2.1  实验动物数量分析  36只兔均进入结果分析。

2.2  大体观察  对所有兔进行胫骨骨髓炎造模后观察皮肤外观，可见脓性分泌物及窦道形成，见图2A，仅经过胫骨开窗清创的空白组兔仍可见脓性分泌物，对照组与实验组脓性分泌物消失，皮肤愈合良好，见图2B，C。

2.3  X射线观察  随着时间的延长，对照组与实验组骨质破坏逐渐减少，骨质缺损逐渐愈合，空白组骨髓炎逐渐加重，可见死骨形成，见图3。对各时间段X射线片进行Norden评分，可见空白组骨髓炎逐渐加重，而对照组及试实验组骨髓炎较前好转，见表1。

2.4  细菌培养  对各组兔不同时间段的骨髓组织进行细菌培养，统计细菌阳性率，可见实验组及对照组细菌阳性率逐渐下降，而空白组阳性率无明显变化，见表2。

经过3个月的观察，空白组兔骨髓炎逐渐加重，实验组及对照组兔骨髓炎逐渐好转，部分兔骨髓炎痊愈。所有实验动物观察期间无并发症发生。

随着现代生活节奏的加快，工农业、交通事业的迅猛发展，各种事故造成的高能量损伤越来越多，其常呈开放性，造成骨与软组织的感染，因此骨髓炎的发病率也在逐渐升高。骨髓炎是由微生物感染引起的伴有骨组织破坏的炎症反应过程，主要临床表现为骨组织的坏死、硬化、瘘管和窦道的形成，其致病菌有很多，包括革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌等，可为单一细菌感染，也可为混合细菌感染，但主要致病菌仍为金黄色葡萄球菌^[1]。由于抗生素的广泛应用，耐药细菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的发生率呈上升趋势^[2]，最终使得骨髓炎的治疗出现高失败率、高感染率及高复发率的特点^[3]，不仅给患者造成了巨大的痛苦，还带来了不小的经济负担。因此，如何快速、有效治疗骨髓炎成为目前骨科领域亟需解决的问题之一。

光动力抗微生物化学疗法是基于光动力疗法原理通过光激活光敏剂以杀灭微生物的一种新的抗感染方式，因其具有广谱抗菌、起效快和无耐药的特点^[4]，目前已在浅表局限性感染的治疗中被广泛应用。实验旨在探讨光动力抗微生物化学疗法治疗兔胫骨骨髓炎的效果，为骨髓炎的临床治疗方案提供实验依据及新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机分组，对比观察动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2015年5月至2018年1月在中国人民武装警察部队特色医学中心应急救援研究所实验室完成。

1.3  材料  聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥(贺利氏医疗有限公司)；氯胺酮(上海第一生化药业)；金黄色葡萄球菌(天津医科大学总医院细菌室)；光动力抗微生物药物(中国人民武装警察部队特色医学中心应急救援研究所实验室提供)；万古霉素(美国礼来公司)；5%鱼肝油酸钠针剂(上海信宜金朱药业有限公司)；外科手术器械(中国人民武装警察部队特色医学中心手术室)。

  实验动物：新西兰健康成年大白兔36只，雌雄不拘，体质量2.0-2.5 kg，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。

1.4  实验方法

1.4.1  骨髓炎模型的建立  36只实验用兔饲养1周，以便熟悉环境。取实验兔称质量，采用氯胺酮10 mg/kg肌注进行麻醉，待麻醉起效后，四肢外展仰卧位固定，头后仰。将左下肢手术部位周围兔毛剃掉，碘伏消毒，将无菌孔巾覆盖手术区周围。于胫前内缘切开皮肤、皮下、深筋膜，显露胫骨上端前内侧面，用2 mm克氏针钻孔至髓腔。从骨孔内向髓腔注入0.1 mL的1×10⁸ cfu/mL金黄色葡萄球菌，用0.1 mL生理盐水冲洗注射器并注入髓腔，再向骨窗内注射0.05 mL的5%鱼肝油酸钠并用无菌骨腊封闭骨窗，冲洗伤口后缝合皮肤。

1.4.2  骨髓炎动物模型的确立  建模28 d后对所有实验用兔骨髓炎模型进行确立^[5]，主要靠实验兔造模前后的大体观察、影像学检查及骨髓组织的细菌培养等来确定，其中骨髓组织的细菌培养结果为金标准，所有实验动物最后均造模成功。

1.4.3  实验分组  将36只骨髓炎实验兔按随机数表法分成3组，每组12只：空白组在胫骨开窗清创后不做任何药物处理，对照组在胫骨开窗清创后填入万古霉素聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥，实验组在胫骨开窗清创后进行光动力抗微生物化学治疗。

1.4.4  手术方法  取实验用兔称质量，氯胺酮10 mg/kg肌注进行麻醉，待麻醉起效后，四肢外展仰卧位固定，头后仰。将左下肢手术部位周围兔毛剃掉，碘伏消毒，将无菌孔巾覆盖手术区周围。沿原手术切口逐层切开皮肤、皮下及深筋膜，显露胫骨上端前内侧。用2 mm克氏针钻3个纵向部分重迭的骨孔，修整骨孔边缘，造成1个15 mm×5 mm的矩形骨窗。所有实验用兔髓腔内均见大量炎性及坏死组织，取炎性组织作细菌培养。彻底清除骨髓腔炎性组织，有窦道切除窦道，反复生理盐水冲洗髓腔四五次，分别将制备好的万古霉素骨水泥链株[将骨水泥与注射用盐酸万古霉素按25∶1(10 g∶0.4 g)的比例混合后加入聚甲基丙烯酸甲酯调节骨水泥强度，将骨水泥制成直径3-5 mm的圆珠，选择合适的丝线串成链珠，待骨水泥完全硬化后填满胫骨开窗]、光动力抗微生物药物新型抗菌活性氨基酸卟啉光敏剂4I填入各组实验兔髓腔中。对照组逐步缝合深筋膜及皮肤，实验组将光动力化学药物注入髓腔，通过将波长(635±10) nm光导入骨髓腔并照射(图1)半小时后逐步缝合深筋膜及皮肤，所有实验动物均于自然条件下恢复清醒，相同条件下喂养并进行观察。

1.5  主要观察指标

1.5.1  大体观察  术后4，8，12周，观察实验兔伤口愈合及软组织的情况，有无窦道形成、软组织肿胀等，解剖胫骨上端大体观察骨质破坏、增生情况及骨缺损的愈合情况。

1.5.2  X射线表现  术后4，8，12周，对实验动物感染胫骨进行X射线拍片，观察局部有无死骨形成、骨质破坏、骨质增生及软组织炎性包块影，用Norden分组评分法半定量评价骨髓炎治疗情况^[6]。这一评分方法包含4个指标：①死骨形成：有1分，无0分；②新骨形成：有1分，可疑0.5分，无0分；③骨质吸收情况：严重并多处2分，中度仅一处1分，轻度0分，无0分；④病变范围：将胫骨分为近端、中段、远端3部分，每一部分 有1分，可疑0.5分，无0分。得分0-7分，代表骨髓炎从无到最严重。

1.5.3  细菌培养  细菌培养方法采用倾注平板法：取实验区域3处骨髓组织各1 g，加入试管中，再加入5 mL无菌生理盐水，电动搅拌5 min。采用10倍系列稀释法，取稀释液1 mL，在25-40 ℃条件下倾入含15 mL肉浸液琼脂平皿内，轻摇混匀，待凝固后置于37 ℃孵育24 h，进行分离鉴定细菌。

1.6  统计学分析  采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计量资料以x(_)±s表示，X射线评分相同时间段的组间比较采用独立样本t 检验分析法，P < 0.05为差异有显著性意义；细菌培养结果阳性率采用χ²检验比较相同时间段各组之间的统计学差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

3.1  骨髓炎的治疗  骨髓炎是由微生物感染引起的伴有骨组织破坏的炎症反应过程，金黄色葡萄球菌是该病最常见的致病菌^[1]，胫骨是创伤性骨髓炎高发的部位。实验通过制造兔胫骨骨髓炎及对其进行治疗来观察治疗效果。病变处细菌培养阳性和组织病理学检查是诊断骨髓炎的金标准，应用抗菌药物和手术是治疗该病的基础^[8-9]。

治疗骨髓炎的基本原则是尽可能彻底清除病灶，摘除死骨，清除增生的瘢痕和肉芽组织，修复骨缺损及软组织缺损，消除死腔，改善局部血液循环^[10]。一旦治疗不当或不及时而病情慢性发展将引起慢性骨髓炎，病情复杂，病程较长，治疗的失败率和复发率也较高，给患者带来极大的痛苦。自WHALING研制成功庆大霉素-聚甲基丙烯酸甲酯珠链并应用于治疗骨髓炎后，这种治疗模式已被普遍推广应用^[11]。但是，由于抗生素的广泛应用及耐药菌株如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的出现，为骨髓炎的治疗带来更大的困难，因此对骨髓炎的治疗常常联合使用几种抗生素，有时效果仍然不佳。所以对骨科医生来说也需要一种不同于以往治疗感染的方法以提高治疗效果，减少并发症的发生，而光动力抗微生物化学疗法是一个非常有希望的治疗选择。

3.2  光动力抗微生物化学疗法的发展  光动力抗微生物化学疗法是一种新兴的抗菌方法，利用合适波长光照射光敏剂产生的活性氧引发光化学反应，从而破坏微生物超微结构，起到杀伤微生物的作用^[12]，其基于激光、氧和光敏剂3种因素共同作用的氧化损伤机制，很难使细菌产生耐药性。有研究表明光动力抗微生物化学疗法对于耐药菌感染的治疗具有很大的潜力，可减少细菌耐药的发生^[13]。因光动力抗微生物化学疗法具有广谱抗菌、不易产生耐药的特点，成为目前研究较多的抗感染方法之一，尤其是抗耐药菌的治疗，也被誉为“抗生素时代的终结者”^[14]。它是光动力疗法在抗感染领域的沿用，光动力疗法是指利用光、光敏剂、氧分子联合产生光化学效应以选择性杀伤病原微生物的一种新疗法^[15]。

由于光动力疗法可以诱导细胞和微生物失活，于1904年开始应用到医学领域^[16]，尤其是治疗浅表局限性感染。有多项研究表明光动力抗菌疗法在治疗耐药菌引起的感染方面具有一定的优势^[13，17-18]。ZEINA等^[19]认为在细菌与光敏剂孵育10-30 min内光动力疗法杀伤细菌的作用强，而影响机体正常组织的作用小。而SCHASTAK等^[20]通过光动力疗法对4种细菌杀伤作用的研究认为，给药-光照间隔时间30 min时对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀伤作用最强，而随着增加间隔时间，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀伤效果无变化，而对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀伤效果减弱。而CASSIDY等^[21]认为对于金黄色葡萄球菌，30 min是最佳的药光间隔时间。由于骨髓炎的主要致病菌为金黄色葡萄球菌，故此次实验对于实验组动物给予光动力化学药物后光照时间设置为 30 min，以达到最佳杀伤细菌的效果，并尽可能减少对正常的机体组织的影响。SIMONETTi等^[22]研究认为应用光动力抗微生物化学疗法治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的小鼠感染有明确的效果。GAD等^[23]研究认为光动力抗微生物化学疗法对于治疗金黄色葡萄球菌引起的小鼠肢体肌肉组织感染有一定的效果。虽然光动力抗微生物化学疗法的治疗效果受光源穿透作用限制，对于深部组织感染的治疗作用有限，但是随着目前耐药菌株的产生，抗生素治疗各种感染的作用越来越差，因而诸如光动力抗微生物化学疗法等新型抗感染方法的研究显得益发重要。

关于光动力抗微生物化学疗法治疗骨髓炎的研究尚处于起步阶段。BISLAND等^[8]发现光动力抗微生物化学疗法对治疗骨髓炎也有很大的潜力，他们应用亚甲蓝或5-ALA介导的光动力抗微生物化学疗法治疗金黄色葡萄球菌感染的骨髓炎，取得了理想的效果。TARDIVO等^[24]应用光动力抗微生物化学疗法治疗糖尿病合并骨髓炎患者的足部溃烂，使这些患者避免了截肢。实验通过光动力抗微生物化学疗法治疗兔胫骨骨髓炎，通过大体观察、影像学检查及细菌培养与万古霉素聚甲基丙烯酸甲酯、空白组进行对比，分析光动力抗微生物化学疗法治疗骨髓炎的效果。大体观察可见经过治疗后兔软组织感染较治疗前明显好转，经解剖后可见胫骨骨缺损愈合较好，认为光动力抗微生物化学疗法可控制骨髓炎的发展；通过X射线检查结合Norden评分半定量分析可以看出，实验组及对照组骨髓炎均有好转趋势，两者之间比较无统计学意义(P > 0.05)，而两组与空白组进行对比均有统计学意义(P < 0.05)。3组细菌培养结果显示，实验组及对照组均较空白组效果明显(P < 0.05)，而实验组与对照组相比无统计学意义(P > 0.05)，说明光动力抗微生物化学疗法与万古霉素聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥治疗骨髓炎的效果相当。

3.3  光动力抗微生物化学疗法的优势及不足  万古霉素聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥治疗骨髓炎目前研究较彻底且疗效肯定，在治疗骨髓炎时珠链除了治疗感染，还可以填充死腔。但是聚甲基丙烯酸甲酯抗生素链珠还存在一些问题需要解决：①无法吸收，需二次手术取出；②抗生素释放率很低，大约只有5%的抗生素从聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥中释放出来；③抗生素载药量有限；④由于抗生素的滥用而出现耐药菌株，无对其敏感的抗生素；⑤聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥对抗生素有热损伤。而光动力抗微生物化学疗法相对万古霉素聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥治疗骨髓炎有其特有的优势：①因其独特的抗菌机制，很难使细菌产生耐药性且不会产生耐药菌，不会对邻近组织造成损伤，在治疗耐药菌上具有明显的优势，几乎没有耐药作用，而且可以有效预防二次感染，减少细菌耐药的发生^[13，25]；②实验所采用的光动力学药物为液体，其可以很好的填充髓腔，避免了死腔的产生，从而尽可能彻底的清创髓腔内的细菌；③液体药物可于体内吸收，无需二次手术取出；④光动力抗微生物化学疗法还可以减少万古霉素等抗生素产生的肝肾损伤等并发症的发生率。虽然光动力抗微生物化学疗法治疗骨髓炎有其明显的优势，但是同样存在着一定的缺陷：①治疗过程中需光照一定时间，术中暴露时间延长；②作用时间短，仅术中暴露光照过程中有作用；③光的穿透力使光动力抗微生物化学疗法在深部组织的治疗中受到一定的限制^[26]。

实验通过建立兔胫骨骨髓炎模型，将光动力抗微生物药物植入兔胫骨髓腔，并与目前研究较彻底且疗效肯定的万古霉素聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥及空白组进行比较，并对光动力抗微生物化学疗法的治疗结果进行评价，从而为临床治疗骨髓炎提供动物实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
光动力抗微生物化学疗法：是一种新兴的抗菌方法，是基于光动力疗法的原理，利用合适波长光照射光敏剂产生的活性氧引发光化学反应，从而破坏微生物超微结构，起到杀伤微生物的作用的一种新的抗感染方式，目前已在浅表局限性感染治疗中被广泛应用。
骨髓炎：是由微生物感染引起的伴有骨组织破坏的炎症反应过程，主要临床表现为骨组织的坏死、硬化、瘘管和窦道的形成，其致病菌有很多，包括革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌等，可为单一细菌感染，也可为混合细菌感染，但主要致病菌仍为金黄色葡萄球菌。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

由于抗生素的广泛应用，诸多耐药细菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的发生率呈上升趋势，最终使得骨髓炎的治疗出现高失败率、高感染率及高复发率的特点，不仅给患者造成了巨大的痛苦，还带来了不小的经济负担。光动力抗微生物化学疗法作为一种新的抗感染方式，由于具有广谱抗菌、起效快和无耐药的特点，目前已在浅表局限性感染的治疗中广泛应用。实验通过探讨光动力抗微生物化学疗法治疗兔胫骨骨髓炎的效果，为骨髓炎的临床治疗方案提供实验依据及新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程