静压力下牙周膜成纤维细胞分泌炎性因子与p38信号通路的关系

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1175

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (15): 2308-2313.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1175

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静压力下牙周膜成纤维细胞分泌炎性因子与p38信号通路的关系

唐海芳1，2，3，4，彭娟敏1，2，3，4，康娜1，2，3，4

(1广西医科大学附属口腔医院，广西壮族自治区南宁市 530021；2广西口腔颌面修复与重建研究自治区级重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530021；3广西颅颌面畸形临床医学研究中心，广西壮族自治区南宁市 530021；4颌面外科疾病诊治研究重点实验室(广西高校重点实验室)，广西壮族自治区南宁市 530021)

收稿日期:2018-12-18 出版日期:2019-05-28 发布日期:2019-05-28
通讯作者: 康娜，博士，副主任医师，副教授，广西医科大学附属口腔医院，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:唐海芳，女，1991年生，广西壮族自治区桂林市人，汉族，广西医科大学在读硕士，主要从事口腔正畸方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81360170)，项目负责人：康娜

Relationship between p38 signaling pathway and periodontal ligament fibroblasts secreting inflammatory factors under static pressure

Tang Haifang1, 2, 3, 4, Peng Juanmin1, 2, 3, 4, Kang Na1, 2, 3, 4

Received:2018-12-18 Online:2019-05-28 Published:2019-05-28
Contact: Kang Na, MD, Associate chief physician, Associate professor, Hospital of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Restoration and Reconstruction of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Craniomaxillofacial Clinical Research Center of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Key Laboratory of Diagnosis and Treatment of Maxillofacial Surgery (Key Laboratory of Guangxi University), Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Tang Haifang, Master candidate, Hospital of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Restoration and Reconstruction of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Craniomaxillofacial Clinical Research Center of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Key Laboratory of Diagnosis and Treatment of Maxillofacial Surgery (Key Laboratory of Guangxi University), Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360170 (to KN)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
细胞静压力：是一种细胞的体外力学，通过重力加载装置，于单层细胞上放置一片盖玻片，再在玻片上加载重物，通过玻片传递，使细胞承受均匀单一的压应力。该装置设计简单，操作方便，却能使单层细胞顶-底向单向受力，力值可靠，且细胞体外培养环境不受其影响，静压力加载时间不受限制。
p38 MAPK：属于应激性蛋白激酶，在G蛋白偶联受体、应力刺激、炎症因子等作用下可激活p38 MAPK，活化的p38 MAPK从胞质进入胞核内，为应激条件下的炎症反应、细胞免疫调节、细胞凋亡过程的做出应答。p38 MAPK通路信号通路与炎症反应及其分泌调控机制关系密切，是哺乳动物细胞信号通路中的经典途径，趋化因子、炎症因子如肿瘤坏死因子、环氧合酶2等的产生都有赖于p38通路的调控。

摘要
背景：研究表明p38 MAPK通路在炎症因子的合成中起到重要作用，但对正畸牙移动过程牙周膜成纤维细胞中p38 MAPK信号通路与白细胞介素17、白细胞介素6等炎性因子关系的相关报道较少。
目的：分析人牙周膜成纤维细胞加载持续性静压力后在合成炎症因子白细胞介素6、白细胞介素17过程与p38 MAPK的关系，探讨p38 MAPK信号通路对白细胞介素17和白细胞介素6表达的影响。
方法：①取年龄在11-15岁正畸者需要拔除的新鲜第一、二前磨牙的牙周组织(正畸者及其监护人均知情同意)，体外培养牙周膜成纤维细胞，建立细胞重力加载模型；②细胞种板，分别加力0，1，2，4 g/cm2，每加力组分别加力5，15，30和60 min，检测p38 MAPK蛋白表达；③取第4代细胞接种后，随机分为6组：空白组、加二甲基亚砜组、加抑制剂组(p38 MAPK阻断剂SB203580)、加力组、加力+二甲基亚砜组、加力+抑制剂组，对细胞预处理60 min，通过定量RT-qPCR和酶联免疫吸附法(ELISA)检测牙周膜成纤维细胞受4 g/cm2压力刺激后白细胞介素17和白细胞介素6的mRNA和蛋白水平。
结果与结论：①2 g/cm2组、4 g/cm2组p38 MAPK磷酸化蛋白表达变化随时间的延长而增加：30 min时表达量最高，60 min时开始减少；②与未加力的3组相比，加力组的白细胞介素17和白细胞介素6表达量上调，加抑制剂组的白细胞介素6表达量下降，白细胞介素17表达量无明显差异；③结果提示，静压力可促使牙周膜成纤维细胞分泌白细胞介素17和白细胞介素6，且白细胞介素6的分泌可能与p38 MAPK信号通路有关，但不足以证明该通路参与静压力对牙周膜成纤维细胞诱导白细胞介素17的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-3542-7146(唐海芳)

关键词: 静压力, 牙周膜成纤维细胞, p38丝裂原激活蛋白, 白细胞介素17, 白细胞介素6, 牙周膜

Abstract:

BACKGROUND: p38 MAPK pathway has been shown to play an important role in the synthesis of inflammatory factors, but the relationship between p38 MAPK signaling pathway and interleukin 17, interleukin 6 and other inflammatory factors in periodontal ligament fibroblasts during orthodontic tooth movement is little reported.
OBJECTIVE: To investigate the relationship of the expression of inflammatory cytokines interleukin 17 and interleukin 6 with p38 MAPK in human periodontal ligament fibroblasts under continuous static pressure, and to explore the effect of p38 MAPK signaling pathway on the expression of interleukin 17 and interleukin 6.
METHODS: The periodontal tissues of fresh first and second premolars were obtained from the removed teeth of the orthodontic patients aged 11-15 years (informed consent had been obtained). Periodontal ligament fibroblasts were cultured in vitro, and the cell model loaded with gravity was established. Cell culture plates were loaded with 0, 1, 2 and 4 g/cm2 pressure for 5, 15, 30 and 60 minutes, respectively. The expression of p38 MAPK protein was detected. The passage 4 cells were seeded, and then randomized into six groups: blank, dimethyl sulfoxide, inhibitor (p38 MAPK blocker, SB203580), loading, loading plus dimethyl sulfoxide, and loading plus inhibitor groups. The intervention lasted for 60 minutes. The interleukin 17 and interleukin 6 protein and mRNA levels in periodontal ligament fibroblasts after loaded with 4 g/cm2 force were detected by RT-PCR and ELISA.
RESULTS and CONCLUSION: (1) The expression level of p38 MAPK protein in the 2 and 4 g/cm2 groups was increased with time prolonged, peaked at 30 minutes, and began to decrease at 60 minutes. (2) Compared with the groups without loading, the loading groups showed an increase in the expression levels of interleukin 17 and interleukin 6. The expression level of interleukin 6 in the inhibitor group was down-regulated, and the expression level of interleukin 17 showed no significant difference. (3) To conclude, static pressure can promote human periodontal ligament fibroblasts to secrete interleukin 17 and interleukin 6. Interleukin 6 secretion may be related to p38 MAPK signaling pathway. However, there is insufficient evidence to demonstrate that p38 MAPK signaling pathway is involved in periodontal ligament fibroblasts inducing interleukin 17 expression under static pressure.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Orthodontics, Tooth Movement, Interleukin-17, Interleukin-6, Stress, Mechanical, Tissue Engineering

中图分类号:

R496

唐海芳, 彭娟敏, 康娜. 静压力下牙周膜成纤维细胞分泌炎性因子与p38信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(15): 2308-2313.

Tang Haifang, , , , Peng Juanmin, , , , Kang Na, , , . Relationship between p38 signaling pathway and periodontal ligament fibroblasts secreting inflammatory factors under static pressure[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(15): 2308-2313.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计细胞生物力学水平，对比观察实验。

1.2 时间及地点于2017年10月至2018年4月在广西医科大学附属口腔医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验用主要试剂 p38阻滞剂SB203580(Selleck，上海)、RNAiso Plus RNA提取试剂、反转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒(TAKAR，日本)、白细胞介素17A ELISA Kit、白细胞介素17R ELISA Kit、白细胞介素6 ELISA Kit(Raybiotech，美国)、一步法预制胶试剂盒(氟德生物科技有限公司，杭州)、PVDF膜(Roehe，德国)、蛋白Maker(Thermo-Pierce，美国)、羊抗兔荧光二抗(Licor，美国)、兔抗人p38 MAPK(CST，美国)、tubulin单克隆抗体(proteintech，美国)

1.3.2 实验用细胞人牙周组织均取自广西医科大学附属口腔医院因正畸治疗需要拔除的新鲜第一、二前磨牙(无龋坏、无牙周病等)，年龄在11-15岁，正畸者及监护人为自愿参加，对实验过程完全知情同意，在充分了解该实验方案的前提下签署了“知情同意书”。刀片刮取牙根中1/3牙周膜组织，组织块法培养原代细胞，当细胞从组织块爬出覆盖瓶底约80%后，用0.25%胰蛋白酶1 mL消化传代，取第4代细胞，经角蛋白抗体、波形丝蛋白抗体染色鉴定为牙周膜成纤维细胞后备用。

1.4 实验方法

1.4.1 建立细胞重力加载模型取4-6代牙周膜成纤维细胞以(3-5)×10⁵接种于六孔板，两三天细胞基本长满后，将无菌圆形盖玻片(直径30 mm)置于铺满6孔板的单层细胞上，并在玻片上分别放置不同规格的加力部件，使细胞受力依次为 0，1，2，3，4，5 及 6 g/cm²，见图1。

1.4.2 不同静压力对牙周膜成纤维细胞表达p38 MAPK的影响细胞种板及加力方法同上，力值为0，1，2，4 g/cm²，每加力组分别加力5，15，30和60 min。经Western-Blot检测细胞内p38 MAPK蛋白活性：取出加力装置，加入含磷酸酶抑制剂(比例1∶100)的RIPA buffer，按照总蛋白提取试剂盒提取总蛋白样品，并用BCA法测定蛋白浓度，分装存于-20 ℃冰箱。1∶1 000稀释的兔抗人p38 MAPK及1∶3 000稀释的羊抗兔荧光二抗检测p38 MAPK表达量。Western-blot采用标准的程序进行。最后采用Odyssey双色红外荧光扫描成像系统，选择700和800的通道呈像检测抗体-蛋白复合物。

1.4.3 阻断剂 SB203580对静压力诱导牙周膜成纤维细胞表达白细胞介素17和白细胞介素6因子的影响。

(1)实验分组与干预：取第4代牙周膜成纤维细胞，接种于6孔培养板中，实验随机分为6组：①不加力不加抑制剂的空白组；②加二甲基亚砜组；③加抑制剂组；④加力组；⑤加力+二甲基亚砜组；⑥加力+加抑制剂组。SB203580抑制剂浓度为1 μmol/L，二甲基亚砜浓度为1%，力值为4 g/cm²。加力时间为12 h及24 h，加力前，加入SB203580抑制剂预处理60 min。

(2)检测指标：收集细胞上清，采用ELISA检测白细胞介素17R、白细胞介素6的蛋白含量。试剂盒室温复温0.5 h，将100 µL配制好的标准品及样品加入板孔内，4 ℃孵育过夜，加生物素标记抗体，每孔100 µL，室温孵育1 h；加入HRP-链霉亲和素，室温下孵育45 min；加入100 µL的TMB显色液，室温下放置0.5 h；加终止液，酶标仪中选择450 nm波长测A值。采用荧光实时定量 PCR检测白细胞介素17R、白细胞介素6 mRNA的活性：取出加力装置，提取总RNA，并取1 μL于全波长酶标仪读取260，280 nm处的吸光度值，计算总RNA样品A₂₆₀/A₂₈₀比值，比值要求在1.7-2.1。

以总RNA为模板，按照PrimeScript ^TM RTMaster Mix试剂盒说明书反转录成cDNA。GAPDH、白细胞介素17R、白细胞介素6等均由日本TaKaRa公司设计并合成，引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

Table 1 Primer sequences for RT-PCR

引物名称	引物序列
GAPDH-Forward	TCA TGG GTG TGA ACC ATG AGA A
GAPDH-Reverse	GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG
白细胞介素17R-Forward	AGA TCC TAG CAC TGG GTC CAC AC
白细胞介素17R-Reverse	CTG GCA CAC TTC AAA CCA TGA GA
白细胞介素6-Forward	AAG CCA GAG CTG TGC AGA TGA GTA
白细胞介素6-Reverse	TGT CCT GCA GCC ACT GGT TC

以GAPDH为内参，根据SYBR®Premix Ex TaqⅡ试剂盒说明书采用两步法PCR扩增反应程序进行检测，最后用2^-^??Ct法计算目的基本的相对表达量。

1.5 主要观察指标 ①Western-Blot检测细胞内p38 MAPK活性；②ELISA检测白细胞介素17R、白细胞介素6的蛋白含量；③实时荧光定量PCR检测白细胞介素17R、白细胞介素6 mRNA的活性。

1.6 统计学分析计量资料以x(_)±s表示，使用SPSS 20.0软件统计，用单因素方差分析进行各组间的比较，检验水准α=0.05，P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

细胞体外力学一直是国内外学者致力于研究的重要内容，它不仅涉及到细胞在应力作用下细胞、细胞膜、细胞骨架的变形等力学性能的研究，还包括力学因素对细胞增殖的影响^[8-9]，而牙周膜成纤维细胞在正畸牙移动及相关性牙根吸收中的体内环境复杂，不可控因素较多，仍需要学者不断钻研。目前，体外力学加载装置主要包括：离心力加载装置^[10]、气液加力装置^[11]、基底形变加力装置及重力加载装置等^[12-14]。此次实验结合实验室条件综合考虑后采用重力加载装置，具体加载方法与Yamaguchi等^[15]实验相似，通过改变柱形容器内钢珠数量，使牙周膜成纤维细胞受不同力值大小的持续静压力。但实验中发现此加力装置依然存在不足，当玻璃片放置于单层细胞上时，由于玻片与6孔板底部之间的距离很近，两者便会因静电效应吸附在一起；当取出玻片时，由于玻片与孔板吸附较紧，若操作过于粗暴，将会从孔板上剥离少量细胞，影响实验结果，因此，作者在未加力空白组也放置玻片，以均衡由取出玻片时所造成的误差。

p38 MAPK属于应激性蛋白激酶，在G蛋白偶联受体、应力刺激、炎症因子等作用下可激活p38 MAPK，活化的p38 MAPK从胞质进入胞核内，为应激条件下的炎症反应、细胞免疫调节、细胞凋亡过程的做出应答^[16]。p38 MAPK通路信号通路与炎症反应及其分泌调控机制关系密切，是哺乳动物细胞信号通路中的经典途径，趋化因子、炎症因子如肿瘤坏死因子、环氧合酶2等的产生都有赖于p38通路的调控^[17-18]。Ziegler等^[19]发现机械应力作用牙周膜成纤维细胞后，整合素β1和β3和信号传导分子黏附斑激酶增加可以激活p38 MAPK激酶。此外李菲菲等^[20]研究也表明拉应力作用于C₂C₁₂细胞会激活p38 MAPK通路。此次实验结果发现，0 g/cm²与1 g/cm²力值刺激时，细胞内各时间组的p38 MAPK磷酸化蛋白含量无显著差异，表明胞内p38 MAPK激酶是无活性的。而当作用力加大，在2与4 g/cm²组中胞内p38 MAPK磷酸蛋白增加，在10 min时p38磷酸化开始表达，30 min时表达量最高，当至60 min时开始减少，这表明随加力时间呈现出先升后降的动态变化，p38 MAPK参与牙周膜成纤维细胞对压应力的信号传导，可能是压应力介导的重要信号分子。

白细胞介素17属于促炎性细胞因子，具有很强的骨吸收和促炎症作用，白细胞介素17受体广泛分布于内皮细胞、成骨细胞和成纤维细胞等多种细胞和组织中^[21]，并且在大鼠正畸牙移动模型中的牙周组织也可检测到高表达的白细胞介素17受体R^[22]。白细胞介素17主要由免疫性细胞T细胞分泌^[23]，此外非免疫细胞牙周膜成纤维细胞加载机械力的作用下也可表达白细胞介素17受体A^[24]。白细胞介素6是一种多效性炎性细胞因子，对正畸牙移动过程中的骨改建和骨吸收有重要影响。Liu等^[25]对55只大鼠正畸牙移动模型进行研究，白细胞介素6及其关键信号因子在牙槽骨骨改建过程中的特殊作用。实验发现牙周膜成纤维细胞加载持续性静压力后，白细胞介素6的含量与受力时间的长短有关，且随加力时间增加而增加，这一结果与Koyama等^[26]对成骨细胞加载静压力后上调白细胞介素6表达量的研究吻合。白细胞介素17、白细胞介素6能上调人破骨前体细胞的RANKL的表达，进而引起破骨细胞分化^[27-28]。在此次实验中，牙周膜成纤维细胞在压应力作用下能分泌白细胞介素17促炎因子，白细胞介素17可调控RANKL的表达，进而导致骨吸收和牙根吸收的发生。这提示调节白细胞介素17和白细胞介素6的含量可能会降低正畸相关性骨吸收和牙根吸收的发生。

因此，此次研究进一步通过给牙周膜成纤维细胞加载静压力并用SB203580抑制p38MAPK通路，SB203580抑制剂是该通路应用最多的抑制剂，余学清等^[29]研究指出p38MAPK抑制剂SB203580对p38MAPK通路在1 μmol/L时抑制作用明显，且抑制作用不随浓度增加而增强，故此次实验采用1 μmol/L SB203580抑制该通路，并检测白细胞介素17和白细胞介素6的表达量，发现加力组均比非加力组白细胞介素17和白细胞介素6表达量增高；而抑制剂组较非抑制剂组白细胞介素6表达量下降，白细胞介素17表达量无明显差异。出现以上结果原因可能是人牙周膜细胞属于非免疫性细胞，出于功能的特异性，它表达白细胞介素17量相对免疫细胞较少。此外，p38 MAPK通路可能与其他通路协同调控白细胞介素17的表达量，若仅仅阻断该通路对白细胞介素17的合成影响不明显。故对人牙周膜细胞受持续性静压力后白细胞介素17合成的信号通路还需进一步探索。

总之，此次研究结果表明：一定范围的静压力可促使人牙周膜成纤维细胞表达p38磷酸蛋白，进而启动p38 MAPK信号通路。此外静压力对刺激牙周膜成纤维细胞分泌白细胞介素17和白细胞介素6有重要作用，且牙周膜成纤维细胞分泌白细胞介素6可能与p38 MAPK信号通路相关，但不足以证明该通路是否参与静压力对牙周膜成纤维细胞诱导白细胞介素17的表达，还需进一步探究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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