脱钙骨基质体外诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2128

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (1): 26-31.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2128

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脱钙骨基质体外诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化

陈俊毅，王宁，陈西淼，朱伦井，段江涛，张贤平，贝朝涌

桂林医学院附属医院四肢创伤骨科，广西壮族自治区桂林市 541001

收稿日期:2020-02-11 修回日期:2020-02-21 接受日期:2020-03-20 出版日期:2021-01-08 发布日期:2020-09-19
通讯作者: 贝朝涌，主任医师，教授，硕士生导师，桂林医学院附属医院四肢创伤骨科，广西壮族自治区桂林市 541001
作者简介:陈俊毅，男， 1993年生，福建省泉州市人，汉族，桂林医学院在读硕士，主要从事四肢创伤和骨组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81660366)

Osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by demineralized bone matrix in vitro

Chen Junyi, Wang Ning, Chen Ximiao, Zhu Lunjing, Duan Jiangtao, Zhang Xianping, Bei Chaoyong

Department of Limb Trauma, Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2020-02-11 Revised:2020-02-21 Accepted:2020-03-20 Online:2021-01-08 Published:2020-09-19
Contact: Bei Chaoyong, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Limb Trauma, Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Chen Junyi, Master candidate, Department of Limb Trauma, Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
he National Natural Science Foundation of China, No. 81660366

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
脱钙骨基质：是骨组织工程中理想的支架材料。理论上脱钙骨基质的成骨特性是其在去抗原后分泌骨形态发生蛋白2等生长因子，这些因子能够促进骨形成及骨组织矿化，加速愈合。
成骨分化：成骨分化过程中碱性磷酸酶活性升高，钙结节的形成和成骨相关因子ALP、RUNX2、OCN等表达增加等能从定性、定量方面确定成骨情况。
背景：脱钙骨基质脱钙去抗原处理后含有骨形态发生蛋白2等多种活性因子，在特定的关节微环境条件下这些活性因子能促进骨髓间充质干细胞转化为软骨细胞，并能促进其增殖。
目的：探索脱钙骨基质诱导骨髓间充质干细胞成骨分化及其作为细胞载体支架治疗骨缺损的研究价值。
方法：用全骨髓分离贴壁法提取大鼠股骨骨髓间充质干细胞，选取第3代骨髓间充质干细胞，添加完全培养基和50 mg/L脱钙骨基质诱导液培养，采用CCK-8方法检测骨髓间充质干细胞的增殖活性；诱导培养7，14 d后采用酶标法定量检测碱性磷酸酶活性；诱导培养21 d后茜素红染色观察钙结节形成情况；诱导培养21 d后采用qRT-PCR检测成骨相关因子的表达。脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞复合培养21 d采用普通光学倒置相差显微镜和扫描电镜观察两者的黏附情况。
结果与结论：①脱钙骨基质诱导液组第5，6天的细胞数量高于完全培养基组(P < 0.05)；②脱钙骨基质诱导液组诱导分化7，14 d的细胞碱性磷酸酶活性明显高于完全培养基组(P < 0.05)；③脱钙骨基质诱导液组形成钙结节明显多于完全培养基组；④脱钙骨基质诱导液组成骨因子RUNX2、ALP、OCN和OPN表达明显高于完全培养基组(P < 0.05)；⑤骨髓间充质干细胞在脱钙骨基质上贴附情况良好，分布在支架空隙间，互相爬行；⑥结果表明，脱钙骨基质可正向诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，黏附性良好，为组织工程复合材料的研究提供理论参考。

ORCID:0000-0002-7521-0243( 陈俊毅 )

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脱钙骨基质, 骨髓间充质干细胞, 成骨分化, 实验, 鼠, 材料

Abstract:

BACKGROUND: Demineralized bone matrix contains many kinds of active factors such as bone morphogenetic protein 2, which can promote bone marrow mesenchymal stem cells to transform into chondrocytes and promote their proliferation under specific joint microenvironment.

OBJECTIVE: To explore the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro induced by demineralized bone matrix and its research value as cell carrier scaffold in the treatment of bone defect.
METHODS: Rat femur bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and adhered with whole bone marrow. Bone marrow mesenchymal stem cells at passage 3 were selected and cultured with complete medium and 50 mg/L demineralized bone matrix inducer. The proliferation and viability of bone marrow mesenchymal stem cells were determined by CCK-8 assay. Alkaline phosphatase activities were quantitatively measured by enzyme labeling at 7 and 14 days after culture. Calcium nodule formation was observed by alizarin red staining 21 days after culture. The expression of osteogenesis-related factors was detected by qRT-PCR 21 days after culture. Demineralized bone matrix and bone marrow mesenchymal stem cells were cultured for 21 days. The adhesion of them was observed by ordinary optical inverted phase contrast microscope and scanning electron microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The number of cells on days 5 and 6 in the demineralized bone matrix group was higher than that in the complete medium group (P < 0.05). (2) Alkaline phosphatase activities were significantly higher in the demineralized bone matrix group than in the complete medium group at 7 and 14 days (P < 0.05). (3) Calcium nodules were more in the demineralized bone matrix group than in the complete medium group. (4) The expression of RUNX2, ALP, OCN and OPN was significantly higher in the demineralized bone matrix group than in the complete medium group (P < 0.05). (5) The adherence of bone marrow mesenchymal stem cells was good on the demineralized bone matrix; cells were distributed in the space between scaffolds and crawled with each other. (6) The results showed that demineralized bone matrix could induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into osteoblasts, and the adhesion was good, which provided theoretical reference for the research of tissue engineering composite materials.

Key words: stem cells, demineralized bone matrix, bone marrow mesenchymal stem cells, osteogenic differentiation, experiment, rat, material

中图分类号:

陈俊毅, 王宁, 陈西淼, 朱伦井, 段江涛, 张贤平, 贝朝涌. 脱钙骨基质体外诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 26-31.

Chen Junyi, Wang Ning, Chen Ximiao, Zhu Lunjing, Duan Jiangtao, Zhang Xianping, Bei Chaoyong. Osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by demineralized bone matrix in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(1): 26-31.

图/表（结果） 9

2.1 脱钙骨基质直径和表面特性扫描电镜测量其直径为100 nm左右，见图1。低糖DMEM完全培养基浸泡脱钙骨基质，获得50 mg/L脱钙骨基质诱导液。

2.2 骨髓间充质干细胞的形态和生长状况骨髓间充质干细胞贴壁生长良好，部分细胞重叠。第3代骨髓间充质干细胞呈长梭形, 均匀分布在整个培养皿，纯度高，见图2。

2.3 骨髓间充质干细胞表面标志物的鉴定结果流式细胞仪分析结果显示，第3代大鼠骨髓间充质干细胞表达CD29、CD44的阳性率分别为91.40%，98.13%，而表达CD14、CD45的阳性率分别为8.74%，1.12%，结果符合骨髓间充质干细胞特征，见图3。

2.4 骨髓间充质干细胞的增殖活性脱钙骨基质诱导液组第1，2天细胞数量无明显增加，第4天开始细胞数量开始明显增加，在第6天以后生长速度放慢，脱钙骨基质诱导液组第5，6天的细胞数量与完全培养基组比较差异有显著性意义(P <
0.05)，见图4。

2.5 碱性磷酸酶活性随着诱导时间延长，两组骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性均增高。在第7天和第14天，脱钙骨基质诱导液组的碱性磷酸酶活性明显高于完全培养基组(P < 0.05)，在第14天脱钙骨基质诱导液组的碱性磷酸酶活性明显高于第7天(P < 0.05)，见表2，图5。

2.6 茜素红染色结果成骨分化21 d，普通光学倒置相差显微镜下观察脱钙骨基质诱导液组有大块深染钙结节形成，呈深红色，部分矿化结节呈暗色不透光，而完全培养基组可见数个染成红色的结节，颜色较浅，面积较少，见图6。脱钙骨基质诱导液组在第21天的成骨分化程度显著强于完全培养基组。

2.7 qRT-PCR检测成骨相关基因的表达与完全培养基组相比，脱钙骨基质诱导液组ALP、Runx2、OCN和OPN相对表达量均升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图7。

2.8 普通光学倒置相差显微镜和扫描电镜下观察骨髓间充质干细胞在脱钙骨基质上的黏附情况共培养5 d，普通光学倒置相差显微镜观察骨髓间充质干细胞可成功附着脱钙骨基质上。共培养7 d，扫描电镜观察支架材料孔隙直径为400-500 μm，可见骨髓间充质干细胞呈长梭形，大量均匀分布在脱钙骨基质上，部分细胞相互爬行连接，填充在空隙周围，见图8。

参考文献

[1] BIANCO P, ROBEY PG, SIMMONS PJ. Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays. Cell Stem Cell. 2008;2(4): 313-319.
[2] PROCKOP DJ, OH JY. Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs): role as guardians of inflammation. Mol Ther. 2012;20(1):14-20.
[3] AL JUMAH MA, ABUMAREE MH. The immunomodulatory and neuroprotective effects of mesenchymal stem cells (MSCs) in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE): a model of multiple sclerosis (MS). Int J Mol Sci. 2012;13(7):9298-9331.
[4] CHU W, GAN Y, ZHUANG Y, et al. Mesenchymal stem cells and porous β-tricalcium phosphate composites prepared through stem cell screen-enrich-combine(-biomaterials) circulating system for the repair of critical size bone defects in goat tibia. Stem Cell Res Ther. 2018;9(1): 157.
[5] WANG Y, WANG K, LI X, et al. 3D fabrication and characterization of phosphoric acid scaffold with a HA/β-TCP weight ratio of 60:40 for bone tissue engineering applications. PLoS One. 2017;12(4): e0174870.
[6] KUTIKOV AB, SKELLY JD, AYERS DC, et al. Templated repair of long bone defects in rats with bioactive spiral-wrapped electrospun amphiphilic polymer/hydroxyapatite scaffolds. ACS Appl Mater Interfaces. 2015; 7(8):4890-4901.
[7] GLOWACKI J, MIZUNO S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers. 2008;89(5):338-344.
[8] VAN SUSANTE JL, BUMA P, VAN BEUNINGEN HM, et al. Responsiveness of bovine chondrocytes to growth factors in medium with different serum concentrations. J Orthop Res. 2000;18(1):68-77.
[9] RACKWITZ L, REICHERT JC, HAVERSATH M, et al. Cell-based and future therapeutic strategies for femoral head necrosis. Orthopade. 2018;47(9):770-776.
[10] 程胜承,刘义,景亚青,等.羟基磷灰石诱导脂肪间充质干细胞成骨分化的实验研究[J].天津医药,2018,46(7):687-691.
[11] MAENO T, MORIISHI T, YOSHIDA CA, et al. Early onset of Runx2 expression caused craniosynostosis, ectopic bone formation, and limb defects. Bone. 2011;49(4):673-682.
[12] KOMORI T. Animal models for osteoporosis. Eur J Pharmacol. 2015; 759:287-294.
[13] SODEK J, GANSS B, MCKEE MD. Osteopontin. Crit Rev Oral Biol Med. 2000;11(3):279-303.
[14] ZHANG B, SUN Y, CHEN L, et al. Expression and distribution of SIBLING proteins in the predentin/dentin and mandible of hyp mice. Oral Dis. 2010;16(5):453-464.
[15] ŠPONER P, FILIP S, KUČERA T, et al. Utilizing Autologous Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and β-Tricalcium Phosphate Scaffold in Human Bone Defects: A Prospective, Controlled Feasibility Trial. Biomed Res Int. 2016;2016:2076061.
[16] GJERDE C, MUSTAFA K, HELLEM S, et al. Cell therapy induced regeneration of severely atrophied mandibular bone in a clinical trial. Stem Cell Res Ther. 2018;9(1):213.
[17] BLUM B, MOSELEY J, MILLER L, et al. Measurement of bone morphogenetic proteins and other growth factors in demineralized bone matrix. Orthopedics. 2004;27(1 Suppl):s161-165.
[18] 张乃丽,张育敏,周沫,等.可塑形脱矿骨基质/透明质酸骨泥的制备与细胞相容性[J].中国组织工程研究,2013,17(47):8182-8188.
[19] ADKISSON HD, STRAUSS-SCHOENBERGER J, GILLIS M, et al. Rapid quantitative bioassay of osteoinduction. J Orthop Res. 2000;18(3): 503-511.
[20] 冯万文,夏亚一,党跃修,等.同种异体脱钙骨基质的组织工程学特性[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(51):9512-9516.
[21] 尹战海,韩健,刘淼,等.骨髓间充质干细胞复合骨基质明胶构建组织工程化软骨[J].中华骨科杂志,2005,25(3):170-175.
[22] JIN L, WAN Y, SHIMER AL, et al. Intervertebral disk-like biphasic scaffold-demineralized bone matrix cylinder and poly(polycaprolactone triol malate)-for interbody spine fusion. J Tissue Eng. 2012;3(1): 2041731412454420.
[23] 黄凯,陈雄生,贾连顺,等.纳米脱钙骨基质的制备及其性能检测[J].中国矫形外科杂志,2009,17(13):1017-1019.

引言

间充质干细胞是一类具有自我更新、免疫调控和多向分化潜能的单克隆多能干细胞，可以从骨髓、脂肪、脐血等组织中分离而得，具有一定的成骨、成软骨和成脂肪等分化潜能[1]。近年来发现间充质干细胞除具有自我复制和多向分化潜能外，还具有有低免疫原性和免疫调节作用[2-3]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是从骨髓中分离出来的具有强大增殖及成骨分化能力的干细胞，具有取材方便、易于在体外扩增和稳定表达以及免疫原性低等特点，是治疗骨缺损的良好细胞[4]。细胞载体支架是组织工程学技术修复骨缺损的另一个重要方面，其中支架材料在组织工程构建中起着核心作用，良好的组织相容性、无明显的机体毒性和免疫原性、多孔的立体结构和优良的材料微环境以及一定的降解率是理想生物材料的基本要求和特征[5-6]。
脱钙骨基质(demineralized bone matrix，DBM)主要含Ⅰ型胶原蛋白和其他一些生长因子如骨形态发生蛋白2(bone
morphogenetic protein-2，BMP-2)，脱钙程度、直径、颗粒大小以及复合物的组成和性能等诸多因素影响脱钙骨基质的生物活性[7]。脱钙骨基质良好的成骨能力和骨诱导性已经被认可，但也有人认为基质本身并不具有成骨作用。研究表明，脱钙骨基质脱钙去抗原处理后含有骨形态发生蛋白2等多种活性因子，在特定的关节微环境条件下这些活性因子能促进骨髓间充质干细胞转化为软骨细胞，并能促进其增殖[8]。综上所述，该实验主要探索脱钙骨基质诱导骨髓间充质干细胞成骨分化及其作为细胞载体支架治疗骨缺损的研究价值。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计完全随机设计方法。
1.2 时间及地点实验于2019年6月至2020年1月在桂林医学院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级SD大鼠5只，8周龄，体质量 (200±
20) g，雌雄不拘，由斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2016-0002。
1.3.2 实验主要试剂低糖DMEM/F12(赛默飞世尔科技公司)；胎牛血清(Gibco公司)；青链霉素、无酚红胰蛋白酶(索莱宝公司)；碱性磷酸酶检测试剂盒(酶标法，南京建成生物公司)；CCK-8试剂(日本同仁)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)；茜素红S染色液(赛业生物科技)；CD14、CD29、CD44和CD45流式一抗(赛默飞世尔科技公司)；二抗FITC标记(上海生工生物股份公司)；戊二醛固定液(北京雷根技术有限生物公司)。
1.3.3 实验主要仪器显微镜(荷兰飞利浦)；SW-CJ-2F型超净工作台(苏州净化公司)；Hettich ROTOFIX32A离心机(Hettich
公司)；CO2培养箱(Thermo Scientifc公司)；流式细胞仪(BIO-RAD公司)；普通光学倒置相差显微镜(OLYMPUS公司)；JSM-6390A型扫描电镜(JEOL公司)；实时荧光定量反转录PCR仪(上海睿铂赛生物科技有限公司)；MLDEL680型酶标仪(BIO-RAD公司)。
1.4 方法
1.4.1 脱钙骨基质诱导液的制备脱钙骨基质粉末购买自美国WRIGHT公司，扫描电镜测量其直径并观察其表面特性。低糖DMEM完全培养基浸泡脱钙骨基质，获得50 mg/L脱钙骨基质诱导液。
1.4.2 骨髓间充质干细胞的体外分离培养和传代 10%水合氯醛麻醉SD大鼠，备皮，碘伏消毒3遍，逐层解剖，完整分离取出双侧股骨，低糖DMEM完全培养基冲洗骨髓腔，吹打数分钟后用灭菌滤网过滤杂质，离心管中离心 (1 000 r/min，
5 min)，加入低糖DMEM完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清及1%青链霉素)吹匀后移至培养皿中，置入37 ℃、体积分数为5%CO2恒温培养箱培养，首次半量换液，以后每3 d全量换液1次。细胞培养至融合度90%左右进行细胞传代，PBS清洗，胰蛋白酶消化，加入低糖DMEM完全培养基终止消化，离心(1 000 r/min，5 min)后继续培养。传至第3代，普通光学倒置相差显微镜下观察细胞的生长形态。
1.4.3 骨髓间充质干细胞的鉴定取第3代骨髓间充质干细

胞，加入3 mL胰蛋白酶消化，低糖DMEM完全培养基终止反应，1 000 r/min离心5 min，PBS清洗细胞3次，计数细胞，分别加入PE标记的CD14、CD29、CD44和CD45抗体，常温避光孵育30 min，流式细胞仪检测。

1.4.4 脱钙骨基质对骨髓间充质干细胞生长活性的影响取第3代骨髓间充质干细胞，分别用完全培养基和50 mg/L脱钙骨基质诱导液培养，调整细胞密度为2×105/孔，每组6孔，在37 ℃、体积分数为5%CO2恒温培养箱培养。按照日本同仁CCK-8试剂盒操作说明加入10 μL CCK-8试剂，继续培养1-4 h，酶标仪测定吸光度值(450 nm波长)，连续检测1周，绘制细胞活性曲线。
1.4.5 碱性磷酸酶活力定量检测骨髓间充质干细胞成骨分化情况取第3代骨髓间充质干细胞，调整细胞浓度为1×108 L-1，分别添加完全培养基和50 mg/L脱钙骨基质诱导液，置于37 ℃、体积分数为5%CO2恒温培养箱内孵育，于第7天和第14天收集细胞。按照碱性磷酸酶检测试剂盒说明书操作：加入样品30 μL，空白孔和标准孔分别加入30 μL双蒸水和酚标准应用液，再向每个孔加入缓冲液和基质液，置于37 ℃、体积分数为5%CO2恒温培养箱孵育15 min，加入显色剂，酶标仪测定490 nm处吸光度值。以时间为横轴，碱性磷酸酶活性(吸光度值)为纵轴绘制碱性磷酸酶活性曲线。
1.4.6 茜素红染色矿化观察完全培养基和50 mg/L脱钙骨基质诱导液分别诱导培养第3代骨髓间充质干细胞21 d，吸弃上清液，然后进行PBS清洗、甲醛溶液固定、PBS清洗、茜素红染液染色等步骤，普通光学倒置相差显微镜下观察茜素红染色情况。
1.4.7 qRT-PCR检测成骨诱导分化能力完全培养基和50 mg/L

脱钙骨基质诱导液分别诱导培养第3代骨髓间充质干细胞21 d，Trizol法提取细胞总RNA，首先将RNA反转录为cDNA。引物设计完成后进行成骨相关基因Runt相关转录因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)表达量的测定。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，30个循环。熔解曲线分析和数据收集，采用2-ΔΔCt法进行数据分析。引物设计见表1。

1.4.8 脱钙骨基质表面骨髓间充质干细胞黏附情况取脱钙骨基质支架材料(圆柱型，体积3.0 mm×2.5 mm)共6块，DMEM低糖完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清及1%青链霉素)浸泡，调节其pH值至7.2。取第3代骨髓间充质干细胞，调节细胞浓度为2×108 L-1，接种到脱钙骨基质支架材料中，使脱钙骨基质刚好被骨髓间充质干细胞培养液浸润，每3 d换液1次。培养5 d后，普通光学倒置相差显微镜观察细胞黏附情况。培养7 d后，戊二醛固定、乙醇梯度脱水、60 ℃烘箱干燥、镀金，扫描电镜观察细胞形态和附着情况。
1.5 主要观察指标通过碱性磷酸酶活力检测、茜素红染色和qRT-PCR观察脱钙骨基质诱导液对骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化能力；通过普通光学倒置相差显微镜和扫描电镜观察骨髓间充质干细胞和脱钙骨基质的黏附情况。
1.6 统计学分析运用SPSS Statistics 15.0软件进行统计学分析，组间差异比较采用多样本均数比较的方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞在体外扩增和表达稳定、免疫原性低，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经样细胞和成肌细胞等，目前在组织工程中主要用于抗炎治疗、组织再生和骨缺损修复等方面[9]。第3代骨髓间充质干细胞呈集落样贴壁生长，细胞形态呈长梭形或多边形，均匀分布在整个培养皿，随后即可稳定扩增。骨髓间充质干细胞经脱钙骨基质成骨诱导分化后可见钙结节和钙沉积，碱性磷酸酶活性随着诱导时间延长逐渐升高，说明其向成骨细胞分化能力越强[10]。骨形成主要是由成骨细胞和软骨细胞增殖、分化和分泌外基质共同形成的，还包括骨的矿化以及骨细胞凋亡[11]。成骨细胞增加和破骨细胞减少的动态调节是成骨细胞介导骨形成的主要方式。Runx2在成骨过程中起着重要作用，是间充质干细胞向成骨分化的特异性调节因子和开始成骨的标志物，敲除Runx2因子的骨髓间充质干细胞缺乏成骨分化能力，造成骨不连。研究表明Runx2能促进成骨细胞早期分化和促进成骨细胞数量增加，抑制不成熟骨细胞的增加，在成骨细胞早期分泌增加，在成骨细胞成熟后分泌下降[11-12]。OCN是成骨细胞合成的细胞外基质，能够调节骨质的吸收和矿物沉积，是成骨细胞转换和成骨生成的标志物[13-14]。OPN是成骨细胞分泌的一种非胶原蛋白，其主要参与骨的再生和修复，是成骨表达的一种标志物。自体骨髓间充质干细胞复合支架材料是骨组织工程治疗骨缺损的主要方式，大量动物实验和临床研究已经证实其安全性、可行性和有效性[15-16]。脱钙骨基质是一种高分子聚合物，目前临床上可见各种大小、形状、含钙量不同的脱钙骨基质。复合甘油、透明质酸能够增加脱钙骨基质的成骨诱导性和稳定性，既增加成骨活性又降低免疫排斥反应，更好地运用于骨缺损的修复[17]。双基因转染如骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子联合转染骨髓间充质干细胞，对比单因子转染，不仅增强了成骨分化和血管再生能力，也增强了治疗骨折不愈合的疗效。双基因转染骨髓间充质干细胞再复合脱钙骨基质移植治疗骨缺损，能够提高移植治疗效果。脱钙骨基质的成骨作用机制：脱钙骨基质含有多种生长因子，只有去抗原性后骨形态发生蛋白2等因子才能释放，此时脱钙骨基质具有促成骨作用，目前研究发现脱钙骨基质中除了骨形态发生蛋白2以外，还有其他生长因子如胰岛素样生长因子和转化生长因子β，这些因子通过与骨形态发生蛋白2的相互协调作用影响脱钙骨基质的成骨诱导特性[18-19]。
脱钙骨基质作为常用的组织工程骨，其具有天然孔隙结构和黏附性，有利于种子细胞黏附和生长分化以及新生毛细血管长入，接着在骨缺损部位沉积成骨，产生了骨传导和骨诱导性的作用。脱钙骨基质诱导骨髓间充质干细胞向成骨分化，其成骨的方式主要是软骨内成骨，其次是膜内成骨[7]。
此外，脱钙骨基质具有良好的组织相容性和降解特性，脱钙骨基质复合骨髓间充质干细胞治疗关节软骨缺损时，关节软骨修复良好，未发生免疫排斥，在缺损处未见明显的脱钙骨基质残留和大量炎症细胞聚集[20]。脱钙骨基质的可塑性和机械强度受脱钙程度影响，不同的组织类型和脱钙强度，使其具有不同程度的机械性硬度，可以很好适应不同部位的生物力[21]。复合支架已经得到广泛研究，目前很多学者倾向脱钙骨基质复合细胞外基质的研究，如层粘连蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原等，其优点主要是增强脱钙骨基质支架的张力，提高脱钙骨基质支架的黏附性，除此之外还具有分泌神经营养因子和调节细胞分泌、代谢的作用，具有广泛研究价值。脱钙骨基质的脱钙程度越高，其生物力就越低，此时脱钙骨基质不适合运用于四肢等承受重力部位，脱钙骨基质与其他生物材料组成复合物既发挥骨诱导、骨传导及成骨作用，又增加坚固性和可塑性，解决了此难题[22-23]。复合种子细胞以及分泌一定的生物因子能够增强脱钙骨基质的诱导性，又保持其稳定的免疫抗原性，是目前骨组织工程研究的热点。大量动物研究提供了使用骨髓间充质干细胞复合支架材料治疗骨缺损这一概念的证据，为了更好地运用临床，系统地重复实验是必要的，并且采用更多的评定标准和临床试验来评估这种方法的安全性和有效性。早期预实验浓度设计实验表明，不同浓度梯度的脱钙骨基质对骨髓间充质干细胞的生长具有双向作用，高浓度脱钙骨基质可抑制细胞的增殖，在脱钙骨基质诱导液质量浓度为50 mg/L时，脱钙骨基质对骨髓间充质干细胞的增殖影响小，促分化效果佳。实验结果显示脱钙骨基质诱导液组的碱性磷酸酶活性增高，与完全培养基组差异有显著性意义；茜素红染色观察骨髓间充质干细胞发生聚集生长，并形成暗色矿化结节，这两种方法说明了脱钙骨基质具有诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的作用。为了进一步验证脱钙骨基质诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的能力，使用qRT-PCR检测Runx2、ALP、OCN和OPN成骨相关基因的表达升高，从量化水平说明脱钙骨基质具有良好的成骨诱导性；最后通过骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质复合培养，发现两者之间黏附良好，证明脱钙骨基质具有良好的黏附性，适合种子细胞的黏附和爬行。
综上所述，脱钙骨基质可正向诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，两者之间可形成良好的黏附，两者复合培养可制作成良好的骨支架修复材料，为骨组织工程研究提供理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脱钙骨基质体外诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化

Osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by demineralized bone matrix in vitro

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张超, 吕欣. 髋臼骨折固定后的异位骨化：危险因素、预防及其治疗进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1434-1439.
[4]	蒋红英, 朱亮, 余曦, 黄靖, 向小娜, 兰正燕, 何红晨. 富血小板血浆干预脊髓损伤患者压力性损伤的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1149-1153.
[5]	吴训, 孟娟红, 张建运, 王亮. 浓缩生长因子修复兔髁突全层软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1166-1171.
[6]	申晋波, 张林. 急性力竭运动导致大鼠跟腱微损伤的超微结构变化及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1190-1195.
[7]	李静, 谢建山, 崔慧林, 曹锡梅, 杨艳萍, 李海荣. 不同毛色小鼠背部皮肤中甘油二酯激酶ζ和蛋白激酶CβⅡ的表达和定位[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1196-1200.
[8]	曾祯, 胡经纬, 李璇, 唐琳梅, 黄志强, 李明星. 超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1201-1206.
[9]	唐辉, 姚志浩, 罗道文, 彭双麟, 杨双林, 王浪, 肖金刚. 高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病性骨质疏松症大鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1207-1211.
[10]	柴乐, 吕建兰, 胡劲涛, 胡华辉, 许庆军, 余进伟, 全仁夫. 诱导急性脊髓损伤模型大鼠炎症反应信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1218-1223.
[11]	陈继铭, 吴晓静, 刘田丰, 陈海聪, 黄成硕. 水飞蓟素对四氯化碳致小鼠肝损伤和骨代谢的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1224-1228.
[12]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[13]	谭婧玉, 刘海文. 成骨细胞特异因子2基因家族的全基因组鉴定、分类及进化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1243-1248.
[14]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[15]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.