人牙周膜干细胞条件培养液对炎症组织来源牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3506

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (13): 2005-2010.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3506

• 牙髓及牙周膜干细胞 Dental pulp and periodontal ligament stem cells • 上一篇下一篇

人牙周膜干细胞条件培养液对炎症组织来源牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响

刘焱1，高翔1，赵晓霞2，陈青宇1，3，高俊武1

1包头医学院口腔医学院，内蒙古自治区包头市 014060；2呼和浩特市第一医院神经内科，内蒙古自治区呼和浩特市 010000；3包头医学院第一附属医院口腔科，内蒙古自治区包头市 014060

收稿日期:2020-06-04 修回日期:2020-06-05 接受日期:2020-06-12 出版日期:2021-05-08 发布日期:2020-12-28
通讯作者: 高翔，硕士，教授，主任医师，硕士研究生导师，包头医学院口腔医学院，内蒙古自治区包头市 014060
作者简介:刘焱，女，1984年生，汉族，2012年中国医科大学毕业，硕士，讲师，主要从事牙周组织再生研究工作。
基金资助:
包头医学院科学研究基金资助项目(BYJJ-QM 201768)，项目负责人：刘焱

Effects of conditioned medium of human periodontal ligament stem cells on proliferation and osteogenic differentiation of inflammatory tissue-derived human periodontal ligament stem cells

Liu Yan1, Gao Xiang1, Zhao Xiaoxia2, Chen Qingyu1, 3, Gao Junwu1

1School of Stomatology, Baotou Medical College, Baotou 014060, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2Department of Neurology, Hohhot First Hospital, Hohhot 010000, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 3Department of Stomatology, The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014060, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2020-06-04 Revised:2020-06-05 Accepted:2020-06-12 Online:2021-05-08 Published:2020-12-28
Contact: Gao Xiang, Master, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, School of Stomatology, Baotou Medical College, Baotou 014060, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Liu Yan, Master, Lecturer, School of Stomatology, Baotou Medical College, Baotou 014060, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Baotou Medical College, No. BYJJ-QM201768 (to LY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
间充质干细胞的条件培养基：间充质干细胞在再生医学中被广泛研究并用于临床治疗修复受损的骨、血管、神经及牙体等组织，间充质干细胞条件培养基中存在的诸多营养物质(细胞因子、生长因子、趋化因子、细胞外囊泡等)决定了其促进组织修复与再生的潜能。间充质干细胞条件培养基具有高特异性、低免疫原性及无细胞毒性的特点，有望成为组织修复再生治疗的新手段。
炎症组织来源的牙周膜干细胞：存在于牙周炎患者的患牙牙周组织中的干细胞，即“炎症”牙周膜干细胞。相较于正常组织来源的牙周膜干细胞，其来源更广泛、伦理问题更少、患者接受度也更高，在牙周组织工程和再生医学中具有应用前景。然而受体内炎症微环境的影响，其部分生物学性能(成骨分化、免疫调节能力等)可能受损，会影响其组织再生能力。

背景：富含生物活性物质的条件培养液可以维持干细胞增殖活性和生物学特性的稳定。健康组织来源的人牙周膜干细胞条件培养液能否影响炎症组织来源人牙周膜干细胞的增殖和成骨分化对于牙周组织再生重建意义重大。
目的：探讨健康组织来源的人牙周膜干细胞条件培养液对炎症组织来源人牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响。
方法：由健康成人的正常牙周韧带中分离、纯化人牙周膜干细胞并传代培养，对融合达80%的第3代人牙周膜干细胞进行无血清培养基连续培养24 h，收集上清液即得到人牙周膜干细胞条件培养液。采取有限稀释克隆法培养来源于慢性牙周炎患者牙周韧带中的人牙周膜干细胞，分别在含50%人牙周膜干细胞条件培养液+50%常规培养液(条件培养液处理组)及常规培养液(对照组)2种条件下培养。免疫荧光染色法检测两组细胞中波形丝蛋白、角蛋白和间充质干细胞标志物STRO-1的表达；MTT比色法结合流式细胞术分析细胞增殖活性；经体外成骨诱导后，碱性磷酸酶试剂盒和RT-PCR检测两组细胞碱性磷酸酶活性和成骨相关基因(Runx2，OPN，OCN)的表达水平。
结果与结论：①两组细胞均符合成体干细胞的形态特征，呈现长梭形或多角形，倒置相差显微镜下观察其形态无明显差异；②经免疫荧光染色可见两组细胞均呈现波形丝蛋白阳性表达，角蛋白阴性表达，且间充质干细胞标志物STRO-1阳性表达；③MTT结果显示：培养第3，5，7天时，条件培养液处理组的细胞增殖活性均显著高于对照组(P < 0.01)；④细胞周期分析显示：与对照组相比，条件培养液处理组细胞处于G2/M期及S期的数量明显增多(P < 0.05)；⑤体外成骨诱导第5，7天时，条件培养液处理组碱性磷酸酶活性高于对照组(P < 0.05)；⑥成骨诱导21 d后，成骨相关基因Runx2、OPN、OCN在条件培养液处理组的表达量均显著高于对照组(P < 0.01，P < 0.05)；⑦综上，健康组织来源的人牙周膜干细胞条件培养液可以促进炎症组织来源人牙周膜干细胞的增殖及成骨分化。
https://orcid.org/0000-0003-1897-8501(刘焱)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 人牙周膜干细胞, 条件培养液, 炎症, 增殖, 成骨分化, 基因, 实验

Abstract: BACKGROUND: The conditioned medium rich in bioactive substances can maintain the stability of proliferation and biological characteristics of stem cells. Whether the conditioned medium of human periodontal stem cells derived from healthy tissues can affect the proliferation and osteogenesis of human periodontal stem cells derived from inflammatory tissue is significant for periodontal tissue regeneration and reconstruction.
OBJECTIVE: To investigate the effect of human periodontal stem cells-conditioned medium derived from healthy tissue on proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal stem cells derived from inflammatory tissue.
METHODS: HPDLSCs from normal periodontal ligaments of healthy adults were isolated, purified and cultured in vitro. Human periodontal stem cells-conditioned medium was obtained by collecting the supernatants from the serum free medium which was used for the third generation cells grown up to 80% of the bottom of the bottle after 24 hours cultivation. Human periodontal stem cells derived from inflammatory tissue were obtained from pericementum of periodontitis patients, and cultured by using limiting dilution assay. Human periodontal stem cells derived from inflammatory tissue were separately cultured under conditioned medium treatment group (conditioned medium containing 50% human periodontal ligament stem cells + 50% conventional medium) and control group (conventional medium). Protein expression levels of vimentin, Pan Cytokeratin, and stromal cell antigen STRO-1 were identified by immunofluorescence staining. The proliferative activity of cells was analyzed by MTT assay and flow cytometry. After osteogenesis in vitro, alkaline phosphatase activity and the expression levels of three osteogenesis related genes (Runx2, OPN, and OCN) were detected using alkaline phosphatase kit and RT-PCR, respectively in both groups.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Both groups of cells were in accordance with the morphological characteristics of adult stem cells, showing long fusiform or polygonal shapes. There was no significant difference in cell morphology between the two groups under inverted phase contrast microscope. (2) The immunofluorescence staining showed that cells in both groups were positive for the specific antibodies of vimentin and STRO-1, but negative for the specific antibody of Pan Cytokeratin. (3) The results of MTT assay showed that after 3, 5 and 7 days, the proliferative activity of conditioned medium treatment group was higher than that of control group (P < 0.01). (4) Cell cycle analysis showed that compared with the control group, the number of cells in G2/M phase and S phase in conditioned medium treatment group increased significantly (P < 0.05). (5) At 5 and 7 days of osteogenic induction in vitro, alkaline phosphatase activity of conditioned medium treatment group was higher than that of control group (P < 0.05). (6) After 21 days of osteogenic induction, the expression levels of osteogenic related genes Runx2, OPN, and OCN in conditioned medium treatment group were significantly higher than those in control group (P < 0.01, P < 0.05). (7) In conclusion, human periodontal stem cells-conditioned medium derived from healthy tissues can enhance the proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal stem cells derived from inflammatory tissue.

Key words: stem cells, human periodontal ligament stem cells, conditioned medium, inflammation, osteogenic differentiation, gene, experiment

中图分类号:

刘焱, 高翔, 赵晓霞, 陈青宇, 高俊武. 人牙周膜干细胞条件培养液对炎症组织来源牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2005-2010.

Liu Yan, Gao Xiang, Zhao Xiaoxia, Chen Qingyu, Gao Junwu. Effects of conditioned medium of human periodontal ligament stem cells on proliferation and osteogenic differentiation of inflammatory tissue-derived human periodontal ligament stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(13): 2005-2010.

图/表（结果） 8

2.1 两组i-hPDLSCs的形态将第4代i-hPDLSCs以密度为103个/皿接种于直径为90 mm的培养皿中，对照组和条件培养液处理组分别培养5-7 d后，镜下可见两组细胞形态一致、均为长梭形或多角形，分散贴壁生长，见图1A，B；14 d后，两组细胞仍呈现梭形和多角形，细胞形态均无明显变化，见图1C，D，但条件培养液处理组的细胞量较对照组明显增多，且细胞排列更紧密呈现“漩涡状”。

2.2 两组i-hPDLSCs的标记物鉴定荧光显微镜下可见常规培养对照组和条件培养液处理组i-hPDLSCs均呈现波形蛋白阳性表达，胞浆呈红染，Hoechst33258作用于细胞核呈蓝染，见图2A，C。两组细胞均呈现角蛋白阴性表达，胞浆内未被染色，仅见Hoechst33258作用于细胞核呈蓝染，见图2B，D。结果提示两组细胞均为间充质来源，非上皮细胞来源。两组细胞均呈现STRO-1阳性表达，细胞浆呈绿染，同时胞核被Hoechest33258染为蓝色，见图3。

2.3 两组i-hPDLSCs的增殖能力
2.3.1 MTT检测结果培养第1天时，两组i-hPDLSCs的吸光度值相比差异无显著性意义(P > 0.05)，提示第1天时
hPDLSCs-CM对i-hPDLSCs的增殖未起到显著的促进作用。培养第3天时，两组细胞生长速度开始加快，两组细胞的数量和增殖活性都呈现上升趋势；培养第7天时，两组细胞吸光度值达峰值；在第3，5，7天时，条件培养液处理组i-hPDLSCs的吸光度值均显著高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.01)，说明随着培养时间的延长hPDLSCs-CM能促进i-hPDLSCs增殖，见图4，表2。

2.3.2 流式细胞仪测定细胞周期条件培养液处理组、对照组G0/G1期细胞所占比例分别为(74.59±0.68)%，(81.36±0.74)%，G2/M期细胞所占比例分别为(20.63±0.33)%，(13.51±0.52)%。条件培养液处理组i-hPDLSCs处于G2/M+S期的细胞量明显增多，说明条件培养液处理组细胞的增殖指数较对照组增高，且两组间差异有显著性意义(P < 0.05)，提示hPDLSCs-CM可以促进i-hPDLSCs进入DNA合成期，即有更多细胞发生细胞分裂，增殖加速，见图5。

2.4 两组i-hPDLSCs的成骨分化能力
2.4.1 碱性磷酸酶活性两组细胞分别经体外成骨诱导3，5，7 d后，碱性磷酸酶活性均明显增高。第3天时两组i-hPDLSCs的碱性磷酸酶活性差异无显著性意义(P > 0.05)；第5，7天时条件培养液处理组i-hPDLSCs的碱性磷酸酶活性均显著高于对照组(P < 0.05)，说明由于hPDLSCs-CM的作用，i-hPDLSCs的碱性磷酸酶活性被上调，且这种上调作用具有时间依赖性，见图6。

2.4.2 RT-PCR检测成骨相关基因的表达成骨诱导2周后，Runx2和OPN两种成骨相关基因在条件培养液处理组中的表达量均较对照组上调，差异有非常显著性意义(P < 0.01)；而OCN在条件培养液处理组的表达量高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明hPDLSCs-CM可以促进i-hPDLSCs成骨相关基因的表达，见图7。

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引言

牙周炎症的刺激会破坏牙周支持组织，不及时干预治疗还会引发牙齿松动脱落、口颌系统结构与功能受损，甚至会诱发和加重全身多种感染性疾病的发生发展[1-2]。有效控制牙周炎症的关键是消除组织局部和全身的刺激因素，抑制感染并重新获得已丧失牙周支持组织的修复与再生[3-4]。牙周基础治疗和翻瓣术能够有效清除致病菌，延缓或阻止牙周炎的进展，但受到机体修复自限性的制约，牙周组织新生仍难以获得。不断推陈出新的组织工程理论、材料和技术快速推动着牙周组织再生医学研究的发展[5-7]。人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)因其高度的组织同源性、自我增殖活力和多向分化潜能被公认为牙周组织工程研究中首选的种子细胞[8]。
组织工程学再生理论认为：种子细胞的来源受限、数量不足和生物学特性不完善都会导致组织再生的失败，而培养所处的局部微环境也对其生物学功能的发挥起着重要的调控作用[9]。现阶段科学研究和临床治疗所应用的hPDLSCs多取自患者第三磨牙或正畸牙，这在一定程度上限制了hPDLSCs在临床的广泛应用，故此拓阔种子细胞来源成为牙周组织再生研究领域亟需解决的问题。适宜的微环境会正向促进干细胞保持生物学活性，已有研究表明，将衰老的hPDLSCs置于年轻供者来源的hPDLSCs条件培养液环境进行培养，其增殖活力和分化潜能都有显著提高[10]；反之，不利的细胞外微环境会导致牙周组织形成和再生受到抑制，在慢性牙周炎症状态下，分泌增加的炎性因子和机体反应都会通过影响hPDLSCs的生物学特性而对牙周组织的再生起到负向影响[11]。从扩大来源和优化微环境角度出发，该实验采取酶消化组织块结合有限稀释克隆分选方法，获取临床常见多发的慢性牙周炎患者的人牙周膜干细胞(inflammatory human periodontal ligament stem cells，i-hPDLSCs)，并建立健康来源的人牙周膜干细胞条件培养液(human periodontal ligament stem cells-conditioned medium，hPDLSCs-CM)对其进行培养，检测hPDLSCs-CM作用前后i-hPDLSCs的增殖及成骨分化能力的改变，初步探索通过改善不良的炎症状态微环境，解决来源广泛且易于获得的i-hPDLSCs生物学特性缺陷的问题，为其在牙周组织工程的应用提供实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计干细胞在不同培养条件下增殖活性和成骨分化功能的体外观察实验。
1.2 时间及地点 2017年10月至2019年12月在包头医学院中心实验室完成。
1.3 材料 16-18周岁正畸拔除的健康前磨牙，20-45周岁慢性牙周炎患者因重度牙周炎需拔除的患牙，均由包头医学院第一附属医院口腔科提供。DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco公司)；青、链霉素(华北制药集团有限责任公司)；Ⅰ型胶原酶、地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸(Sigma公司)；小鼠抗人角蛋白、小鼠抗人波形丝蛋
白、小鼠抗人STRO-1单克隆抗体(Dako公司)；羊抗小鼠 IgG-TRITC 荧光二抗、荧光染料Hoechst 33258(Sigma公司)；碱性磷酸酶检测试剂盒(上海碧云天)；反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒(Takara公司)；荧光显微镜(BX61+DP-71，日本Olympus公司)；酶联免疫监测仪(SpectraMax M2，美国Molecular Devices公司)；RT-PCR仪(Rotor -Gene 3000，澳大利亚Corbett公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 酶消化组织块结合有限稀释法克隆化培养i-hPDLSCs 选取20-45周岁慢性牙周炎患者因重度牙周炎症治疗需拔除的松动患牙。所有患牙无明显龋坏，无牙髓及根尖周病变，无黏膜疾患，同时可刮取到所需牙周韧带组织。所有纳入个体无系统疾病，患者知情同意并签署同意书。
患牙行拔除术前以体积分数75%乙醇充分消毒牙体周围组织，离体后立刻用含高倍双抗DMEM培养基送至超净台内，PBS充分冲洗牙根表面，刮取根中1/3牙周韧带，修剪组织块约1 mm3大小，用3 g/L的Ⅰ型胶原酶在37 ℃下作用1 h，离心弃上清，以含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液吹匀沉淀，平铺于培养皿底部，置37 ℃、体积分数为5%CO2孵箱中进行培养，2 d后首次换液，以后每隔3 d换液。取对数生长期的第1代牙周韧带细胞，消化、计数，调整密度至10-15个/mL，接种于96孔板，每孔100 μL，
常规培养，8-12 h后镜下观察标记单个细胞孔，每孔补加200 μL培养基，5 d后换液，标记孔细胞克隆扩增达孔底1/3-1/2 时，消化、传代，取第4代细胞进行后续实验。该实验是在严格纳入来源标准的基础上取了若干个克隆进行的多次独立重复实验。

1.4.2 制备hPDLSCs-CM 选取16-18周岁正畸拔除的健康前磨牙，所有患牙无明显龋坏，无牙髓及根尖周病变，无黏膜疾患且无牙周疾患，同时可刮取到所需牙周韧带组织。所有纳入个体无系统疾病，患者及家属知情同意并签署同意书。依1.4.1方法获得健康组织来源的hPDLSCs。当第3代hPDLSCs长满培养皿底80%时，以无血清培养液替换常规培养液，继续培养24 h后收集上清，即为hPDLSCs-CM。取第4代i-hPDLSCs分别在含50% hPDLSCs-CM +50%常规DMEM培养液(条件培养液处理组)及常规DMEM培养液(即含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，对照组)中进行培养。
1.4.3 免疫荧光染色鉴定不同处理组i-hPDLSCs的细胞特异标记物条件培养液处理组和对照组i-hPDLSCs培养24 h后制备细胞爬片，PBS漂洗后，以预冷的40 g/L多聚甲醛固定
30 min，1%牛血清白蛋白封闭30 min，加入一抗，于湿盒中孵育过夜，次日以PBS冲洗两三次，避光条件下加入TRITC标记的二抗作用1 h，Hoechst33258进行细胞核复染5 min，甘油封固、标记，镜下观察标记物波形丝蛋白、角蛋白及STRO-1的表达情况。
1.4.4 MTT法检测不同处理组i-hPDLSCs的增殖能力取第4代i-hPDLSCs进行消化、计数，以2×104/cm2的密度接种于96孔板中，每孔100 μL。依实验设计分别用含50%
hPDLSCs-CM的培养液及常规培养液继续培养1，3，5，7 d，每组设3个重复孔。培养结束后，每孔加入20 μL MTT溶液，37 ℃、体积分数为5%CO2条件下继续孵育4 h，吸弃上清再向各孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10-15 min。采用酶联免疫监测仪在490 nm波长处测定各孔吸光度值，并以时间为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制生长曲线。
1.4.5 流式细胞仪分析不同处理组i-hPDLSCs的细胞周期培养至第4代，收集条件培养液处理组和对照组的i-hPDLSCs各约3×106个，制成单细胞悬液，离心后加入体积分数为70%乙醇吹打混匀，4 ℃过夜，离心弃去乙醇，避光加入
50 mg/L碘化丙锭1 mL，4 ℃下染色30 min，通过200目尼龙筛网，流式细胞仪测定细胞周期。
1.4.6 不同处理组i-hPDLSCs的碱性磷酸酶活性测定条件培养液处理组和对照组的i-hPDLSCs以2×104/cm2密度接种于96孔板，每孔100 μL，继续培养24 h，弃上清，在两组细胞培养液中都加入10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠和 50 mg/L抗坏血酸进行成骨诱导，继续培养3，5，7 d，每组设3个重复孔。依据碱性磷酸酶试剂盒上所示的步骤进行检测。
1.4.7 RT-PCR检测不同处理组i-hPDLSCs的成骨相关基因表达条件培养液处理组和对照组的i-hPDLSCs成骨诱导2周，采用Trizol法提取细胞总RNA，以Nano Drop对所提取的RNA进行质检。用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA(以β-actin为内参，反转录Runx2、OPN和OCN目的基因)，
50 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，16 ℃ 10 min，合成cDNA第一链，再用Nano Drop仪器测定浓度，将其配平到50 mg/L，作为模板待用。按每孔20 μL体系加入96孔板，每组重复3次，进行RT-PCR扩增。扩增条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，
60-64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环25-32次；72 ℃延伸7 min。
扩增引物序列及反应体系见表1。

1.5 主要观察指标将来源于慢性牙周炎患者牙周韧带中的i-hPDLSCs分别在含50% hPDLSCs-CM +50%常规培养液(条件培养液处理组)及常规培养液(对照组)2种条件下进行培养，观察两组细胞形态、特异性标记物的表达、增殖活性以及经体外成骨诱导后成骨分化功能有无差异。
1.6 统计学分析实验数据均采用SPSS 17.0软件进行分析处理，计量资料用x±s表示，采用独立样本t 检验分析比较两组间差异，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

牙周炎症是成人失牙最主要的原因，牙周组织长时间处于慢性感染状态不但会引发和加重口腔系统疾病，甚至还会危害全身健康[12-13]。控制炎症基础上的缺损组织再生是牙周炎治疗的关键[14]。2004年，首次从成人的恒牙牙周膜组织中成功分离出克隆形成细胞即hPDLSCs，并证实其增殖活性和诱导后具备向成牙骨质/成骨细胞样细胞及脂肪细胞分化的能力[8]，提示hPDLSCs在牙周组织工程的应用优势。然而，健康的hPDLSCs主要来源于拔除的第三恒磨牙、乳牙及正畸患者的年轻恒牙，组织含量少，分离、纯化和培养都存在一定困难，离体后hPDLSCs的生物学特性受到培养微环境的调控缺乏稳定性。因此，保持hPDLSCs的增殖特性和特定的分化潜能对于确保回植到体内的干细胞质量至关重要，更是直接影响牙周组织修复再生的成功率[15-17]。
干细胞的定位、扩增及其生物学功能的实现都受到细胞外微环境的干预和调控[18-20]。已有研究证实，对干细胞施以慢性炎症的持续刺激会降低其增殖、迁移能力，组织修复再生的潜能也会受到抑制[21]。KONG等[22]发现受炎症微环境影响的PDLSCs多向分化潜能下降，成骨能力的下调尤为显著，这对于牙周组织的再生非常不利。体外培养的细胞会释放分泌活性物质到培养液中，这种经过培养某种细胞后而富含细胞分泌物的培养液即为条件培养液[23]。间充质干细胞通过分泌多种细胞因子(包括趋化因子、生长因子、黏附分子等)调节细胞外环境[24-25]。外泌体就是由间充质干细胞分泌的一种活性因子，它具有提高白细胞计数水平、缓解炎症反应的作用，同时还通过减小缺血再灌注损伤患者的梗死面积，改善心脏功能[26]。还有研究发现，牙囊细胞作为一种发育期的间充质干细胞，其条件培养液可诱导脂肪来源间充质干细胞向成牙骨质和成骨方向分化[27]。
从扩大种子细胞来源和改善微环境角度出发，实验选取临床上常见的牙周炎患者的i-hPDLSCs，通过健康患者来源的
hPDLSCs-CM (条件培养液处理组)与常规培养液(对照组)2种差异培养条件对其进行培养和诱导。倒置相差显微镜下可见两组i-hPDLSCs均符合成纤维细胞样长梭形或多角形的结构特征，两组细胞形态无明显差异。hPDLSCs是从牙周膜中分离获取的间充质干细胞，目前还没有确定的研究辨别出一种或几种特殊的hPDLSC特异性标志物。波形丝蛋白在间充质来源细胞中呈阳性表达，角蛋白则在上皮来源细胞中呈阳性表达。条件培养液处理组和对照组i-hPDLSCs均呈现波形蛋白阳性表达、角蛋白阴性表达，说明两组细胞均为间充质来源，非上皮细胞来源。目前尚无明确的研究结论给出一种或几种特殊的hPDLSCs标志物。2004年，SEO等最早成功分离获得hPDLSCs，并使用早期间充质干细胞标志物STRO-1、CD146/MICU8作为PDLSCs的标志物。该实验通过免疫荧光染色证实了两组i-hPDLSCs的STRO-1均呈阳性表达，符合间充质干细胞特征。组织的生长、修复与重建都需要依靠细胞的增殖来完成，实验以MTT法比较两组细胞的增殖能力，培养第3，5，7天时，条件培养液处理组i-hPDLSCs的吸光度值均高于对照组(P < 0.01)，说明hPDLSCs-CM对于i-hPDLSCs增殖具有促进作用。细胞增殖动力学的另一个重要参考指标是细胞周期[28]。条件培养液处理组G2/M期和S期细胞所占比例显著增高，提示hPDLSCs-CM可以促进i-hPDLSCs进入DNA合成期，促进细胞发生有丝分裂及加速细胞增殖。
成骨分化是牙周组织修复重建的关键步骤，经过矿化诱导的hPDLSCs能够表达成骨样特性标记物也是其具备成骨特性的重要证据[29]。该实验通过测定条件培养液处理组与对照组i-hPDLSCs的碱性磷酸酶活性及成骨相关基因的表达，来评价hPDLSCs-CM对i-hPDLSCs成骨分化能力的影响。经体外成骨诱导第3天时，两组i-hPDLSCs的碱性磷酸酶活性无显著差异(P > 0.05)；第5，7天时条件培养液处理组细胞的碱性磷酸酶活性高于对照组(P < 0.05)，说明正常来源
hPDLSCs-CM对i-hPDLSCs的碱性磷酸酶活性有上调作用，且这种作用具有时间依赖性。成骨诱导2周后RT-PCR检测结果显示，条件培养液处理组Runx2、OPN和OCN成骨相关基因的表达量均显著高于对照组。综上，碱性磷酸酶活性和相关成骨基因检测结果都支持hPDLSCs-CM可以促进i-hPDLSCs的成骨分化。
通过健康患者来源的hPDLSCs-CM改善炎症微环境，取自临床中常见、多发的慢性牙周炎患者来源的i-hPDLSCs也可以获得较强的增殖活性和稳定的成骨分化能力用于牙周组织的重建与再生，这也为干细胞治疗牙周炎症的动物实验和临床试验提出了新的思路与挑战。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人牙周膜干细胞条件培养液对炎症组织来源牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响

Effects of conditioned medium of human periodontal ligament stem cells on proliferation and osteogenic differentiation of inflammatory tissue-derived human periodontal ligament stem cells

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