纳米载银抗菌剂与四针状氧化锌抗白色念珠菌的性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.25.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：口腔修复材料室温固化甲基丙烯酸甲酯的表面结构疏松多孔，极易附着各种细菌、微生物导致患者义齿性口炎的发生，所以在甲基丙烯酸甲酯中加入抗菌剂成为国内外学者研究的热点。
目的：比较加入纳米载银抗菌剂与四针状氧化锌抗菌剂后，室温固化甲基丙烯酸甲酯对白色念珠菌的抗菌活性。
方法：采用对倍稀释法测定纳米载银抗菌剂与四针状氧化锌抗菌剂对白色念珠菌的最小杀菌浓度。将纳米磷酸锆载银抗菌粉体与四针状氧化锌抗菌剂分别以0%，1%，2%，3%的质量比加入到室温固化甲基丙烯酸甲酯粉剂中，检测各组试件对白色念珠菌的抗菌率。
结果与结论：纳米载银抗菌剂对白色念珠菌的最小杀菌浓度为 40 g/L，四针状氧化锌抗菌剂对白色念珠菌的最小杀菌浓度为25 g/L。未加入纳米载银抗菌剂或四针状氧化锌抗菌剂的甲基丙烯酸甲酯几乎无抗菌活性，加入两种抗菌剂后其抗菌活性明显增加，随着加入抗菌剂质量比的增加，抗菌活性逐渐增强；当抗菌剂质量比增加到3%时，加入纳米载银抗菌剂的甲基丙烯酸甲酯抗菌率为92.23%，加入四针状氧化锌抗菌剂的甲基丙烯酸甲酯抗菌率为98.23%。表明纳米载银抗菌剂与四针状氧化锌抗菌剂对白色念珠菌均有抗菌效果，且四针状氧化锌抗菌剂比纳米载银系抗菌剂抗菌效果好。

关键词: 生物材料, 组织工程口腔材料, 甲基丙烯酸甲酯, 纳米载银, 四针状, 氧化锌, 白色念珠菌, 抗菌剂, 最小杀菌浓度

Abstract:

BACKGROUND: Surface structure of room temperature curing methyl methacrylate is loose and porous, easy to be attached to a variety of bacteria, microbes, leading to the occurrence of denture stomatitis. Thus, antibacterial agent added in methyl methacrylate has been a hot focus in the study.
OBJECTIVE: To compare the antibacterial activity of room temperature curing methyl methacrylate against Candida albicans after addition of the nanometer silver antibacterial agent and tetrapod-like zinc oxide antibacterial agent.
METHODS: Minimum bactericidal concentration of nanometer silver antibacterial agent and tetrapod-like zinc oxide antibacterial agents against Candida albicans was determined by dilution method. The nanometer silver antibacterial agent loaded nanometer zirconium phosphate or tetrapod-like zinc oxide antibacterial agent with 0%, 1%, 2%, 3% mass fraction were added to the room temperature curing methyl methacrylate to detect the antibacterial property against Candida albicans.
RESULTS AND CONCLUSION: The minimum bactericidal concentration of nanometer silver antibacterial agent was 40 g/L. The minimum bactericidal concentration of tetrapod-like zinc oxide agent against Candida albicans was 25 g/L. Methyl methacrylate without addition of nanometer silver antibacterial agent or tetrapod-like zinc oxide antibacterial agent did not have antibacterial activity, and the antibacterial activity significantly increased after addition of the two antibacterial agents. With the increased mass fraction of nanometer silver antibacterial agent or tetrapod-like zinc oxide antibacterial agent, the antibacterial properties of room temperature curing methyl methacrylate increased gradually. At 3% mass fraction, antibacterial rate of methyl methacrylate with nanometer silver antibacterial agent was 92.23%, and the antibacterial rate of methyl methacrylate with the tetrapod-like zinc oxide antibacterial agent was 98.23%. These results indicated that the nanometer silver antibacterial agent and tetrapod-like zinc oxide antibacterial agent have antibacterial effects against Candida albicans, and the tetrapod-like zinc oxide antibacterial agent has a good antibacterial effect compared with the nanometer silver antibacterial agent.

Key words: biomaterials, tissue-engineered oral materials, methyl methacrylate, nanometer silver, tetrapod-like, zinc oxide, Candida albicans, antibacterial agent, minimum bactericidal concentration

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 2

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引言

甲基丙烯酸甲酯材料被广泛用于赝复体的制作，例如可摘活动义齿^[1]、全口总义齿、义颌、个别托盘、重衬义齿等。室温固化甲基丙烯酸甲酯的表面结构疏松多孔，故极易附着各种细菌、微生物；白色念珠菌就是其中的一种，其是龋病和义齿性口炎的主要致病菌^[2]，可导致患者义齿性口炎的发生^[3]，所以解决甲基丙烯酸甲酯的抗菌性成为国内外学者研究的热点。

理想的抗菌剂应该长效、稳定、无毒，具有稳定的生物安全性。无机抗菌剂因其具有良好的生物安全性、稳定持久的抗菌性能被广泛使用在口腔材料中作为抗菌剂。无机抗菌剂的抗菌性是通过离子交换、物理吸附等方法^[4]，将银、锌或金属离子等固定在目标材料中，使抑菌离子在材料中持续稳定的释放，从而达到抑菌抗菌作用^[5]。

无机抗菌剂根据抗菌离子的载体不同可分为磷酸盐系、硅酸盐系、氧化物系、活性炭、络合物等。根据抗菌剂的有效成分不同可分为钛系(具有光催化作用的TiO₂等)抗菌剂和银系(含Ag⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等金属离子)抗菌剂^[6-8]。

晶须是通过人为控制将单晶体形成一种尺寸远小于短纤维的须状单晶体^[9-11]。由于晶须的直径已经成为纳米级结构，所以不存在一些大晶体所存在的理化性质缺陷。这种近似理想状态的结构使得晶须具有高度有序的原子排列结构，具有极高的强度，近似原子间价键的理论强度，这使得该材料成为一种理想的新型力学复合材料，因而各种晶须的研究与开发成为当今科学界的一个热门话题，同时也吸引了更多学者对其的关注^[12-13]。

氧化锌晶须的研发工作开始于20世纪80年代，氧化锌晶须存在单针状和四针状两大类，不同的空间结构可导致氧化锌晶须具有不同的理化特性^[9,14]。单针状氧化锌晶须的理化性质

和应用领域与碳化硅、钛酸钾等晶须相似，具有高强度、高化学惰性、高热稳定性和半导体性；而四针状氧化锌晶须的结构呈空间四面体状，四针状氧化锌晶须中心有一核心，核心直径为0.7-1.4 μm，从核心向4个方向伸展出4根针状晶体，任意两个针状体的夹角为109°，每根针状体均为单晶体微纤维，四根针状体的根部直径为0.5- 14.0 μm，针状体长度为3-200 μm^[15-16]。它是迄今为止被发现的惟一具有三维空间立体结构的四针状晶体，正是由于其独特的三维立体空间结构使他具有高强度、减震、抗菌、吸波等单晶体所不具有的特性，因此，国内外学者对四针状氧化锌晶须的研究比较广泛，同时扩展了其应用领域，通过不断的研究测试其独特结构产生的相应理化特性，所以相关的研究报道也相对较多^[9,11,14-28]。

四针状氧化锌晶须独特的空间三维立体结构和良好的单晶性，使它具有许多独特的功能和较单晶体结构更显著的优点，这使它可在交通、电子、化工、国防等领域广泛应用^[29-39]，其独特的抗菌广谱性、持久性、理化稳定性和生物安全性使得它近年来在医疗领域备受关注并逐渐应用于临床领域。四针状氧化锌晶须独有的空间结构，使得它与其他复合材料中的基体结合更加紧密，增加了与基体的稳定性，并且能增加基体材料的各种机械性能，如强度、韧性、稳定性等，能够显著改善基体的强度和加工可塑性，在复合材料中与基体相连起支撑骨架作用，而且避免了像单晶体一样为了达到相同目的而加入大量晶体材料导致复合材料难于加工，改变了复合材料基底颜色、韧性等其他性质的问题，而且随着加入量的增多使复合材料机械性能增强效果更显著，硬度提高也较大。由于四针状氧化锌晶须是无色透明的，所以他可以和任何材料加以复合而无需担心改变原材料的颜色，从而为其应用于口腔领域奠定了一定的基础。

实验分别检测纳米磷酸锆载银抗菌剂和四针状氧化锌晶须抗菌剂两种抗菌剂对白色念珠菌的最小杀菌浓度，并且对两种抗菌剂的抗菌活性进行比较^[40-44]，为增强室温固化甲基丙烯酸甲酯赝复材料对白色念珠菌的抗菌性能方面提供理论依据。

材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：于2012年2至7月在佳木斯大学实验室完成。

材料：

纳米载银抗菌剂与四针状氧化锌抗白色念珠菌性能实验的主要无机抗菌剂，仪器及实验菌株：

Inorganic antibacterial agents, instruments and experimental strains:

实验方法：

试件的制备和分组：在相对湿度为(50±5)%、室温(23±2) ℃的条件下，将两种不同抗菌剂按0%，1%，2%，3%的质量比分别加入到室温固化甲基丙烯酸甲酯粉剂中，均匀混合40 s后，加入到预先制备的模具中，用玻璃板压制成直径为20 mm、厚2 mm的试件96枚，每种材料48枚，每种材料按0(对照组)，1%，2%，3%质量比分成4组，每组12枚。

实验菌液的配置：将实验菌株放置在沙氏培养基平板上，传代培养 24 h 后，挑取琼脂表面上单个菌落混悬于液体沙氏培养基中，再用麦氏比浊法制成 1×10⁷CFU/mL 浓度的菌液备用^[45]。

最小杀菌浓度的测定：用对倍稀释法检测两种纳米级无机抗菌剂对白色念珠菌的最小杀菌浓度。将白色念珠菌国际标准菌株(ATCC90028)复苏，然后接种在沙氏培养液中进行培养，37 ℃培养48 h，镜检为纯培养物，然后传代于沙氏斜面平板上培养24 h。将传代培养的白色念珠菌采用麦氏比浊法制备1×10⁷ FU/mL浓度标准液。按10倍稀释法制成1×10⁶ CUF/mL的菌悬液为实验菌液。将两种抗菌剂以沙氏培养液为溶液，通过二倍稀释法制成25-40 g/L 5个浓度梯度的抗菌剂液。每支试管分别加入1 mL不同浓度的抗菌剂液和1 mL实验菌液。吸取1 mL实验菌液和1 mL沙氏培养液加入另一支试管中作为阳性对照组；用接种环挑取10支加入药物的试管内培养物，划线接种在沙氏平板上，37 ℃培养24 h，无细菌生长的最低抗菌剂浓度为该抗菌剂的最小杀菌浓度。实验重复3次，结果取平均值^[46]。

抗菌率的检测：采用麦氏比浊法制备含菌浓度为1×10⁵CUF/mL的菌液。将各试件置于无菌琼脂平板上固定，分别取20 μL菌液滴加在每个试件表面，覆盖消毒膜，37 ℃培养24 h后，在各平板中加入20 mL无菌生理盐水，在振荡器上振荡1 min以完全洗脱附着于试件和覆盖膜表面的细菌。充分混匀洗脱液，按10倍递增稀释至1×10^-2，取100 μL涂布至沙氏培养基上，37 ℃培养24 h后以平板上菌落数为30-300的平板为准进行活菌计数。结果取平均值参照中国国家标准GB/15975-1995附录B产品抑菌和杀菌性能与稳定性实验方法进行抗菌效能评定。

主要观察指标：①两种抗菌剂对白色念珠菌的最小杀菌浓度。②加入不同质量比纳米磷酸锆载银抗菌粉体或四针状氧化锌抗菌剂后，室温固化甲基丙烯酸甲酯对抗白色念珠菌的性能。

统计学分析：采用SPSS 19.0软件进行两样本t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

1939年Hill等证明了银离子具有一定的杀菌能力。一系列研究表明，银离子的作用范围仅限用原核细胞，对真核细胞无效，所以其具有良好的杀菌作于却不会对人体有任何不良反应。纳米载银抗菌剂是将银离子通过无机离子交换体复合在纳米级基体材料中制得的新型纳米级抗菌剂，其抗菌机制主要为：当银离子接触到目标细菌时，由于银离子(Ag⁺或 Ag²⁺)带正电荷，而细菌的细胞膜带负电荷，二者通过库仑引力牢固吸引，银离子与细胞机体中酶蛋白的巯基(-SH)反应，银离子的重金属性使细胞的蛋白质凝固，从而使菌体死亡。张富强等^[48]用6种纳米载银抗菌剂针对口腔致病菌的抗菌活性进行了比较，结果发现6种载银抗菌剂对乳酸杆菌、变形链球菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、黏性放线菌、大肠埃希菌等多种口腔致病菌均有良好的杀菌效果。同时也有研究表明纳米载银抗菌剂对人体无毒性，因此纳米载银抗菌剂可以应用于口腔环境中预防口腔疾病的发生。

四针状氧化锌晶须的抗菌机制主要是：①锌离子的抗菌机制：游离的Zn²⁺能穿透细胞膜进入细胞，与细胞内活性蛋白酶结合使蛋白质变性，从而使细胞失去分裂、增殖能力而死亡，同时Zn²⁺还能破坏微生物的呼吸系统、电子传输系统、物质输运系统。当细菌死亡后，原来与细胞结合的Zn²⁺通过沉淀平衡又从死亡的菌体中分离出来，再与其他细菌接触进行新一轮的杀菌，周而复始，从而起到高效持久的抗菌作用^[49]。②四针状氧化锌晶须尖端具有纳米材料所具备的特殊表面效应和高活性，突出的纳米效应所带来的离子表面活性和悬空化学键引起的超化学活性，能够高效杀灭和清除细菌及其残骸并分解细菌分泌的毒素^[49]。③四针状氧化锌晶须在光照条件下可以游离出负离子，留下带正电荷的空穴，这种空穴可以激发空气中的氧原子成为活性氧，活性氧具有极强的氧化性，可使细胞内的蛋白质变性达到杀菌的目的^[49]。

任何一种新型材料在广泛应用到临床领域之前都应有大量的生物安全性实验，从而保证材料的生物安全性，为临床应用提供了有利的理论依据。Bosset等^[50]检测了添加银离子骨科固定材料的生物安全性，证实了该材料在生物体内具有良好的生物安全性，可以在临床上广泛应用。余日月等^[51]实验得出抗菌剂质量浓度分别为5，10 g/L的纳米载银抗菌剂树脂基托对小鼠成纤维细胞L929无毒性作用，具有较好的生物安全性，为纳米载银抗菌剂树脂基托的临床应用提供了理论依据。马千淇等^[52]在硅橡胶复合材料中加入银锌超细复合抗菌剂和纳米磷酸锆载银抗菌剂，通过实验比较显示两种抗菌剂均有较好的抗菌效果，纳米磷酸锆载银抗菌剂的抗菌性能优于银锌超细复合抗菌剂的抗菌性能，为临床抗菌剂的选择提供了依据。刘奕等^[53]将磷酸锆载银抗菌剂加入到口腔藻酸盐印模材料中，并用薄膜附着法检测添加抗菌剂后印模材料的抗菌活性，结果显示添加1%的纳米载银磷酸锆抗菌剂可以使藻酸盐印模材料具有较强的抗菌性能，而添加抗菌剂后没有改变口腔藻酸盐印模材的主要理化性质，不会影响到其正常的使用。张林祺等^[54]比较了3种纳米级载银抗菌剂对口腔常见致病菌的抗菌性，实验证明3种纳米级载银抗菌剂对乳酸杆菌、变形链球菌、黏性放线菌、牙龈卟啉单孢菌、白色念珠菌等都有明显的抗菌效果，且抗菌能力随抗菌剂添加增多而显著提高。余日月等^[55]在体外对比纳米载银抗菌剂树脂基托对变形性链球菌和白色念珠菌的抗菌活性，结果表明载银抗菌树脂基托在体外对变形链球菌和白色念珠菌均具有较好的抗菌效果且具有持久稳定性。佘文君等^[46]采用薄膜密着法检测纳米载银抗菌基托树脂对变形链球菌、白色念珠菌的抑菌作用，结果显示抗菌性能随着抗菌剂浓度的增加显著提高，抗菌性能良好。

胡涛等^[56]通过定量的抑菌实验表明：在相同的作用时间下，四针状氧化锌复合抗菌材料对铜绿假单胞菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抑菌率达到99.9%，而且具有持久、高效的抗菌活性和良好的生物安全性，同时能在材料中充分的分散，不易使基体材料变色，表现出良好的化学性能稳定、抗菌性、耐高温性。

贾春丽等^[57]在甲基丙烯酸甲酯中加入载银无机抗菌剂，发现甲基丙烯酸甲酯材料具有一定的抗菌性，但无机载银抗菌剂会对基体材料颜色产生一定的影响，随着添加浓度比例的增加，颜色变化增大，使其应用于赝复体的范围受到限制。

综上所述，纳米载银抗菌剂及四针状氧化锌抗菌剂均具有抗白色念珠菌的功效，且四针状氧化锌抗菌剂抗菌效果优于纳米载银磷酸锆抗菌剂，为室温固化甲基丙烯酸甲酯材料抗菌提供了理论依据。

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任何一种新型材料在广泛应用到临床领域之前都应有大量的生物安全性实验，从而保证材料的生物安全性，为临床应用提供了有利的理论依据。Bosset等检测了添加银离子骨科固定材料的生物安全性，证实了该材料在生物体内具有良好的生物安全性，可以在临床上广泛应用。余日月等实验得出抗菌剂质量浓度分别为5，10 g/L的纳米载银抗菌剂树脂基托对小鼠成纤维细胞L929无毒性作用，具有较好的生物安全性，为纳米载银抗菌剂树脂基托的临床应用提供了理论依据。马千淇等在硅橡胶复合材料中加入银锌超细复合抗菌剂和纳米磷酸锆载银抗菌剂，通过实验比较显示两种抗菌剂均有较好的抗菌效果，纳米磷酸锆载银抗菌剂的抗菌性能优于银锌超细复合抗菌剂的抗菌性能，为临床抗菌剂的选择提供了依据。刘奕等将磷酸锆载银抗菌剂加入到口腔藻酸盐印模材料中，并用薄膜附着法检测添加抗菌剂后印模材料的抗菌活性，结果显示添加1%的纳米载银磷酸锆抗菌剂可以使藻酸盐印模材料具有较强的抗菌性能，而添加抗菌剂后没有改变口腔藻酸盐印模材的主要理化性质，不会影响到其正常的使用。张林祺等比较了3种纳米级载银抗菌剂对口腔常见致病菌的抗菌性，实验证明3种纳米级载银抗菌剂对乳酸杆菌、变形链球菌、黏性放线菌、牙龈卟啉单孢菌、白色念珠菌等都有明显的抗菌效果，且抗菌能力随抗菌剂添加增多而显著提高。余日月等在体外对比纳米载银抗菌剂树脂基托对变形性链球菌和白色念珠菌的抗菌活性，结果表明载银抗菌树脂基托在体外对变形链球菌和白色念珠菌均具有较好的抗菌效果且具有持久稳定性。佘文君等采用薄膜密着法检测纳米载银抗菌基托树脂对变形链球菌、白色念珠菌的抑菌作用，结果显示抗菌性能随着抗菌剂浓度的增加显著提高，抗菌性能良好。