，p65的主要作用是参与基因转录的起始调节，具有激活转录的功能。在静息的细胞中，核因子κB和IκB形成复合体，以无活性形式存在于胞浆中。当细胞受细胞外信号或丝裂原刺激后，IκB激酶复合体(IκB kinase, IKK)活化将IκB磷酸化，使核因子κB暴露核定位位点，此时胞内的核因子κB即可被激活，游离的核因子κB迅速移位到细胞核，与特异性核因子κB序列结合，从而可以诱导胞内相关基因转录，发挥调节基因转录与促进细胞增殖的作用[34]。有学者研究表明核因子κB及其下游调控的信号通路在许旺细胞增殖中起着重要的作用[35-36]。实验通过Real-time PCR及Western blot检测羧甲基壳聚糖对许旺细胞内核因子κB基因及蛋白表达的影响，结果表明羧甲基壳聚糖在50-200 mg/L范围内可促进许旺细胞内核因子κB基因及蛋白的表达，这可能是羧甲基壳聚糖促进许旺细胞增殖的机制之一。
实验将羧甲基壳聚糖作用于许旺细胞，发现羧甲基壳聚糖在50-1000 mg/L范围内可促进体外培养许旺细胞增殖，羧甲基壳聚糖在50-200 mg/L范围时，许旺细胞的增殖随羧甲基壳聚糖质量浓度的增加而增加，同时能够促进早期转录因子核因子κB表达，实验的实施为进一步探讨羧甲基壳聚糖促进许旺细胞的增殖机制及羧甲基壳聚糖用于神经组织工程奠定了基础。

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文章快阅

延伸阅读

实验中体外分离培养、纯化许旺细胞，并通过S-100免疫荧光染色标记鉴定，发现培养的细胞为S100标记阳性细胞，说明实验培养及纯化许旺细胞的方法可行。由于许旺细胞增殖在周围神经损伤再生及组织工程中起着重要作用，因此实验通过CCK-8及BrdU等方法检测不同质量浓度羧甲基壳聚糖对体外培养许旺细胞增殖的影响，结果均表明羧甲基壳聚糖在50-200 mg/L范围内可促进许旺细胞增殖，并呈递增趋势，当羧甲基壳聚糖质量浓度为200 mg/L时促许旺细胞增殖效应最明显。在实验中通过CCK-8检测中发现当羧甲基壳聚糖质量浓度为50-1000 mg/L时能够明显刺激许旺细胞的增殖，且当其在50-200 mg/L范围时许旺细胞的增殖细胞百分比随羧甲基壳聚糖质量浓度的增加而显著增加，但当羧甲基壳聚糖质量浓度超过200 mg/L达到500 mg/L时，许旺细胞的增殖细胞百分比没有明显上升，且进一步增加羧甲基壳聚糖质量浓度达到1000 mg/L时，许旺细胞的增殖细胞百分比反而有所下降，因此确定BrdU、PCR、Western blot检测中羧甲基壳聚糖质量浓度为50-200 mg/L。
　　核因子κB是近年来研究发现的一个重要的细胞内基因转录调控蛋白，越来越受到广大学者的研究与重视，核因子κB广泛参与细胞增殖、细胞分化、免疫、炎症反应等过程。研究表明核因子κB具有抗凋亡、促增殖的生物学作用。核因子κB信号转导通路是细胞内重要的信号传递通路。核因子κB为一个转录因子蛋白家族，包括5个亚单位：Rel (cRel)、p65 (RelA, 核因子κB3)、RelB和p50(核因子κB1)、p52(核因子κB2)。其中p65/p50异源二聚体是核因子κB的典型结合形式，其中p50的主要作用是与DNA结合，p65的主要作用是参与基因转录的起始调节，具有激活转录的功能。在静息的细胞中，核因子κB 和IκB形成复合体，以无活性形式存在于胞浆中。当细胞受细胞外信号或丝裂原刺激后，IκB激酶复合体（IκB kinase, IKK）活化将IκB磷酸化，使核因子κB暴露核定位位点，此时胞内的核因子κB即可被激活，游离的核因子κB迅速移位到细胞核，与特异性核因子κB序列结合，从而可以诱导胞内相关基因转录，发挥调节基因转录与促进细胞增殖的作用。有学者研究表明核因子κB及其下游调控的信号通路在许旺细胞增殖中起着重要的作用。实验通过Real-time PCR及Western blot检测羧甲基壳聚糖对许旺细胞内核因子κB基因及蛋白表达的影响，结果表明羧甲基壳聚糖在50-200 mg/L范围内可促进许旺细胞内核因子κB基因及蛋白的表达，这可能是羧甲基壳聚糖促进许旺细胞增殖的机制之一。

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