炎症细胞因子刺激下胰岛素样生长因子结合蛋白5对牙周膜干细胞成骨分化的积极效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1823

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (33): 5256-5262.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1823

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

炎症细胞因子刺激下胰岛素样生长因子结合蛋白5对牙周膜干细胞成骨分化的积极效应

刘大勇，王颖铖谣，孙瑞鑫，刘凡，贾智

天津医科大学口腔医院牙体牙髓科，天津市 300070

修回日期:2019-06-21 出版日期:2019-11-28 发布日期:2019-11-28
通讯作者: 刘大勇，天津医科大学口腔医院牙体牙髓科，天津市 300070
作者简介:刘大勇，男，1972年生，河北省迁西县人，汉族，2011年首都医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事干细胞与牙周组织再生研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81371109，81670953)，项目负责人：刘大勇

Effects of insulin-like growth factor-binding protein 5 on osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells stimulated by inflammatory cytokines

Liu Dayong, Wang Yingchengyao, Sun Ruixin, Liu Fan, Jia Zhi

Department of Endodontics, Tianjin Medical University Hospital of Stomatology, Tianjin 300070, China

Revised:2019-06-21 Online:2019-11-28 Published:2019-11-28
Contact: Liu Dayong, Department of Endodontics, Tianjin Medical University Hospital of Stomatology, Tianjin 300070, China
About author:Liu Dayong, MD, Associate chief physician, Department of Endodontics, Tianjin Medical University Hospital of Stomatology, Tianjin 300070, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81371109 and 81670953 (both to LDY)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)：包括 6 种同源蛋白，与胰岛素样生长因子具有极高的亲合力并调节分泌型胰岛素样生长因子的活性。体外研究表明胰岛素样生长因子结合蛋白5可不依赖胰岛素样生长因子而独立地发挥作用，在骨、乳腺、前列腺及许多其他组织细胞内发挥着重要的调节功能。
炎症细胞因子：细胞因子是一组多肽类细胞调节物质的总称，主要由外周的免疫细胞合成，包括白细胞介素、干扰素、生长因子、细胞刺激因子、肿瘤坏死因子等。

摘要
背景：既往已有研究证实胰岛素样生长因子结合蛋白5(insulin-like growth factor-binding protein 5，IGFBP5)在牙源性干细胞中高表达，并通过激活多种信号通路发挥作用。然而，在炎症微环境条件下IGFPB5是否参与调控间充质干细胞骨向分化尚不清楚。
目的：探讨IGFBP5在炎症微环境下对牙周膜干细胞成骨分化的影响及分子调控机制，为炎症微环境下牙周组织再生寻找治疗靶点。
方法：①采用酶消化法分离培养人牙周膜干细胞，通过流式细胞术检测其表面抗原标志物；②分别以肿瘤坏死因子α、白细胞介素17模拟体内炎症微环境作用，并建立IGFBP5稳定敲低的细胞系，然后进行成骨诱导分化，检测碱性磷酸酶活性、成骨分化相关标志性基因及相关的组蛋白去甲基化酶的表达。该研究的实施符合天津医科大学口腔医院的相关伦理要求。
结果与结论：①加入肿瘤坏死因子α、白细胞介素17后，牙周膜干细胞成骨能力降低，具体表现为碱性磷酸酶活性及成骨分化相关基因OCN、BSP mRNA表达显著降低；②基因沉默IGFBP5进一步加重了肿瘤坏死因子α、白细胞介素17对牙周膜干细胞的成骨抑制作用，表现在碱性磷酸酶活性及成骨分化相关基因OCN、BSP mRNA表达进一步降低；③炎症因子刺激及基因沉默IGFBP5同时影响了组蛋白去甲基化酶KDM2A、KDM3B、KDM5B、JMJD6 mRNA的表达；④结果提示IGFBP5在炎症微环境下对牙周膜干细胞的成骨分化过程可能起到积极作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8511-2658(刘大勇)

关键词: 胰岛素样生长因子结合蛋白5, 牙周膜干细胞, 成骨分化, 炎症微环境, 肿瘤坏死因子α, 白细胞介素17, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have confirmed that insulin-like growth factor-binding protein 5 (IGFBP5) is highly expressed in dental stem cells and exerts roles by activating multiple signaling pathways. However, it is unclear whether IGFPB5 is involved in the regulation of mesenchymal stem cell osteogenic differentiation in inflammatory microenvironment.
OBJECTIVE: To study the influence and molecular mechanism of IGFBP5 on osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells under inflammatory microenvironment, and to provide a new therapeutic target for periodontal tissue regeneration in inflammatory microenvironment.
METHODS: After periodontal ligament stem cells were isolated and collected, their surface antigen markers were detected by flow cytometry. The stable IGFBP5 knock-down cell lines were established, and were cultured in osteogenic differentiation medium containing tumor necrosis factor α and interleukin 17. We then detected alkaline phosphatase activities and mRNA expression of marker genes relating to osteogenic differentiation and histone methyltransferase. The study protocol was implemented in line with the ethic requirements of Tianjin Medical University Hospital of Stomatology.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The osteogenic capacity of periodontal ligament stem cells decreased under stimulation of tumor necrosis factor α and interleukin 17. Compared with the blank control group, the activity of alkaline phosphatase and the expressions of osteogenic differentiation related genes OCN and BSP were significantly reduced after osteoblastic induction. (2) Gene silencing of IGFBP5 allowed tumor necrosis factor α and interleukin 17 to further inhibit the osteogenesis of periodontal ligament stem cells, characterized by decreased alkaline phosphatase activity and further decreased expression of osteoblastic differentiation related genes OCN and BSP. (3) Inflammatory factor stimulation and gene silencing of IGFBP5 also affected the mRNA expression of histone demethylases KDM2A, KDM3B, KDM5B and JMJD6. To conclude, IGFBP5 may play a positive role in the osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells.

Key words: insulin-like growth factor binding protein 5, periodontal ligament stem cells, osteogenic differentiation, inflammatory microenvironment, tumor necrosis factor α, interleukin 17, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

刘大勇，王颖铖谣，孙瑞鑫，刘凡，贾智. 炎症细胞因子刺激下胰岛素样生长因子结合蛋白5对牙周膜干细胞成骨分化的积极效应[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(33): 5256-5262.

Liu Dayong, Wang Yingchengyao, Sun Ruixin, Liu Fan, Jia Zhi. Effects of insulin-like growth factor-binding protein 5 on osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells stimulated by inflammatory cytokines[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(33): 5256-5262.

图/表（结果） 3

2.1 流式细胞术检测牙周膜干细胞表面标志物 取第3代牙周膜干细胞进行流式细胞仪分析，OCT-4阳性细胞率为76.5%，SSEA-4阳性细胞率为26.2%，CD45阳性细胞率为1.81%，CD90阳性细胞率为64.2%，Stro-1阳性细胞率为95.3%，见图1。

2.2 基因沉默IGFBP5对牙周膜干细胞在肿瘤坏死因子α、白细胞介素17刺激下成骨分化的影响

2.2.1 碱性磷酸酶的表达 在成骨诱导第7天，对正常牙周膜干细胞、基因沉默IGFBP5的牙周膜干细胞进行碱性磷酸酶染色。与成骨分化组相比，加入肿瘤坏死因子α、白细胞介素17分别处理后碱性磷酸酶表达降低，而基因沉默IGFBP5后碱性磷酸酶表达进一步降低^[17]，见图2。

在成骨诱导第5天，检测碱性磷酸酶活性这一早期成骨分化指标。成骨诱导条件下，基因沉默IGFBP5使得碱性磷酸酶活性显著降低。与成骨分化组相比，肿瘤坏死因子α组、白细胞介素17组碱性磷酸酶活性均有显著降低，基因沉默IGFBP5使得碱磷酶活性进一步减低。各组数据差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

实验结果证明，加入肿瘤坏死因子α、白细胞介素17炎症刺激后牙周膜干细胞的碱性磷酸酶表达明显降低，基因沉默IGFBP5可以进一步抑制炎症微环境下牙周膜干细胞的碱性磷酸酶表达。

2.2.2 成骨相关分子的表达 成骨诱导第7天，采用RT-PCR法检测成骨相关分子OCN、BSP mRNA表达。与正常的牙周膜干细胞相比，基因沉默IGFBP5的牙周膜干细胞成骨相关分子OCN、BSP表达降低；加入肿瘤坏死因子α后，基因沉默IGFBP5的牙周膜干细胞成骨相关基因表达均显著降低，加入白细胞介素7后，基因沉默IGFBP5的牙周膜干细胞成骨分子OCN表达降低，而BSP表达无显著变化，见图4。

2.2.3 组蛋白去甲基化酶KDM2A、KDM3B、KDM5B及JMJD6 mRNA表达 见图4。与成骨分化组相比，加入炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素17刺激后，KDM2A mRNA表达水平均显著升高。成骨分化后，与正常牙周膜干细胞相比，基因沉默IGFBP5牙周膜干细胞KDM2A mRNA的表达变化差异无显著性意义。在肿瘤坏死因子α组中观察到，与正常牙周膜干细胞相比，基因沉默IGFBP5造成KDM2A mRNA表达显著降低。在白细胞介素17组中观察到，与正常牙周膜干细胞相比，基因沉默IGFBP5使得KDM2A mRNA表达显著升高。

与成骨分化组相比，加入炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素17刺激后，KDM3B mRNA表达水平均显著降低。成骨诱导条件下，与正常牙周膜干细胞比较，基因沉默IGFBP5牙周膜干细胞KDM3B mRNA的表达显著降低；在肿瘤坏死因子α组中观察到，与正常牙周膜干细胞相比，基因沉默IGFBP5使得KDM3B mRNA表达进一步减低。在白细胞介素17组中观察到，与正常牙周膜干细胞组相比，基因沉默IGFBP5使得KDM3B mRNA表达水平升高。

与成骨分化组相比，加入炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素17刺激后，KDM5B mRNA表达水平均显著升高。成骨诱导条件下，与正常牙周膜干细胞比较，基因沉默IGFBP5后KDM5B mRNA的表达降低。在肿瘤坏死因子α组中观察到，与正常牙周膜干细胞相比，基因沉默IGFBP5使得KDM5B mRNA的表达水平进一步升高。在白细胞介素17组中观察到，与正常牙周膜干细胞相比，基因沉默IGFBP5后KDM5B mRNA表达水平略有降低。

成骨诱导条件下，与正常牙周膜干细胞比较，基因沉默IGFBP5后JMJD6 mRNA的表达水平升高。成骨诱导条件下，加入肿瘤坏死因子α处理后，与正常牙周膜干细胞相比，基因沉默IGFBP5使得JMJD6 mRNA的表达水平降低。加入白细胞介素17处理后，与正常牙周膜干细胞相比，基因沉默IGFBP5后JMJD6 mRNA的表达水平降低。

上述实验证明，肿瘤坏死因子α、白细胞介素17处理后可显著抑制牙周膜干细胞及基因沉默IGFBP5牙周膜干细胞中成骨分化相关分子OCN，BSP mRNA的表达，同时对基因沉默IGFBP5牙周膜干细胞中组蛋白去甲基化酶KDM2A、KDM3B、KDM5B及JMJD6 mRNA的表达均有影响。

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引言

间充质干细胞作为组织再生的重要细胞，存在于骨髓^[1-2]、脂肪^[3]、肌腱、神经、脐带^[4]、牙齿及其支持组织中^[5-7]，作为未分化的成体干细胞，具有自我更新、克隆形成、多向分化和免疫调节能力。目前，牙源性间充质干细胞包括牙髓干细胞、根尖牙乳头干细胞、牙周膜干细胞等。前期研究发现，牙周膜干细胞具有较高的成骨分化能力，可作为牙周组织再生最有潜力的种子细胞。自体牙周膜干细胞在小型猪的动物实验模型中已取得良好的治疗效果^[8-9]。

研究表明，炎症性疾病和自身免疫性疾病的发生与间充质干细胞的功能缺陷密切相关^[10-12]。炎症性牙周组织来源牙周膜干细胞的多向分化能力和免疫调节能力出现明显异常，对T细胞增殖的抑制能力和T细胞亚群的分化调节能力显著减弱，并且促进Th17细胞分化和白细胞介素17的产生^[10]，可能是牙周组织再生困难的原因之一。在牙周炎中，炎症细胞因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素8等表达显著增高，其中肿瘤坏死因子α作为牙周炎症中一种主要的促炎性细胞因子^[7]，一方面可激活骨吸收促进破骨细胞前体细胞数量增加^[6^，^13]，另一方面肿瘤坏死因子α负向调控骨形成，体外抑制成骨向分化^[12]。除此之外，T细胞辅助细胞Th17所分泌的白细胞介素17也参与慢性牙周炎症反应。早期研究表明白细胞介素17炎症因子可激活NF-κB及MAPK信号通路，而且Th17细胞可以直接产生RANKL促进破骨细胞前体细胞的分化及增殖，增强破骨细胞的形成及激活。综上所述，炎症微环境是导致间充质干细胞再生能力下降的重要原因，如何克服体内炎症微环境对间充质干细胞介导的牙周组织再生的影响成为新的挑战。

胰岛素样生长因子结合蛋白5(insulin-like growth factor-binding protein 5，IGFBP5)在骨组织中大量存在，受到胰岛素样生长因子和其他激素、生长因子的调节。研究表明，卵巢切除小鼠注射rhIGFBP5之后，成骨细胞活性增强，骨重建速度增快，同时血清中骨钙蛋白和碱性磷酸酶表达水平升高。IGFBP5可通过MAPK信号通路促进单核细胞、NK细胞和CD4⁺T细胞的迁移，参与炎症反应的调节^[14]。

课题组前期研究发现IGFBP5在牙源性干细胞中高表达，并参与激活ERK、JNK或MER信号通路，调控间充质干细胞的分化^[15-16]。通过IGFBP5获得性及丧失性功能研究证实KDM6B可以通过影响IGFBP5启动子部位H3K27甲基化水平从而影响牙源性干细胞成骨分化^[10]。

因此，该研究拟探讨IGFBP5在炎症微环境下对牙周膜干细胞成骨分化的影响及分子调控机制，为炎症微环境下牙周组织再生寻找治疗靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年5月至2017年5月在天津医科大学中心实验室完成。

1.3 材料 选取在天津医科大学口腔医院颌面外科门诊就诊，因正畸治疗需拔除的上下颌前磨牙，获取其牙周膜组织。患者年龄13-26岁，无龋病及牙周病，无全身系统性疾病。患者知情同意并签订知情同意书。收集新鲜拔出的离体牙体组织放入加有双抗的PBS离心管中，并于4 ℃贮存，要求3 h内进行原代牙周膜干细胞的分离培养。该研究经天津医科大学口腔医院伦理委员会批准。

1.4 实验方法

1.4.1 人牙周膜干细胞原代分离培养 使用含不同浓度双抗的PBS由高浓度至低浓度进行反复冲洗离体牙，用刀片轻轻刮取根中1/3的牙周膜组织，注意不应过于用力，避免刮下根中部位的牙骨质。用眼科剪将牙周膜组织充分剪碎，加入Dispase酶及Ⅰ型胶原酶各1 mL，37 ℃水浴消化1 h，每10 min将离心管从水浴锅中取出轻弹进行震荡，直至观察到组织消化成絮状或溶液澄清，加入2倍体积含体积分数为15%胎牛血清的α-MEM培养基终止消化，1 000 r/min离心7 min，弃除上清液，重悬，接种于培养皿。

1.4.2 流式细胞术检测牙周膜干细胞表面抗原标志物 在显微镜下观察第3-5代细胞融合至80%左右，则可用于实验。应用PBS洗涤细胞两三次，滴加胰蛋白酶，在显微镜下观察细胞逐渐缩成球形，轻晃培养皿有部分细胞悬浮时，加入2倍体积的含体积分数为15%胎牛血清的α-MEM培养基终止消化，离心后弃掉上清液，加入PBS重悬细胞，再次离心弃掉上清液，加入含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基重悬细胞，细胞计数后准备铺板。将1×10⁸ L^-1细胞接种于6孔板中，培养第3天应用PBS冲洗两三次，加入胰蛋白酶进行消化，加入2倍体积的含体积分数为15%胎牛血清的α-MEM培养基终止消化，离心弃上清，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，离心弃上清，加入1 mL PBS重悬并清洗细胞，离心弃上清，重复清洗2次。将上述所得细胞进行OCT-4、SSEA-4、CD45、CD90、Stro-1的抗体孵育，避光保存，放入4 ℃冰箱内过夜，第2天取出EP管，离心弃上清，PBS重悬细胞清洗2次，洗涤完成后加200 μL PBS均匀重悬细胞沉淀，准备上流式细胞仪检测。

1.4.3 牙周膜干细胞在肿瘤坏死因子α、白细胞介素17模拟炎症微环境刺激下的成骨能力检测 将生长状况良好的纯化的第3代牙周膜干细胞以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于6孔板，待细胞融合达80%后，更换培养基为成骨诱导液(含体积分数为10%胎牛血清、10 mmoI/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C、0.25 μmol/L地塞米松、0.36 mol/L磷酸二氢钾、1∶200谷氨酰氨的α-MEM培养基)，每2 d换液1次。取对数生长期的第4代牙周膜干细胞，以1×10⁵ L^-1的细胞浓度接种于35 mm培养皿，待细胞融合达80%后，弃上清，按以下分组加入新鲜培养基：①含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基(未分化组)；②成骨诱导培养基(成骨分化组)；③含有1 μg/L肿瘤坏死因子α的成骨诱导培养基(肿瘤坏死因子α组)；④含有50 μg/L白细胞介素17的成骨诱导培养基(白细胞介素17组)。成骨诱导5 d后进行碱性磷酸酶活性检测，7 d后进行碱性磷酸酶染色。

1.4.4 慢病毒转染 通过NCBI数据库查询IGFBP5的基因序列，应用Whitehead提供的程序分别设计IGFBP5的SiRNA，将其插入慢病毒的shRNA载体上，测序鉴定，最终构建成IGFBP5shRNA质粒。IGFBP5的shRNA与相应的包装质粒(VSVG)，对293T细胞进行转染，48 h后收集上清，进行病毒滴度鉴定，分装后保存在-80 ℃冰箱。IGFBP5的shRNA转染第3代牙周膜干细胞48 h后，用puromycin筛选7 d得到IGFBP5基因敲除的稳定转染细胞，在mRNA和蛋白水平检测shRNA的敲除效果。

1.4.5 碱性磷酸酶活性检测 应用碱性磷酸酶活性检测试剂盒检测牙周膜干细胞成骨诱导第5天的碱性磷酸酶活性，比较肿瘤坏死因子α、白细胞介素17模拟的不同炎症微环境对成骨分化的影响。分别配制碱性磷酸酶活性检测的底物及缓冲液，用PBS清洗细胞两三次，向培养皿中加入含有1%PMSF的RIPA裂解液，尽可能充分裂解细胞。将裂解后的细胞放入培养箱内约10 min，然后用细胞刮刀刮下裂解后的细胞，收集细胞裂解液并放置于EP管中，在4 ℃条件下，以10 000 r/min的转速离心5 min，收集上清。取96孔板，每孔加入细胞上清液10 μL，将所配制好的碱性磷酸酶底物及碱性磷酸酶缓冲液按照1∶1比例各50 μL加入到待测样本中，设置8个重复孔，应用锡箔纸避光保存放置于培养箱内30 min，应用酶标仪检测405 nm波长下吸光度值。通过标准曲线公式计算出各组碱性磷酸酶活性。

1.4.6 碱性磷酸酶染色 牙周膜干细胞成骨诱导第7天进行碱性磷酸酶染色。应用PBS清洗细胞两三次，加入固定液，室温静置2 min；应用移液枪去除固定液，加入去离子水洗两三次，加入碱性磷酸酶染色液3 mL，应用锡箔纸避光室温下染色20 min；应用移液枪去除染色液，加入去离子水清洗。若细胞着色较浅，复染1次。使用显微镜观察染色结果，采用IPP软件采集图像。

1.4.7 Real Time RT-PCR检测 成骨诱导的第7天，采用Real Time RT-PCR检测成骨相关基因OCN、BSP以及相关去甲基化酶KDM3B、KDM5B、KDM2A、JMJD3 mRNA的表达。

(1)设计引物：在NCBI上检索基因RNA序列，根据引物设计原则设计引物，并在NCBI上检测所设计的引物上下游序列所对应的基因特异性。RT-PCR引物序列由金唯智生物科技有限公司合成，见表1。

(2)RNA提取：应用PBS洗涤细胞两三次；弃掉PBS，加入TRIzoL静置两三分钟，反复吹打细胞，尽可能使细胞充分裂解，将其转移至EP管中，准备进一步提取。向EP管中加入氯仿，上下颠倒，剧烈摇荡30 s，室温孵育三四分钟，在4 ℃条件下10 000×g离心10-15 min，可见EP管中液体水相分层，移液枪小心吸取上层水相，避免吸出中间的白色薄层。将所吸出的水相转移至新的EP管中，加入异丙醇，上下颠倒15-20 s，在室温环境下静置10 min，在4 ℃条件下10 000×g离心10-12 min，弃掉上清液，加入体积分数为75%乙醇，应用漩涡器混匀，在4 ℃条件下7 500×g离心5 min，弃上清，应用RNA溶解液视沉淀量溶解RNA，于60 ℃孵育8-10 min。

(3)总RNA浓度及纯度测定：用无RNA酶水做空白对照，调零。向测定孔中加入无RNA酶水99 μL与RNA标本1 μL，轻轻吹打混匀，分光光度计测定RNA的浓度及纯度，吸光度值在1.8-2.0的RNA样本纯度较高，可用于后续实验。

(4)反转录合成第一链cDNA：采用反转录试剂盒，将总RNA反转录为cDNA做模板进行RT-PCR反应。

(5)PCR扩增：用PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，取产物5 μL加样于凝胶点样孔，行潜水槽平板电泳，电压80 V条件下电泳50 min。结束后取出凝胶，置于紫外投射仪下，采用quality one凝胶成像分析系统扫描分析各光带灰度值。

(6)结果分析：以各组样本OCN、BSP、KDM3B、KDM5B、KDM2A、JMJD3目的基因条带与GAPDH参照基因条带灰度值之比作为OCN、BSP、KDM3B、KDM5B、KDM2A、JMJD3表达的相对含量。

1.5 主要观察指标 成骨诱导分化过程中加入肿瘤坏死因子α、白细胞介素17炎症因子刺激后，成骨相关基因OCN、BSP以及相关去甲基化酶KDM3B、KDM5B、KDM2A、JMJD3 mRNA的表达水平变化。

1.6 统计学分析 实验均重复3次以上，取平均值。使用SPSS 19.0进行统计学分析，计量资料采用方差分析，两两比较采用SNK-Q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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IGFBP5在骨组织中大量存在，卵巢切除小鼠注射rhIGFBP5之后，成骨细胞活性增强，骨重建速度增快，同时血清骨钙蛋白和碱性磷酸酶表达水平升高^[18-19]。IGFBP5可通过MAPK信号通路促进单核细胞、NK细胞和CD4⁺T细胞的迁移，参与炎症反应的调节^[20-21]。

课题组前期研究发现，在成骨分化过程中IGFBP5的表达升高，且表现为时间依赖性，提示IGFBP5可能在干细胞介导的组织再生中有重要作用^[22]。

该研究结果显示，敲低IGFBP5的牙周膜干细胞经炎症因子(肿瘤坏死因子α及白细胞介素17)处理后，碱性磷酸酶染色变浅，碱性磷酸酶活性降低，成骨分化基因OCN和BSP的表达降低，提示IGFBP5可能促进牙周膜干细胞成骨分化。共价组蛋白在修饰调控染色质的运动功能中发挥了重要的作用，甲基化作为组蛋白的一种重要的修饰类型可以同时发生在赖氨酸及精氨酸上，这种修饰在生物发展进程中处于动态变化过程，主要涉及异染色质的形成、染色质的激活及转录调控。这种共价修饰组蛋白状态的稳定是由组蛋白甲基化转移酶及组蛋白去甲基化酶共同调控的。

该实验同时检测了组蛋白去甲基化酶KDM2A、KDM3B、KDM5B及JMJD6 mRNA的表达。研究发现，SFRP2可以增强根尖牙乳头干细胞的成骨及成牙向分化潜能，而KDM2A可影响SFRP2的转录，其主要由于KDM2A可影响SFRP2启动子部位H3K4及H3K36三甲基化的状态，从而影响SFRP2基因的转录激活，这与该研究中成骨诱导后KDM2A表达下降结果相一致，而炎症因子白细胞介素17处理后基因沉默IGFBP5牙周膜干细胞中KDM2A表达升高较明显，推测白细胞介素17处理后IGFBP5可参与抑制KDM2A的表达。已有研究表明KDM5B基因在分化过程中可以参与调控H3K4的甲基化状态，而其对成骨分化的影响还未见报道，该研究表明成骨诱导条件培养基下，牙周膜干细胞中KDM5B的表达显著下降，证明成骨诱导分化可能抑制KDM5B的表达，作者猜想该抑制作用可能与KDM5B基因在分化过程中参与调控H3K4的甲基化状态有关。与成骨分化组相比，加入炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素17刺激后，KDM5B表达水平均显著升高，挽救了由于成骨诱导所造成的KDM5B低表达状态。在KDM3B mRNA的检测结果中，与成骨分化组相比，加入炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素17刺激后，KDM5B表达水平均显著降低，这提示研究者关注炎症微环境对相关去甲基化酶表达的影响。研究表明JMJD6对成脂分化相关基因的表达与激活是必须的，主要依赖于Jumonji C结构域的催化激活。IGFBP5丧失性功能实验后，成骨诱导条件培养下JMJD6表达略有上升，提示其可能原因在于IGFBP5参与调控成骨分化从而抑制JMJD6的表达。炎症因子肿瘤坏死因子α作用下，基因沉默IGFBP5牙周膜干细胞中JMJD6的表达受到明显抑制。

综上所述，使用肿瘤坏死因子α及白细胞介素17模拟的体外炎症微环境作用下显著抑制了牙周膜干细胞的成骨向分化，IGFBP5在其中起到了至关重要的作用。同时，组蛋白去甲基化酶KDM2A、KDM3B、KDM5B及JMJD6 mRNA的表达也受到炎症因子作用及IGFBP5表达水平的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

炎症细胞因子刺激下胰岛素样生长因子结合蛋白5对牙周膜干细胞成骨分化的积极效应

Effects of insulin-like growth factor-binding protein 5 on osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells stimulated by inflammatory cytokines

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