分子影像学方法示踪胚胎干细胞移植治疗急性肝损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.016

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (36): 6481-6488.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.016

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分子影像学方法示踪胚胎干细胞移植治疗急性肝损伤

姚欣鹏^1，2，徐旸²，张璐¹，冷良²，苏位君²，王丽娜²，童玲玲²，李宗金2，孔德领¹

¹南开大学生物活性材料教育部重点实验室，天津市 300071；²南开大学医学院，天津市 300071

收稿日期:2013-02-16 修回日期:2013-02-25 出版日期:2013-09-03 发布日期:2013-09-03
通讯作者: 李宗金，博士，教授，南开大学医学院，天津市 300071 zongjinli@nankai.edu.cn 徐旸，博士，讲师，南开大学医学院，天津市 300071 yangxu@nankai.edu.cn
作者简介:姚欣鹏☆，男，1987年生，黑龙江省勃利县人，汉族，南开大学生命科学学院在读博士，主要从事干细胞治疗与分子影像技术的研究。 yxpeng8744@163.com
基金资助:
国家重大基础研究计划资助项目(2010CB94500)*

Molecular imaging for tracking transplanted embryonic stem cells in the treatment of acute liver injury

Yao Xin-peng^1,2, Xu Yang², Zhang Lu¹, Leng Liang², Su Wei-jun², Wang Li-na², Tong Ling-ling², Li Zong-jin², Kong De-ling¹

¹Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Nankai University, Tianjin 300071, China; ²School of Medicine, Nankai University, Tianjin 300071, China

Received:2013-02-16 Revised:2013-02-25 Online:2013-09-03 Published:2013-09-03
Contact: Li Zong-jin, M.D., Professor, School of Medicine, Nankai University, Tianjin 300071, China zongjinli@nankai.edu.cn Xu Yang, M.D., Lecturer, School of Medicine, Nankai University, Tianjin 300071, China yangxu@nankai.edu.cn
About author:Yao Xin-peng☆, Studying for doctorate, Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Nankai University, Tianjin 300071, China; School of Medicine, Nankai University, Tianjin 300071, China yxpeng8744@163.com
Supported by:
the National Basic Research Key Program of China, No. 2010CB94500*

摘要/Abstract

摘要：

背景：胚胎干细胞具有多向分化潜能，已被用于急性肝损伤的治疗，但其在体内治疗过程中的增殖迁移情况尚不清楚。
目的：利用分子影像技术监测移植胚胎干细胞在急性肝损伤修复过程中的行为。
方法：利用慢病毒载体，将萤火虫荧光素酶、红色荧光蛋白以及单纯疱疹病毒胸苷激酶三融合基因转入小鼠胚胎干细胞(D3)中，筛选得到稳定整合3个报告基因的D3胚胎干细胞系。将上述胚胎干细胞或分化了6 d的拟胚体细胞通过脾脏注射到急性肝损伤SV129模型小鼠体内，利用生物发光成像技术监测移植的细胞。
结果与结论：RT-PCR结果显示，三融合基因的转入并未影响胚胎干细胞Oct-4和Nanog的表达。利用小动物活体成像系统可以观察到移植细胞从脾脏迁移到肝脏的过程。移植的胚胎干细胞和拟胚体细胞都在肝脏处形成畸胎瘤，由于单纯疱疹病毒胸苷激酶同时也是自杀基因，可以与更昔洛韦作用诱导转基因细胞死亡，通过注射更昔洛韦来抑制畸胎瘤的生长并逐步将其杀死。组织学分析显示，畸胎瘤里包含来自于3个胚层的组织。提示三融合基因的转入并未影响胚胎干细胞的多向分化潜能，且胚胎干细胞用于细胞治疗有潜在的成瘤风险，影响了对肝损伤的修复，治疗策略有待进一步改进，并需要实时监控其在体内的行为。

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 胚胎干细胞, 畸胎瘤, 基因, 转基因, 自杀

Abstract:

BACKGROUND: Embryonic stem cells have the capacity of multi-differentiation potential, and have been utilized for the therapy of acute liver injury. However, the migration and proliferation of embryonic stem cells after transplantation remains not well characterized.
OBJECTIVE: To track the transplanted embryonic stem cells in repairing acute liver injury by bioluminescence imaging technology.
METHODS: Murine embryonic stem cells (D3) were transducted with a construct composed of firefly luciferase, monomeric red fluorescence protein and herpes simplex virus truncated thymidine kinase triple fusion reporter genes by lentivirus system. Stable D3 embryonic stem cells integrating three report genes were screened. The undifferentiated embryonic stem cells or differentiated embryonic stem cells from the 6-day-old embryoid body were transplanted into acute liver injury model of SV129 mouse through spleen, and the transplanted cells were monitored by bioluminescence imaging technology.
RESULTS AND CONCLUSION: Reverse transcription PCR results showed that the expression level of Oct-4 and Nanog was not affected in embryonic stem cells transducted with triple fusion reporter gene compared with wild-type embryonic stem cells. The migration process of transplanted cells was visualized by bioluminescence imaging technology. Teratomas were found in both triple fusion-embryonic stem cells treatment group and triple fusion-embryoid body cells treatment group at liver, and the teratoma formation could be suppressed by ganciclovir administration because ganciclovir can react with herpes simplex virus truncated thymidine kinase and trigger cell necrosis process. Histological analysis showed that teratomas comprised tissues from all three germ layers. These results demonstrate that triple gene fusion does not affect differentiation potential of embryonic stem cells and it is risky to utilize embryonic stem cells for cell therapy, because it affects repair of liver injury. The therapy strategy requires further improvement and real-time visualizing of embryonic stem cells in vivo is absolutely necessary.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, embryonic stem cells, teratoma, genes, transgenic, suicide

中图分类号:

R394.2

姚欣鹏，徐旸，张璐，冷良，苏位君，王丽娜，童玲玲，李宗金，孔德领. 分子影像学方法示踪胚胎干细胞移植治疗急性肝损伤[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(36): 6481-6488.

Yao Xin-peng, Xu Yang, Zhang Lu, Leng Liang, Su Wei-jun, Wang Li-na, Tong Ling-ling, Li Zong-jin, Kong De-ling. Molecular imaging for tracking transplanted embryonic stem cells in the treatment of acute liver injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(36): 6481-6488.

图/表（结果） 6

2.1 三融合报告基因标记的小鼠胚胎干细胞系的建立与全能性鉴定结果 如图1A所示，构建了pUbiquitin启动子启动的，萤火虫荧光素酶、红色荧光蛋白以及单纯疱疹病毒胸苷激酶三融合报告基因，利用慢病毒系统将其导入D3胚胎干细胞中，利用流式细胞仪分选出红色荧光蛋白阳性的细胞继续培养，得到三融合报告基因标记的胚胎干细胞系，在荧光显微镜下可以看到分选得到的转基因胚胎干细胞100%表达红色荧光蛋白，见图1B。向细胞培养基中加入萤火虫荧光素酶的底物D-luciferin，利用小动物活体成像仪可观察到转基因胚胎干细胞发出的荧光信号，如图1C。为了考察慢病毒介导基因转导过程是否会对胚胎干细胞的全能性造成影响，实验利用RT-PCR的方法鉴定未转基因的D3胚胎干细胞和D3转基因胚胎干细胞中胚胎干细胞的标志分子Oct-4和Nanog基因的表达情况^[13-14]，结果显示上述2种基因在2株细胞系的表达水平基本相当，一定程度上说明三融合基因的导入并未影响胚胎干细胞的全能性，见图1D。

2.2 拟胚体的形成与早期肝细胞标志分子的表达 用不含白血病抑制因子的培养基并在玻璃培养皿上培养转基因的胚胎干细胞 2 d，可观察到胚胎干细胞形成球状拟胚体，后转移至明胶包被的六孔板中继续培养4 d。分别提取转基因胚胎干细胞和转基因的拟胚体细胞的RNA，通过RT-PCR方法鉴定2种细胞中早期肝细胞标志分子的表达情况。从图2可以看出，拟胚体细胞中早期肝细胞标志性分子运甲状腺素蛋白和甲胎蛋白的表达水平远远高于胚胎干细胞，说明经过6 d的随机分化，拟胚体中已出现早期肝细胞，也证明了胚胎干细胞可以向肝细胞方向分化，可用于肝损伤的修复。

2.3 细胞数量与荧光信号强度标准曲线绘制结果 为了建立细胞数量与荧光信号强度的标准曲线，将转基因的胚胎干细胞或转基因的拟胚体细胞按图3A所示的数量梯度种于24孔板中，加入D-luciferin后利用Xenogen IVIS小动物活体成像系统观察并测量每孔细胞的荧光信号如图3A，绘制细胞数量-荧光信号标准曲线，反应变量关联度的R2值均大于0.99，说明细胞数量与荧光信号强度成正相关，如图3B。
2.4 转基因胚胎干细胞体内的迁移及增殖情况 转基因胚胎干细胞注射后，从第1天(D1)起，每2 d对移植细胞进行1次成像，直至D14。如图4A所示，在D1时，细胞信号较弱，集中在脾脏部位，随着时间的推移，细胞信号不断增强(见D3)，说明胚胎干细胞在体内不断增殖。到D5时，除了观察到细胞信号进一步增强外，同时观察到细胞信号主要分成两部分，分别在肝脏和脾脏部位，说明已有部分胚胎干细胞迁移到肝脏。随着时间的推移，发现肝脏处的信号逐渐增强，到D14时，信号已覆盖整个腹腔区域，提示可能有畸胎瘤形成。
D14时，将小鼠肝脏取材，进行石蜡切片分析。苏木精-伊红染色结果显示，在小鼠肝组织中发现来自于3个胚层的组织如外胚层的神经管组织、中胚层的软骨组织、内胚层的上皮组织，见图4B，说明胚胎干细胞在肝脏处形成了畸胎瘤。上述现象说明移植的转基因胚胎干细胞可以从脾脏迁移到肝脏，并在肝脏处恶性增殖形成了畸胎瘤。

2.5 转基因拟胚体细胞移植后在体内的行为 见图5。

鉴于直接移植未分化的转基因胚胎干细胞组畸胎瘤的形成，移植来自于分化了6 d的转入三融合报告基因的拟胚体细胞，以期避免畸胎瘤的形成。从图5A中观察到，D14前拟胚体细胞的迁移及增殖行为与胚胎干细胞基本一致，即亦能从脾脏向肝脏迁移，并在肝脏处恶性增殖，形成畸胎瘤。图5C显示了拟胚体细胞移植后在体内的数量变化曲线。单纯疱疹病毒胸苷激酶是种自杀基因，可以与其底物更昔洛韦作用，诱导细胞死亡^[12]。对于移植转基因拟胚体细胞发生恶性增殖的小鼠，期望通过连续腹腔注射更昔洛韦将畸胎瘤清除。从D14始，连续给移植了转基因拟胚体细胞的小鼠注射更昔洛韦，从D18开始，细胞荧光信号开始降低并逐步萎缩，如图5B。至D28时，与未注射更昔洛韦组相比(图5A)，注射组细胞荧光信号已降至较低水平(图5B)，说明畸胎瘤细胞已被部分清除。

2.6 畸胎瘤的组织学观察结果 对转基因拟胚体细胞移植组小鼠肝组织进行石蜡切片、苏木精-伊红染色分析显示，在更昔洛韦阳性/更昔洛韦阴性2组动物的肝脏中都能观察到来自于3个胚层的组织，见图6。说明移植细胞的确在肝脏处形成了畸胎瘤，也间接说明了三融合报告基因的转入对胚胎干细胞的分化全能性没有影响。

参考文献

[1] Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 1981; 292 (5819):154-156.
[2] Segers VF, Lee RT. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature. 2008; 451(7181):937-942.
[3] Schroeder T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 2008; 453(7193):345-351.
[4] Close DM, Hahn RE, Patterson SS, et al. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J Biomed Opt. 2011; 16(4):047003.
[5] Kircher MF, Gambhir SS, Grimm J. Noninvasive cell-tracking methods. Nat Rev Clin Oncol. 2011; 8(11):677-688.
[6] Zanzonico P. Principles of nuclear medicine imaging: planar, SPECT, PET, multi-modality, and autoradiography systems. Radiat Res. 2012; 177(4):349-364.
[7] Kremer AE, Elferink RPJO, Beuers U. Pathophysiology and current management of pruritus in liver disease. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 2011; 35(2):89-97.
[8] Snykers S, De Kock J, Rogiers V, et al. In vitro differentiation of embryonic and adult stem cells into hepatocytes: state of the art. Stem cells. 2009; 27(3):577-605.
[9] Yamada T, Yoshikawa M, Kanda S, et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocyte-like cells identified by cellular uptake of indocyanine green. Stem Cells. 2002; 20(2): 146-154.
[10] Kanda S, Shiroi A, Ouji Y, et al. In vitro differentiation of hepatocyte-like cells from embryonic stem cells promoted by gene transfer of hepatocyte nuclear factor 3 beta. Hepatol Res. 2003; 26(3):225-231.
[11] Chinzei R, Tanaka Y, Shimizu-Saito K, et al. Embryoid-body cells derived from a mouse embryonic stem cell line show differentiation into functional hepatocytes. Hepatology. 2002; 36(1):22-29.
[12] Cao F, Drukker M, Lin S, et al. Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation. Cloning Stem Cells. 2007; 9(1):107-117.
[13] Zaehres H, Lensch MW, Daheron L, et al. High-efficiency RNA interference in human embryonic stem cells. Stem cells. 2005; 23(3):299-305.
[14] Chambers I, Colby D, Robertson M, et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 2003; 113(5):643-655.
[15] Moriya K, Yoshikawa M, Saito K, et al. Embryonic stem cells develop into hepatocytes after intrasplenic transplantation in CCl4-treated mice. World J Gastroenterol. 2007;13(6):866-873.
[16] Wu JC, Chen IY, Sundaresan G, et al. Molecular imaging of cardiac cell transplantation in living animals using optical bioluminescence and positron emission tomography. Circulation. 2003; 108(11):1302-1305.
[17] Chen IY, Wu JC. Cardiovascular Molecular Imaging Focus on Clinical Translation. Circulation. 2011; 123(4):425-443.
[18] Oostendorp M, Douma K, Wagenaar A, et al. Molecular magnetic resonance imaging of myocardial angiogenesis after acute myocardial infarction. Circulation. 2010; 121(6): 775-783.
[19] Wang J, Najjar A, Zhang S, et al. Molecular Imaging of Mesenchymal Stem Cell Mechanistic Insight Into Cardiac Repair After Experimental Myocardial Infarction. Cir Cardiovasc Imaging. 2012; 5(1):94-101.
[20] Li Z, Wu JC, Sheikh AY, et al. Differentiation, survival, and function of embryonic stem cell-derived endothelial cells for ischemic heart disease. Circulation. 2007; 116(11):I46-I54.
[21] Ebert SN, Taylor DG, Nguyen HL, et al. Noninvasive tracking of cardiac embryonic stem cells in vivo using magnetic resonance imaging techniques. Stem Cells. 2007; 25(11): 2936-2944.
[22] Hwang DW, Kang JH, Jeong JM, et al. Noninvasive in vivo monitoring of neuronal differentiation using reporter driven by a neuronal promoter. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2008; 35(1):135-145.
[23] Bossolasco P, Cova L, Levandis G, et al. Noninvasive near-infrared live imaging of human adult mesenchymal stem cells transplanted in a rodent model of Parkinson's disease. Int J Nanomedicine. 2012; 7:435-447.
[24] De Vocht N, Reekmans K, Bergwerf I, et al. Multimodal imaging of stem cell implantation in the central nervous system of mice. J Vis Exp. 2012; (64):e3906.
[25] Ozdemir M, Attar A, Kuzu I, et al. Stem cell therapy in spinal cord injury: in vivo and postmortem tracking of bone marrow mononuclear or mesenchymal stem cells. Stem Cell Rev. 2012; 8(3):953-962.
[26] Wang J, Tian M, Zhang H. PET molecular imaging in stem cell therapy for neurological diseases. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2011; 38(10):1926-1938.
[27] Junt T, Schulze H, Chen Z, et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 2007; 317 (5845):1767-1770.
[28] Barrett O, Sottocornola R, Lo Celso C. In vivo imaging of hematopoietic stem cells in the bone marrow niche. Methods Mol Biol. 2012; 916:231-242.
[29] McCracken MN, Gschweng EH, Nair-Gill E, et al. Long-term in vivo monitoring of mouse and human hematopoietic stem cell engraftment with a human positron emission tomography reporter gene. Pro Natl Acad Sci USA. 2013; 110(5): 1857-1862.
[30] Rosland GV, Svendsen A, Torsvik A, et al. Long-term Cultures of Bone Marrow-Derived Human Mesenchymal Stem Cells Frequently Undergo Spontaneous Malignant Transformation. Cancer Res. 2009; 69(13):5331-5339.
[31] Wang Y, Huso DL, Harrington J, et al. Outgrowth of a transformed cell population derived from normal human BM mesenchymal stem cell culture. Cytotherapy. 2005; 7(6): 509-519.
[32] Monnier D, Gourmelon P, Gorin NC. Clinical-grade production of human mesenchymal stromal cells: occurrence of aneuploidy without transformation. Blood. 2010; 115(8): 1549-1553.
[33] Bernardo ME, Fibbe WE. Safety and efficacy of mesenchymal stromal cell therapy in autoimmune disorders. Ann N Y Acad Sci. 2012; 1266:107-117.
[34] Goldring CE, Duffy PA, Benvenisty N, et al. Assessing the safety of stem cell therapeutics. Cell Stem Cell. 2011; 8(6):618-628.
[35] Gropp M, Shilo V, Vainer G, et al. Standardization of the Teratoma Assay for Analysis of Pluripotency of Human ES Cells and Biosafety of Their Differentiated Progeny. PLoS One. 2012;7(9):e45532. doi: 10.1371/journal.pone.0045532.
[36] Teramoto K, Hara Y, Kumashiro Y, et al. Teratoma formation and hepatocyte differentiation in mouse liver transplanted with mouse embryonic stem cell-derived embryoid bodies. Transplant Proc. 2005; 37(1):285-286.
[37] Bukong TN, Lo T, Szabo G, et al. Novel developmental biology-based protocol of embryonic stem cell differentiation to morphologically sound and functional yet immature hepatocytes. Liver Int. 2012; 32(5):732-741.
[38] Li HY, Chen Y, Chen YJ, et al. Reprogramming induced pluripotent stem cells in the absence of c-Myc for differentiation into hepatocyte-like cells. Biomaterials. 2011; 32(26):5994-6005.
[39] Woo DH, Kim SK, Lim HJ, et al. Direct and Indirect Contribution of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocyte-Like Cells to Liver Repair in Mice. Gastroenterology. 2012; 142(3):602-611.
[40] Cai J, Zhao Y, Liu Y, et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 2007; 45(5):1229-1239.

引言

胚胎干细胞来源于囊胚期的内细胞团，具有多向分化的潜能，因此被广泛应用于各种疾病模型的治疗研究中^[1]。虽然胚胎干细胞在动物实验中，对多种疾病模型都展现出了良好的治疗效果，但由于其较高的免疫原性、伦理争议，尤其是潜在的成瘤风险，显著限制了胚胎干细胞在临床治疗甚至是临床试验上的应用^[2]。体外诱导胚胎干细胞分化为成体细胞再移植策略给胚胎干细胞的应用前景增添了一定可能，但由于现有的技术手段不能确保诱导分化效率达到百分之百，并不能完全排除其潜在的风险，故移植的胚胎干细胞或由胚胎干细胞分化得来的细胞需要实时监控。

传统的基于干细胞移植的疾病治疗手段，对移植的细胞在体内的行为(如增殖、迁移等)，以及发挥治疗功能的机制(如旁分泌或分化等)都不能给出明确的答案，分子影像技术的出现使得上述问题的解决成为可能^[3-4]。常见的分子影像手段主要有生物发光成像技术、MRI技术、单光子放射计算机断层显像术/正电子发射体层摄影技术等，它们各有优缺点，如生物发光成像技术只能捕获活细胞的信号却需要对目的细胞进行转基因操作、MRI技术有很好的空间定位能力却不能区分死活细胞、单光子放射计算机断层显像/正电子发射体层摄影技术的探测灵敏度最高却不能持续示踪较长时间^{[3, 5-6]}。恰当的选择成像手段，能使得对各种生命过程的认识更为全面。

肝脏是人体重要的新陈代谢器官，参与诸如糖原的储存、红细胞的降解、激素合成以及解毒等生理过程，故肝脏的损害将严重威胁人体的生理健康^[7]。在体外，胚胎干细胞可以被诱导分化成为具有成熟生理功能的肝样细胞^[8-10]，移植体内对肝损伤亦有一定的修复效果，但其较高的致瘤风险仍限制了其在临床治疗上的应用^[11]。

针对上述问题，文章提出利用分子影像技术对移植的细胞参与肝损伤修复过程进行实时监控，以期了解细胞在小鼠体内的迁移路线、增殖情况等。实验中同时设置胚胎干细胞治疗组和分化了6 d的拟胚体细胞治疗组，比较二者的致瘤风险，检验能否通过自杀基因控制甚至清除畸胎瘤。

材料方法

设计：细胞学水平，对比观察实验。

时间及地点：于2011年9月至2012年5月在南开大学生物活性材料教育部重点实验室完成。

材料：

实验动物：成年雌性SV129小鼠，体质量16-18 g，来源于北京军事医学科学院实验动物中心，许可证号：SCXK-(军)2007-004。实验中动物的处理符合南开大学实验动物伦理委员会的相关规定。

分子影像学方法示踪胚胎干细胞移植治疗急性肝损伤实验中使用的试剂及仪器：

方法：

小鼠D3胚胎干细胞的培养：小鼠D3胚胎干细胞由斯坦福大学Joseph Wu实验室提供。实验前向25 cm²的培养瓶中加入0.2%的明胶溶液，37 ℃孵育2 h。胚胎干细胞的培养基为85%DMEM、体积分数15%特级胎牛血清、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、1 mmol/L丙酮酸钠、0.1 mmol/L非必需氨基酸、2 mmol/L谷氨酰胺和1 000 U/mL 白血病抑制因子、100 U/mL青霉素和0.1 g/L链霉素。小鼠D3胚胎干细胞约每24 h传代1次，传代比例约为1∶8，接种细胞前将明胶溶液吸弃，置于37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱中培养。

三融合报告基因转基因胚胎干细胞系的建立：利用慢病毒系统将三融合报告基因导入D3胚胎干细胞中，并通过流式细胞仪分选得到稳定整合三融合报告基因的胚胎干细胞系，即三融合报告基因转基因胚胎干细胞系，慢病毒制备、基因转导、流式分选步骤同前述，见文献[12]。

RT-PCR：利用TRIzol Reagent提取细胞总RNA，以GAPDH为内参，分析干细胞标志分子Oct-4和Nanog以及早期肝细胞标志分子运甲状腺素蛋白和甲胎蛋白的表达水平。实验所用的PCR引物序列见表1。

拟胚体形成实验：将转基因胚胎干细胞消化成单细胞，离心收集细胞沉淀，弃上清后用分化培养基(不含白血病抑制因子的胚胎干细胞培养基)重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-¹接种于低黏附的培养皿中，培养 2 d后收集拟胚体接种于明胶包被的六孔板中，继续培养4 d后消化收集拟胚体细胞用于下一步实验。

动物模型的建立与细胞移植：用橄榄油配制10%CCl₄溶液，以5 mL/kg剂量腹腔注射到SV129小鼠体内，连续4周每周注射2次，建立急性肝损伤模型。腹腔注射4%水合氯醛(3.3 mL/kg)麻醉小鼠，剪开腹腔，剥离出脾脏，沿脾脏长轴从其末端用胰岛素注射器注入2×10¹⁰ L^-¹胚胎干细胞/拟胚体细胞悬液，缝合伤口。更昔洛韦注射实验组的小鼠，自细胞移植后的第14天起，每日以50 mg/kg剂量腹腔注射更昔洛韦至取材。

细胞数量-荧光信号强度标准曲线：收集转基因的胚胎干细胞/转基因的拟胚体细胞沉淀，用含有体积分数2%胎牛血清的PBS重悬细胞并调整细胞浓度，向24孔板连续5个孔加入1 mL PBS，后依此向5孔中加入0，0.8×10⁵，1.6×10⁵，3.2×10⁵，6.4×10⁵个细胞，后向每孔中加入10 μL萤火虫荧光素(以15 g/L质量浓度溶于PBS中)，后置于Xenogen IVIS小动物活体成像仪中收集荧光信号，制作标准曲线。

小动物活体成像：用异氟烷将小鼠呼吸麻醉，腹腔注射萤火虫荧光素(126 mg/kg)，15 min后置于Xenogen IVIS小动物活体成像仪中成像。

组织学分析：转基因胚胎干细胞/转基因拟胚体细胞经小鼠脾脏注射后14，28 d取材。用40 g/L多聚甲醛灌注小鼠心脏至肝脏变白，剪下肝脏置于40 g/L多聚甲醛中固定过夜，后梯度脱水、石蜡包埋，连续切片(5 μm)。组织切片脱蜡、复水，用苏木精-伊红染色，封固镜检。

主要观察指标：①RT-PCR技术检测转基因对胚胎干细胞全能性的影响。②RT-PCR技术检测拟胚体中肝脏标志分子的表达情况。③小动物活体成像系统监测移植细胞的迁移与增殖情况。④组织切片与苏木精-伊红染色分析畸胎瘤的形成情况。

讨论

在本工作中，作者利用生物性发光成像系统实时追踪胚胎干细胞和拟胚体细胞移植体内后参与急性肝损伤修复的过程。将三融合报告基因标记的胚胎干细胞/拟胚体细胞注射到小鼠脾脏后，通过小动物活体成像系统追踪到移植细胞从脾脏迁移到肝脏的过程，证明脾注射是向肝脏移植细胞的有效途径^[15]。遗憾的是，无论是转基因胚胎干细胞治疗组还是转基因拟胚体细胞治疗组，实验通过对移植细胞的实时追踪，都观察到了其在肝脏处发生恶性增殖并形成畸胎瘤，影响了胚胎干细胞/ 拟胚体细胞对肝损伤的修复。

文章是首次报道用活体成像系统实时监控移植胚胎干细胞参与急性肝损伤修复过程的研究。在以往的工作中，移植细胞的命运只有将受体动物处死后通过组织学分析才能得知，而这期间它们的诸如迁移、增殖、凋亡、分化、旁分泌等行为都不得而知，使人们不能完全掌握移植细胞参与组织修复的机制，分子影像技术的出现使得这一问题的解决成为可能。如今，分子影像技术已广泛应用于干细胞示踪领域，如在心脏疾病治疗领域^[16-18]，间充质细胞^[19]、胚胎干细胞来源的细胞等被成像分子标记后移植到动物体内^[20-21]，细胞的迁移、存活、增殖情况可以得到实时监控，除此之外，在神经系统疾病的干细胞治疗^[22-26]、造血干细胞移植等领域^[27-29]，分子影像技术也被用来实时追踪移植细胞的行为。干细胞治疗策略的首要任务是要保证移植细胞的生物安全性，细胞在体内外由于所处环境不同，往往会表现出不同的性质，细胞生物安全性体外测试的结果不一定适用于体内情况，如间充质干细胞被广泛用于各种疾病模型的治疗，被认为是较为安全的种子细胞，但也有工作报道其在体内有癌变的可能^[30-31]，虽然其是否能致癌尚无最终定论^[32-33]，但这提醒了对移植细胞进行实时监控的必要性，而分子影像技术势必会在该领域得到更为广泛的应用。

从这次实验可以看出，胚胎干细胞虽然因具有最为强大的多向分化的能力而在干细胞治疗领域被广泛研究，但其自身的生物安全隐患一直是其在临床治疗方面应用的最大障碍。在作者的工作中，移植、迁移到肝脏的细胞，都在小鼠体内形成了畸胎瘤，从而未观察到对急性肝损伤模型有修复作用。目前，关于胚胎干细胞用于干细胞治疗的策略，大家形成了最基本的共识：未分化的胚胎干细胞移植是具有较高的生物安全风险的，诱导分化从而使胚胎干细胞失去多向分化和无限增殖能力是其应用的基本前提^[34-36]。有很多文章报道，胚胎干细胞可以在体外被诱导向肝细胞方向分化^[37-39]，Cai等^[40]在体外利用无血清培养基，结合Activin A、成纤维细胞生长因子4、骨形态生成蛋白2等生长因子，联合诱导胚胎干细胞向肝细胞方向分化，经过18 d的诱导，得到的细胞能表达成熟肝细胞的标志分子，如酪氨酸氨基转移酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、Cyp7A1、Cyp3A4以及Cyp2B6等，同时具有分泌白蛋白、储存糖原、吸收低密度脂蛋白等典型的肝细胞生理功能，说明Cai等^[40]建立的体外诱导路线，的确能将胚胎干细胞诱导成为成熟的肝样细胞。故在日后的工作中，可以将转基因胚胎干细胞先诱导成终末分化的肝样细胞再移植，可能会取得更为良好的治疗效果。

综上所述，未分化或分化不完全的胚胎干细胞移植到体内有较高的形成畸胎瘤的风险，需将胚胎干细胞在体外分化为成熟的肝样细胞再移植，并通过活体成像系统实时监控其在体内的行为，一旦发现恶性增殖现象，可通过自杀基因将其清除。

分子影像学方法示踪胚胎干细胞移植治疗急性肝损伤

Molecular imaging for tracking transplanted embryonic stem cells in the treatment of acute liver injury

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	姬志祥, 蓝常贡. 尿酸盐转运蛋白在痛风中的多态性和治疗相关性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1290-1298.
[4]	李嘉程, 梁学振, 刘金豹, 许波, 李刚. 骨性关节炎mRNA差异表达谱及竞争性内源RNA调控的网络分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1212-1217.
[5]	谭婧玉, 刘海文. 成骨细胞特异因子2基因家族的全基因组鉴定、分类及进化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1243-1248.
[6]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[7]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[8]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[9]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[10]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[11]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[12]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[13]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[14]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[15]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.