基于生物信息学考察骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的潜在机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1843

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (33): 5249-5255.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1843

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 下一篇

基于生物信息学考察骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的潜在机制

安太健¹，张威²，杨红²，王庆峰³

辽宁中医药大学附属医院，¹脑病K2科，²脑病K3科，辽宁省沈阳市 110032；³辽宁中医药大学，辽宁省沈阳市 110032

修回日期:2019-07-02 出版日期:2019-11-28 发布日期:2019-11-28
通讯作者: 张威，博士，副主任医师，辽宁中医药大学附属医院脑病K3科，辽宁省沈阳市 110032；并列通讯作者：杨红，硕士，主治医师，辽宁中医药大学附属医院脑病K3科，辽宁省沈阳市 110032
作者简介:安太健，男，1981年生，辽宁省沈阳市人，朝鲜族，2010年辽宁中医药大学毕业，硕士，主治医师，主要从事脑病康复治疗。
基金资助:
国家自然科学基金青年基金项目(81703993)，项目负责人：张威

Potential mechanisms of bone marrow stem cells in the treatment of ischemic stroke based on bioinformatics

An Taijian¹, Zhang Wei², Yang Hong², Wang Qingfeng³

¹Department of Encephalopathy K2, ²Department of Encephalopathy K3, Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, Liaoning Province, China; ³Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, Liaoning Province, China

Revised:2019-07-02 Online:2019-11-28 Published:2019-11-28
Contact: Zhang Wei, MD, Associate chief physician, Department of Encephalopathy K3, Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, Liaoning Province, China; Yang Hong, Master, Attending physician, Department of Encephalopathy K3, Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, Liaoning Province, China
About author:An Taijian, Master, Attending physician, Department of Encephalopathy K2, Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, Liaoning Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81703993 (to ZW)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
DisGeNET疾病数据库：是生物信息分析领域除CTD数据库外，比较常用的数据库之一，该数据库整合了大量的疾病数据库及文献报道，除了传统的疾病背景网络基因构建外，该数据库还直接嵌入cytoscape软件，直接对疾病的背景网络进行分析，该4.0版本共包含17 381个基因，15 093种疾病、异常和表型。
生物信息学：在生命科学研究过程中，借助计算机信息化手段，对已获得的复杂数据进行系统化分析处理，以获得其中相互关系的研究。

摘要
背景：在治疗缺血性脑卒中过程中，干细胞疗法已经获得了广泛的关注，然而对于其所涉及到的复杂调控机制，相关研究较少。
目的：应用生物信息学方法研究骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的分子调控机制。
方法：应用DisGeNET数据库调取缺血性脑卒中的背景网络，再通过GEO在线数据库获得骨髓干细胞治疗前后差异表达明显的基因；再将这些基因对上述背景网络进行打靶处理，最终获得与缺血性脑卒中相关的靶点，应用DAVID和String数据库分析这些靶标基因之间的关系。
结果与结论：①DisGeNET数据库可调取的缺血性脑卒中的调控分子靶标共计393个；GEO数据库获得的骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的数据集内，与缺血性脑卒中发病密切相关的分子靶点共计39个，其中下调的分子靶点包含FBN1，NPY，MMP10，ITGB3，GLA等30个，上调的分子靶点包含EZH2，ESR1，IL16，LGALS2等9个；②由String数据库获得其对应的互作关系后，可获得上述39个靶点的互作关系，共有10个节点大于平均节点度，分别为TP53，SPP1，VCAM1，PTGS2，ESR1，F3，TIMP2，CD40，EZH2，ITGB3，除了ESR1和EZH2是上调基因外，其余均为下调基因；③在该过程中，主要调控的通路有血管剪切力调节及松弛素信号通路；IL-7、NFKB等炎症相关的信号通路；神经活性配体-受体、同种异体排斥反应等信号通路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7516-4446(安太健)

关键词: 缺血性脑卒中, 干细胞疗法, 骨髓间充质干细胞, 分子网络, 生物信息学分析, 蛋白互作网络, 发育, 分子网络

Abstract:

BACKGROUND: Stem cell therapy has received sustained attention in the treatment of prognosis of ischemic stroke. However, little research has been done on its complex regulatory mechanism.
OBJECTIVE: To study the molecular regulatory network of stem cell therapy for ischemic stroke by bioinformatics.
METHODS: DisGeNET database was used to collect the background network of ischemic stroke, and then GEO online database was used to obtain differentially expressed genes before and after treatment with bone marrow stem cells. Gene targeting was performed in the above genes to obtain stroke-related targets. DAVID and STING databases were used to analyze the relationship between these target genes.
RESULTS AND CONCLUSION: In the DisGeNET database, there were 393 molecular targets for ischemic cerebrovascular accident regulation. Thirty-nine molecular targets were confirmed to be related to ischemic cerebrovascular accident in the data set of stem cell therapy in the GEO database. Among them, 30 were down-regulated, including FBN1, NPY, MMP10, ITGB3, and GLA; and 9 were up-regulated, including EZH2, ESR1, IL16, and LGALS2. (2) Based on the corresponding interaction relation described in String database, the above 39 targets could be obtained. There were 10 nodes with a greater node degree, namely TP53, SPP1, VCAM1, PTGS2, ESR1, F3, TIMP2, CD40, EZH2, and ITGB3. Except for up-regulated genes, ESR1 and EZH2, the others were down-regulated genes. (3) The main regulatory pathways involved in this process included: vascular shear stress regulation and relaxin signaling pathways directly acting on blood vessels; inflammatory-related signaling pathways such as IL-7, NFKB; neuroactive ligand-receptor, allograft rejection and other signaling pathways.

Key words: ischemic stroke, stem cell therapy, bone marrow mesenchymal stem cells, molecular network, bioinformatics analysis, protein interaction network, development, molecular network

中图分类号:

安太健，张威，杨红，王庆峰 . 基于生物信息学考察骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的潜在机制[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(33): 5249-5255.

An Taijian, Zhang Wei, Yang Hong, Wang Qingfeng. Potential mechanisms of bone marrow stem cells in the treatment of ischemic stroke based on bioinformatics[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(33): 5249-5255.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的潜在调控分子靶点 在DisGeNET数据库内，以ischemic cerebrovascular accident(NO.C0948008)为关键词，获得缺血性脑卒中的调控分子靶标共计393个(Summary模式)，再以String构建上述分子靶标对应的网络数据库；同时根据GEO数据库GSE21393数据集的运算结果，获得的差异表达基因对上述网络进行打靶处理，最终获得的结果如图1所示。根据上述结果可知，其对应的下调靶点包括FBN1，NPY，MMP10，ITGB3，GLA，SEMA6A，GPX3，TIMP2，FGF13，PTGS2，F3，TFPI2，PTGES，OLR1，NQO1，PTPRG，SERPINE2，SGK1，CD40，PDE4D，PLA2G7，EDIL3，SPP1，ADRB2，ACVRL1，NR4A3，ANGPT1，TP53，REM1，EPHX2等30个分子靶点，其对应的上调靶点包括EZH2，ESR1，IL16，LGALS2，GCH1，SHMT1，VCAM1，P2RX7，LPAR2等9个靶点。

2.2 骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中潜在分子靶点的互作关系 对上述靶点进行整理后，由String数据库获得其对应的互作关系，再由Cytoscape构建其PPI网络，见图2。剔除离散节点后，对该网络进行拓扑结构分析可知：该网络中的节点共计31个，对应的边共计66个，平均节点度为4.26，在全部29个节点中，共有10个节点大于平均节点度，分别为TP53，SPP1，VCAM1，PTGS2，ESR1，F3，TIMP2，CD40，EZH2，ITGB3，除了ESR1和EZH2是上调的基因外，其余均为下调的基因。可将上述10个分子靶点视作骨髓干细胞疗法治疗缺血性脑卒中过程中的重要潜在分子靶点。

2.3 骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中潜在分子靶点功能分析 对已经获得的全部39个靶点进行相应的功能分析。由于需要分析上述靶点对缺血性脑卒中背景网络的全部调控通路，因此并未直接以上述靶点进行KEGG功能富集，而是进行了网络扩展后，再行分析：首先，在String数据库内，获得上述靶点的相邻靶点；其次，应用Cytoscape软件对获得的全部靶点进行PPI网络构建；最后，将该PPI网络放入Cytoscape的clueGO插件内进行分析(P ≤ 0.05)，最终获得上述关键靶点所调控的KEGG通路图，见图3。

由图3可知，已经获得的靶点主要介入的功能有3类，第1类诸如血管剪切力调节及松弛素信号通路等直接作用于血管的通路；第2类为诸如IL-7，NFKB等炎症相关的信号通路，第3类为神经活性配体-受体，同种异体排斥反应相关的信号通路。由该结果可知，在应用骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中过程中，模型小鼠症状好转受多个KEGG通路所调控。

为进一步获得上述39个靶点所对应的生物学功能，对上述靶点进行基因本体论的生物过程(GO-BP)功能分析，直接将上述靶点放入Cytoscape的clueGO插件内(P ≤ 0.05)，所得的功能富集结果见图4。由图4可知，已经获得的靶点主要介入的功能有3类：第1类诸如直接介入血氧代谢的过程，如一氧化氮合成/代谢等；第2类为组织修复，如组织重塑、血管内皮细胞迁移等；第3类为代谢调控，如花生四烯酸代谢、血小板活化等功能。该结果表明，在应用骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的过程中，所获得的差异表达基因可通过调节多个生物学过程以实现对缺血性脑卒中的治疗。

参考文献

[1]陈红霞,杨志敬,潘锐焕,等.中西医结合康复方案对脑卒中后偏瘫患者运动功能、日常生活活动能力和生活质量的影响[J].中国中西医结合杂志,2016,36(4):395-398.

[2]中华医学会神经病学分会,中华医学会神经病学分会脑血管病学组.中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018[J].中华神经科杂志,2018, 51(9):666-682.

[3]柏晓玲,王天兰,石国凤,等. 临床护理路径在脑梗死患者健康教育中应用效果的Meta分析[J].中华医院管理杂志,2016, 32(2): 158-160.

[4]张永明,姚奕,王金标,等.骨髓间充质干细胞动脉移植对缺血性脑损伤小鼠行为学的影响[J].中华行为医学与脑科学杂志,2016,25(9): 791-796.

[5]郑臻,母得志.骨髓间充质干细胞治疗缺氧缺血性脑损伤的研究现状[J].中华妇幼临床医学杂志(电子版),2017,13(4):373-377.

[6]Donega V, van Velthoven CT, Nijboer CH, et al. Intranasal mesenchymal stem cell treatment for neonatal brain damage: long-term cognitive and sensorimotor improvement. PLoS One. 2013;8(1):e51253.

[7]van Velthoven CT, Kavelaars A, van Bel F, et al. Mesenchymal stem cell treatment after neonatal hypoxic-ischemic brain injury improves behavioral outcome and induces neuronal and oligodendrocyte regeneration. Brain Behav Immun. 2010;24(3): 387-393.

[8]Jellema RK, Wolfs TG, Lima Passos V, et al. Mesenchymal stem cells induce T-cell tolerance and protect the preterm brain after global hypoxia-ischemia. PLoS One. 2013;8(8):e73031.

[9]Donega V, Nijboer CH, van Tilborg G, et al. Intranasally administered mesenchymal stem cells promote a regenerative niche for repair of neonatal ischemic brain injury. Exp Neurol. 2014;261:53-64.

[10]van Velthoven CT, Kavelaars A, van Bel F, et al. Mesenchymal stem cell transplantation changes the gene expression profile of the neonatal ischemic brain. Brain Behav Immun. 2011;25(7): 1342-1348.

[11]Hu ZL, Li N, Wei X, et al. Neuroprotective effects of BDNF and GDNF in intravitreally transplanted mesenchymal stem cells after optic nerve crush in mice. Int J Ophthalmol. 2017;10(1):35-42.

[12]Liu X, Wang X, Li A, et al. Effect of mesenchymal stem cell transplantation on brain-derived neurotrophic factor expression in rats with Tourette syndrome. Exp Ther Med. 2016;11(4):1211-1216.

[13]Wang Q, Sun G, Gao C, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells attenuate 2,5-hexanedione-induced neuronal apoptosis through a NGF/AKT-dependent pathway. Sci Rep. 2016;6:34715.

[14]Sohni A, Verfaillie CM. Mesenchymal stem cells migration homing and tracking. Stem Cells Int. 2013;2013:130763.

[15]Wei ZZ, Gu X, Ferdinand A, et al. Intranasal delivery of bone marrow mesenchymal stem cells improved neurovascular regeneration and rescued neuropsychiatric deficits after neonatal stroke in rats. Cell Transplant. 2015;24(3):391-402.

[16]Cui C, Cui Y, Gao J, et al. Intraparenchymal treatment with bone marrow mesenchymal stem cell-conditioned medium exerts neuroprotection following intracerebral hemorrhage. Mol Med Rep. 2017;15(4):2374-2382.

[17]Hasan A, Deeb G, Rahal R, et al. Mesenchymal Stem Cells in the Treatment of Traumatic Brain Injury. Front Neurol. 2017;8:28.

[18]马志波. CTA与DSA在脑血管疾病诊断中的价值研究[J].中国医学创新,2013,10(5):110-111.

[19]周平,谢伟杰,孙桂波,等.缺血性脑卒中发病机制及药物干预研究进展[J].世界最新医学信息文摘,2018,18(34):53-54,61.

[20]孟文婷,李东翔,佟玲.缺血性脑卒中的治疗研究进展[J].中国新药杂志,2016,25(10):1114-1120.

[21]付睿,戴威,席春江,等.不同剂量阿托伐他汀对缺血性脑卒中介入诊疗术后对比剂肾损害的预防作用研究[J].中国全科医学,2017,20(7): 812-816.

[22]王伊龙.短暂性脑缺血发作的中国专家共识[J].中国实用乡村医生杂志,2013,20(2):883-885.

[23]Compston A. Brain repair: an overview. J Neurol. 1994;242 (1 Suppl 1):S1-4.

[24]易娟,李贵南.神经干细胞移植治疗新生儿脑损伤的前景展望[J].中国新生儿科杂志, 2017, 32(5):398-400.

[25]Song M, Kim YJ, Kim YH, et al. Long-term effects of magnetically targeted ferumoxide-labeled human neural stem cells in focal cerebral ischemia. Cell Transplant. 2015;24(2): 183-190.

[26]Chen L, Qiu R, Li L, et al. The role of exogenous neural stem cells transplantation in cerebral ischemic stroke. J Biomed Nanotechnol. 2014;10(11):3219-3230.

[27]Wang J, Xia J, Zhang F, et al. Galectin-1-secreting neural stem cells elicit long-term neuroprotection against ischemic brain injury. Sci Rep. 2015;5:9621.

[28]Tavares I. Human neural stem cell transplantation in spinal cord injury models: how far from clinical application. Stem Cell Res Ther. 2013;4(3):61.

[29]林小娟,唐毅,陈建豪,等.脂肪干细胞移植对大鼠脑缺血后微血管生成及MT1-MMP表达的影响[J].中国实用神经疾病杂志, 2018, 21(14):1514-1520.

[30]Yao Y, Zheng XR, Zhang SS, et al. Transplantation of vascular endothelial growth factor-modified neural stem/progenitor cells promotes the recovery of neurological function following hypoxic-ischemic brain damage. Neural Regen Res. 2016; 11(9):1456-1463.

[31]Komatsu K, Honmou O, Suzuki J, et al. Therapeutic time window of mesenchymal stem cells derived from bone marrow after cerebral ischemia. Brain Res. 2010;1334:84-92.

[32]吴中华.脑外源性神经因子基因修饰神经干细胞对脑卒中的神经保护机制[J].中国组织工程研究, 2015,19(45):7331-7336.

[33]Li M, Zhou ZP, Sun M, et al. Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate, a Pentose Phosphate Pathway Product, Might Be a Novel Drug Candidate for Ischemic Stroke. Stroke. 2016;47(1):187-195.

[34]Gudkov AV, Komarova EA. Pathologies associated with the p53 response. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010;2(7):a001180.

[35]Vaseva AV, Marchenko ND, Ji K, et al. p53 opens the mitochondrial permeability transition pore to trigger necrosis. Cell. 2012;149(7):1536-1548.

[36]Yan YP, Lang BT, Vemuganti R, et al. Osteopontin is a mediator of the lateral migration of neuroblasts from the subventricular zone after focal cerebral ischemia.Neurochem Int.2009;55(8):826-832.

[37]Ellison JA, Velier JJ, Spera P, et al. Osteopontin and its integrin receptor alpha(v)beta3 are upregulated during formation of the glial scar after focal stroke. Stroke.1998;29(8):1698-1706.

[38]李欣遥,张良荣,张硕,等.急性脑梗死患者血清骨桥蛋白水平的改变及其对预后的影响[J]. 中风与神经疾病杂志, 2016, 33(3): 211-214.

[39]张文婷,侯华娟,赵昊,等. P2Y1和ITGB3基因多态性与中国汉族大动脉粥样硬化性卒中患者阿司匹林抵抗的相关性[J].国际脑血管病杂志, 2017,25(11):1018-1022.

[40]Furie B, Furie BC. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 2005; 115(12):3355-3362.

[41]陈乔,朱金华,李征峰,等.红景天苷对新生大鼠缺氧缺血脑组织MMP-9、TIMP-1含量的影响[J].亚太传统医药,2017,13(13):6-8.

[42]Montaner J, Alvarez-Sabín J, Molina C, et al. Matrix metalloproteinase expression after human cardioembolic stroke: temporal profile and relation to neurological impairment. Stroke. 2001;32(8):1759-1766.

[43]Romanic AM, White RF, Arleth AJ, et al. Matrix metalloproteinase expression increases after cerebral focal ischemia in rats: inhibition of matrix metalloproteinase-9 reduces infarct size. Stroke. 1998;29(5):1020-1030.

[44]Bendeck MP, Hou G, Chen J, et al. Matrix, Matrix Metalloproteinases and Smooth Muscle Cell Function in Atherosclerosis. International Congress.2004;1262(2): 486-489.

[45]张毕奎. CD40/CD40L系统在脑梗塞疾病发生发展中的作用及机制研究[D].长沙:中南大学, 2013.

[46]陈建昌,孙其中,郝跃伟.阿司匹林抵抗的动脉粥样硬化缺血性脑卒中患者COX-2基因启动子区-765G/C多态性观察[J].山东医药,2016, 56(35):91-93.

[47]陈忠云,卫景沛,张洁,等.环氧化酶-2基因-765G/C位点多态性与缺血性脑卒中相关性的Meta分析[J].中国循证医学杂志, 2016,16(1): 48-53.

[48]丁利静,李菲,石京山,等.淫羊藿苷对大脑中动脉阻塞诱导的缺血性脑卒中模型大鼠的保护作用[J].遵义医学院学报, 2015,38(2): 137-145.

[49]李孝明.异补骨脂素通过雌激素α受体对脊髓的神经保护作用机制研究[D].上海:第二军医大学, 2017.

[50]杨青梅,白松,雷又鸣,等. EZH2的功能及在肿瘤中的表达[J].中国老年保健医学, 2014,12(6):72-75.

引言

脑卒中又称“中风”“脑血管意外”，是一种临床常见的急性脑血管疾病^[1]。临床脑卒中有缺血性脑卒中和出血性脑卒中2种，以缺血性脑卒中更为常见，为全部脑血管意外患者总数的69.6%-70.8%^[2]。临床缺血性脑卒中患病1年后的病死率为14.4%-15.4%，致死/残疾率则高达33.4%-33.8%^[2]。除死亡率较高外，该病所引发的氧化损伤会直接损害患者的神经系统，引起中枢神经损伤而残留诸如肢体、运动、语言障碍等后遗症。因此，在治疗过程中，除了药物溶栓外，神经保护及修复也是该病治疗的关键^[3]。

近年来，干细胞移植用于改善缺血性脑损伤的研究被广泛开展，该方法在动物实验中获得了较好的验证^[4-5]，主要机制包括脑组织神经功能的修复^[6-7]、神经细胞替代^[8-10]、神经营养因子分泌^[11-13]、趋化反应及促进血管再生等^[14-15]。而在众多干细胞中，以骨髓干细胞作为移植细胞最为常见。

骨髓干细胞是一类分化潜能较高的干细胞，取材方便、制备容易、稳定性好；骨髓干细胞经诱导分化后，可发育为神经细胞、神经胶质细胞^[16-17]，直接补充损伤的脑细胞；另一方面，骨髓干细胞的免疫原性较低，不会诱发剧烈的排斥反应，可进行同种异体移植。然而，针对骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的深层分子机制研究较少，特别是在其修复过程中的相关基因调控方式以及涉及到的分子网络尚不明晰。

基于此，该研究首先对DisGeNET疾病数据库内缺血性脑卒中的分子靶点数据进行整理，以该疾病的蛋白相互作用网络为背景网络；再调取GEO数据库内骨髓干细胞修复缺血性脑卒中的相关差异表达基因(DEGs)的芯片数据；应用上述差异表达基因对缺血性脑卒中的背景网络进行打靶处理，以获得骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的神经潜在分子靶点。应用String数据库，获得上述分子靶点的调控网络，再由DAVID数据库对所获得的网络靶点进行基因注释，从而获得骨髓干细胞修复缺血性脑卒中的分子网络功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 生物信息学分析。

1.2 时间及地点 实验于2018年9月至2019年2月在辽宁中医药大学康复中心完成。

1.3 方法

1.3.1 缺血性脑卒中的背景网络获取 DisGeNET(V6.0)疾病数据库是基于现有的研究成果，整理所得的基因-疾病关联关系的数据库。在该数据库内，以Ischemic Cerebrovascular Accident为关键词进行疾病搜索，可获得同缺血性脑卒中发病相关的全部已报道的分子靶点，获得缺血性脑卒中的调控分子靶标共计393个(Summary模式)，再以String构建上述分子靶标对应的网络数据库。

1.3.2 骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的差异表达基因筛选 在GEO数据库内，以ischemic cerebrovascular accident和bone marrow mesenchymal stem cells为关键词进行搜索，可获得骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的相关芯片组数据。经过筛选后最终以GSE21393数据集为样本进行后续的生物信息学分析。该研究由路易斯安那州立大学健康科学中心开展，具体实验如下：采用大脑中动脉闭塞法诱导C57BL/6小鼠缺血性脑卒中1 h后再灌注。从H-2KB- TSA58(immortmouse^TM)小鼠中分离相应的骨髓干细胞，并在模型小鼠再灌注24 h后静脉注射骨髓干细胞。在模型小鼠症状开始改善后(造模后的第14天)，分离出梗死脑组织，于33 ℃培养梗死处的细胞。根据基因芯片组配合实时荧光定量PCR，比较正常细胞及干细胞处理后梗死处浸润细胞的表达差异性。

该研究对芯片数据集以GEO2R进行数据挖掘，筛选条件为：差异性P值< 0.01，并且保证该靶点调控区间为：上调(Log FC≥1)和下调(Log FC≤-1)。将获得的差异表达基因在Unipro数据库内进行映射，使其由鼠源(Mus musculus)性映射至人源(Homo sapiens)，再进行后续的相关研究。

1.3.3 骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的潜在调控分子靶点 应用Cytoscape 3.7.1软件，以筛选出的差异表达基因对缺血性脑卒中背景网络进行打靶，进一步获得与缺血性脑卒中发病密切的差异表达基因；在Cytoscape 3.7.1软件内，分别应用Mcode和Cluster maker2插件，对所获得的差异表达基因的网络拓扑特性进行相关分析，最终获得骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的核心分子靶点及这些分子靶点的PPI网络调控关系。

1.3.4 骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的潜在分子靶点功能分析 在Cytoscape软件内，应用ClueGo插件对1.3.3所获得网络内的相关靶点分子的功能进行分析，其中KEGG信号通路的P值取< 0.05，GO-BP的P值取< 0.01，最终获得其治疗缺血性脑卒中的潜在调控机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

由缺血性脑卒中的病理机制可知，随患者脑部血液流变学的改变，患者脑细胞的能量代谢随之异常、衰竭，进而出现氧自由基损伤^[18]；损伤脑细胞中游离出炎性因子，并介导后续的炎症反应，进一步加重脑细胞的损伤，最终导致大量脑神经坏死及脑部细胞凋亡^[19]。临床针对缺血性脑卒中的治疗手段以手术为主，如颈动脉内膜剥脱术及颈动脉血管内支架成形术等^[20]，同时配合溶栓、抗血小板聚集、抗凝等药物^[21]。考虑到上述方法对脑部神经损伤的修复作用有限^[22]，而干细胞疗法被认为是治疗缺血性脑卒中所致神经损伤的潜在手段之一。早在1992年，Reynolds等就已经证明了中枢神经干细胞的存在^[23]。大量研究显示，中枢神经干细胞的自我更新、增殖和多向分化等特性，可直接补充缺血损伤部位的脑细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞^[24-27]，进而改善缺血性脑卒中患者的神经元损伤。

干细胞治疗缺血性脑卒中的优势有如下几个方面：①直接诱导分化为新的神经细胞，替换修复缺血损伤部位的脑组织；②可以自我迁移，经过分化的神经细胞可直接随神经进行迁移至受损的部位进行修复；③相比于脑部干细胞，外源性的干细胞免疫原性亦较低，基本没有排斥反应。因此，经过干细胞修复的神经元存活性及脑组织相容性较高^[28]。根据以往文献报道，可推测其作用的机制包含：①干细胞分化的神经元细胞补充了梗死部位已坏死的神经元细胞^[29]；②干细胞可抑制脑神经细胞的凋亡，延缓由于脑部缺血造成的神经细胞坏死，进而改善脑血管意外所致的神经功能缺失症候^[30]；③干细胞可分化为内皮细胞，经过迁移和分化后，再次形成新的血管，修复脑血管损伤^[31]。考虑到上述研究多从病理解剖学角度出发，而从分子机制角度则较少^[32]，因此对于干细胞修复缺血性脑卒中的分子机制进行系统研究，是进一步利用该方法进行临床治疗的关键。

以往针对干细胞修复缺血性脑卒中的分子机制研究，多聚焦于几个基因/通路之间上下游的互作关系。然而，该过程是一个多通路、多靶点的协同性作用的结果。若要理清其起效机制，则不能仅仅着眼于几个基因或几条通路的关系，这也极大限制了干细胞修复缺血性脑卒中的机制研究。随着基因组学的发展，以转录组学为代表，可借助海量芯片数据研究疾病在发病及治愈过程中相关分子调控机制。同时，借助生物信息学手段，可以将上述所获得的调控机制进行整合最终获得其相互关联的复杂网络。基于此，该研究通过DisGeNET、GEO、Cytoscape及String等数据库或软件，获得骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的关键靶点分子，进而确定了其潜在的调控机制，见图5。

根据研究结果可知，缺血性脑卒中模型小鼠注入骨髓干细胞后，大量分子靶点出现显著性下调，并介导了后续的一系列通路及表型变化。如图5所示，TP53是该过程中最重要的下调靶点分子。虽然根据Li等^[33]研究显示，缺血性脑卒中早期TP53的上调可诱导糖酵解通路，抑制凋亡因子保护缺血性损伤的神经；但随着进一步的缺血及缺氧、脑细胞损伤，TP53被诱导过表达，最终介导其下游的细胞凋亡通路^[34]，其最直接的调控靶点为Bcl-2/Bax，随着Bax的过表达，Caspases家族的联级反应被激活，进而诱导神经细胞的凋亡^[35]。骨髓干细胞疗法有效地抑制了TP53的过表达，并阻断其调控的Caspases凋亡通路，以保护神经细胞。骨桥蛋白(Osteopontin，SPP1)可调节脑室下区的神经母细胞的横向迁移^[36]。在缺血性脑卒中早期，随着梗死部位的小胶质细胞、星型胶质细胞激活，SPP1的表达开始上调，最终形成了一个保护屏障，保护脑组织^[37]，而随着梗死进程的延缓/结束，SPP1也随之下调至正常水平；李欣遥等^[38]研究则质疑了SPP1对于神经保护的作用，该研究证明了SPP1的过表达往往与动脉粥样硬化型脑梗死关系更为密切，并进一步推测SPP1的上调是其介导下游的一系列炎症反应所致。该研究结果显示，随着骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的进展，SPP1显著性下调，这有可能是缺血性脑卒中后期的正常生理反应，也有可能是随着脑组织的修复，炎症通路抑制的表现。

如图3所示，血管剪切力及动脉粥样硬化通路是诱发缺血性脑卒中的重要调控通路之一。该通路上的分子靶点，如整合素β3 (integrinbeta-3，ITGB3)可直接介导血小板的生物功能，使之黏附、聚集形成血栓^[39]；血小板组织因子(platelet tissue factor，F3)是直接促斑块形成的靶点分子，当血管被炎症细胞损伤后，其可直接诱导血小板变性，并通过介导组织因子的级联反应，形成纤维蛋白堵塞血管^[40]。而血管细胞黏附蛋白1则介导炎症细胞黏附形成血栓，并通过后续的炎症反应进一步损伤脑血管。上述3个靶点的表达均随治疗显著下调，结果提示骨髓干细胞疗法可直接影响缺血性脑卒中梗死处斑块的形成。

与上述3个分子靶点功能不同，TIMP2和CD40类似，都是与其配套的基因，实现对血管斑块破裂的生物功能的调控。如TIMP2主要通过平衡MMP/TIMP，以调节细胞外基质的降解和合成^[41]。TIMP2过表达会显著上调MMP的表达，从而降解细胞外基质，增加血脑屏障通透性。根据以往的meta分析显示^[42-43]，MMP的表达与脑梗死面积、神经功能缺损程度呈正相关；而血管内皮细胞上的CD40则是通过CD40/CD40L进行调节，来调控细胞外基质的降解和合成。随细胞外基质合成的减少和降解的增加，脑部的斑块出现破裂^[44]。除此之外，CD40可激活下游的炎症及血栓的相应信号通路，从而直接影响内皮及血管循环功能^[45]。

如图3所示，环氧化酶2(cyclooxygenase2，PTGS2)嵌套进了多条炎症相关的KEGG通路。现针对于该分子在缺血性脑卒中的研究，多集中于其基因的多态性与缺血性脑卒中发病之间的关系^[46-47]。作为前列腺素生物合成的限速酶，PTGS2参与到缺血性脑卒中后一系列的神经细胞炎症损伤过程，除了其自身介导的P38MAPK炎症通路外，其亦可损伤细胞，释放促凋亡因子直接诱发神经细胞的凋亡^[48]。随骨髓干细胞治疗进展，PTGS2显著下调，可推测多条炎症通路受到了抑制。

根据筛选的结果可知，部分靶点分子在骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的过程中出现了上调。雌性受体α (estrogen receptor α，ESR1)可通过调节雌激素对内皮型一氧化氮的诱导，增加成纤维细胞生长因子浓度，加速脑血管新生。根据李孝明^[49]的研究，随ESR1表达的上调，PI3K/AKT信号通路被磷酸化，可促进神经功能的恢复，保护脊髓神经。EZH2与缺血性脑卒中的相互关系研究报道较少，但根据其功能分析可知，EZH2与组蛋白去酰化酶关系密切，其可通过基因沉默、甲基化等调控激活组蛋白去酰化酶的功能^[50]。而在缺血性脑卒中发病过程中，组蛋白去酰化酶主要调控赖氨酸的乙酰化过程，通过移除乙酰基，损伤神经元，降低其预后的功能。在研究的数据集内，EZH2出现了上调，但是组蛋白去酰化酶的表达并无差异。结果提示，骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的过程中，EZH2会呈现过表达的趋势。但是对于其机制及功能，却并无显著性的影响，EZH2是否借助其他通路发挥作用，尚待进一步的研究。

综上所述，该研究应用生物信息学方法，针对骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中过程中差异表达基因的分析，确定了该方法对缺血性脑卒中多靶点、多途径的复杂网状调控，其核心靶点可通过脑组织保护、斑块破裂保护及炎症抑制等形式，改善缺血性脑卒中症候，并为进一步深入探讨其作用机制奠定了良好的基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

基于生物信息学考察骨髓干细胞治疗缺血性脑卒中的潜在机制

Potential mechanisms of bone marrow stem cells in the treatment of ischemic stroke based on bioinformatics

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[2]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[3]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[4]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[5]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[6]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[7]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[8]	潘其乐, 张洪, 周慧康, 蔡广. Greulich-Pyle图谱法、CHN法和中华05法评估儿童青少年骨龄的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 662-667.
[9]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[10]	张羽, 冯硕, 杨志, 张野, 孙健宁, 安伦, 陈向阳. 高位髋关节中心全髋关节置换治疗发育性髋关节发育不良后的三维步态评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 350-355.
[11]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[12]	孙建威, 杨新明, 张瑛. 孟鲁司特联合骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3962-3969.
[13]	张立书, 刘安琪, 何小宁, 金岩, 李蓓, 金钫. Alpl基因影响骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3970-3975.
[14]	郝晓娜, 张英杰, 李玉云, 许涛. 过表达脯氨酰寡肽酶的骨髓间充质干细胞修复肝纤维化模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3988-3993.
[15]	周元博, 王晋东. 股骨滑车发育不良的病因及治疗：是先天基因还是后天髌骨应力刺激[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3908-3913.