椎动脉型颈椎病动物造模的技术方法与结果评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1172

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (15): 2427-2435.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1172

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椎动脉型颈椎病动物造模的技术方法与结果评价

张翔1，钱宇章1，谢林2，3，康然2，3

(1南京中医药大学，江苏省南京市 210046；2南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏省南京市 210028；3江苏省中医药研究院，江苏省南京市 210028)

收稿日期:2018-12-27 出版日期:2019-05-28 发布日期:2019-05-28
通讯作者: 谢林，主任医师，博士生导师，南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏省南京市 210028；江苏省中医药研究院，江苏省南京市 210028。
作者简介:张翔，男，1992年生，江苏省阜宁县人，汉族，南京中医药大学在读硕士，主要从事脊柱病临床研究。并列第一作者：钱宇章，男，1994年生，江苏省张家港市人，汉族，南京中医药大学在读硕士，主要从事脊柱病临床研究。
基金资助:
江苏省卫生计生委科研课题(BJ16026)，项目负责人：谢林；江苏省中医药领军人才培养(SLJ0210)，项目负责人：谢林

Technological methods and result evaluation of establishing the animal models of vertebral artery type of cervical spondylosis

Zhang Xiang1,Qian Yuzhang1,Xie Lin2,3,Kang Ran2,3

(1Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, Jiangsu Province, China; 2Nanjing Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210028, Jiangsu Province, China; 3Jiangsu Province Academy of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210028, Jiangsu Province, China)

Received:2018-12-27 Online:2019-05-28 Published:2019-05-28
Contact: Xie Lin, Chief physician, Doctoral supervisor, Nanjing Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210028, Jiangsu Province, China; Jiangsu Province Academy of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210028, Jiangsu Province, China
About author:Zhang Xiang, Master candidate, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, Jiangsu Province, China Qian Yuzhang, Master candidate, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, Jiangsu Province, China Zhang Xiang and Qian Yuzhang contributed equally to this work.
Supported by:
the Science and Technology Project of Jiangsu Commission of Health, No. BJ16026 (to XL); the Leading Talent Training of Chinese Medicine of Jiangsu Province, No. SLJ0210 (to XL)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
颈椎病动物模型注射硬化剂模型法：是指将硬化剂注射于动物C3-5左侧横突间及周围组织注射，从而造成椎动脉狭窄的造模方法。
颈椎病动物模型力学失衡模型法：是指通过一系列操作，使得颈部两侧的肌肉平稳失调，造成颈部一侧偏斜，进而使椎动脉受压的造模方法。

摘要
背景：椎动脉型颈椎病动物模型的构建及其评价方法逐渐成为新的研究热点。
目的：阐述椎动脉型颈椎病动物模型的国内、外研究进展，并评价各自造模方法的优、缺点。
方法：通过下列检索关键词：椎动脉型颈椎病、颈性眩晕、颈源性眩晕、动物、造模、模型，cervical vertigo，basal-vertebral ischemia，cervical spondylosis of vertebral artery type，animal，model，检索1998至2018年中国知网、万方中文数据库、维普中文科技期刊数据库和PubMed数据库、Cochrane图书馆和Embase数据库，依据椎动脉型颈椎病的纳入、排除诊断标准，筛选出椎动脉型颈椎病动物造模的中、英文文献。
结果与结论：通过归纳分析得出，造模方式涵盖注射硬化剂法、植骨压迫法、动力失衡法、瘀血阻络法、椎动脉结扎法及混合造模法。其中以注射硬化剂法最为常见；植骨压迫法其与人体的发病机制最为相仿，但缺点在于造模难度大，骨块大小不一，且骨块无法完全固定在相应位置上；力学失衡法通过切除单侧的肌肉、骨质，造成颈椎失衡，其可操作性相对较高，但其造模周期较长；结扎或夹闭单侧椎动脉法虽相对简单、易行，但是椎动脉型颈椎病的发病机制并非简单的椎动脉狭窄，其忽略了体液因子、交感神经及椎神经等对于椎动脉血流速度、管腔大小的影响。各种造模方法皆有利弊，且造模的评判标准、造模时间及造模成功率结果不一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-4741-4078(张翔)，0000-0003-4674-5748(钱宇章)

关键词: 椎动脉型颈椎病, 颈源性眩晕, 动物模型, 造模, 研究进展, 注射硬化剂, 植骨压迫, 动力失衡法, 椎动脉结扎法

Abstract:

BACKGROUND: Construction of animal models of vertebral artery type of cervical spondylosis and evaluation have become a new issue of concern.
OBJECTIVE: To describe the research progress of animal models of vertebral artery type of cervical spondylosis at home and abroad, and to evaluate the advantages and disadvantages of each method.
METHODS: The keywords were “cervical vertigo, basal-vertebral ischemia, cervical spondylosis of vertebral artery type, animal, model” in Chinese and English, respectively. CNKI, WanFang, VIP, PubMed, Cochrane Library, and Embase databases were retrieved for the articles published from 1998 to 2018. Chinese and English articles on animal modeling of vertebral artery type of cervical spondylosis were selected according to the inclusion and exclusion diagnosis criteria of vertebral artery type of cervical spondylosis.
RESULTS AND CONCLUSION: Through induction and analysis, modeling methods include hardener injection, bone graft compression, dynamic imbalance, blood stasis blocking collaturation, vertebral artery ligation and mixed modeling method. Of them, hardener injection method is most commonly used. Bone graft compression method is the most similar pathogenesis to the human body. However, the disadvantage is that the modeling is difficult and the size of the bone block is various. So the bone is not in the right position. Dynamic imbalance method can cause cervical spine imbalanced by resecting the unilateral muscle and bone. This method has high operability, but has long modeling period. Although ligating or clipping the unilateral vertebral artery is easy to operate, the pathogenesis of vertebral artery type of cervical spondylosis is not just vertebral artery stenosis, which ignores the influence of humoral factors, sympathetic nerves and vertebral nerves on the blood flow velocity and lumen size of vertebral artery. Each method has advantages and disadvantages. The evaluation criteria, time and success rate are different.

Key words: Cervical Vertebrae, Vertigo, Models, Animal

中图分类号:

R446
R318

张翔, 钱宇章, 谢林, 康然. 椎动脉型颈椎病动物造模的技术方法与结果评价[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(15): 2427-2435.

Zhang Xiang, Qian Yuzhang, Xie Lin, Kang Ran, . Technological methods and result evaluation of establishing the animal models of vertebral artery type of cervical spondylosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(15): 2427-2435.

图/表（结果） 4

2.1 造模动物目前椎动脉型颈椎病造模的动物有兔、鼠、犬及猴。

兔是目前椎动脉型造模最常用的动物。其优点在于易饲养，繁殖能力强，耳缘静脉抽血方便，便于长期的动态观察。且解剖家兔颈椎及颅内血管发现家兔颅底血管与人类大体相同，具有完整的大脑动脉环^[4]。因此，兔子的动物造模更有利于将实验结果推及到人体，且在使用植骨压迫法、椎动脉结扎法及其相应的混合造模方

法时，由于大鼠体表面积较小，解剖难度大，而灵长类动物的价格又非常昂贵等限制，更加提高了兔的使用率，但兔虽然有利于动物造模，但是其缺点是灌药困难、饲养容易死亡等诸多弊端。

鼠也是椎动脉型颈椎病相对常用的动物。其优点在于鼠的价格低廉、数量较多、易于获取，且老鼠饲养、灌药方便等。由于对于大鼠的椎动脉型颈椎病的造模观测指标较多，故也有很多研究者将鼠作为椎动脉型颈椎病造模动物的首选。尤其在硬化剂注射法中，对于大鼠的解剖要求相对偏低，故在该法中，使用鼠作为造模动物更加简单、易行。但是，由于自朱明双等^[11]以兔作为造模动物后，诸多研究者多以兔作为研究对象，并使用不同的硬化剂剂量对其进行动物造模，在造模剂量、造模周期上有了一个相对成熟的造模方法。但对于鼠的造模剂量方面，仍有一定内容需要去探索。因此，如果能探索出大鼠的椎动脉型颈椎病硬化剂造模剂量与造模周期的话，将明显扩大大鼠作为造模动物的使用率。

犬及猴类动物较少被选作椎动脉型颈椎病的造模动物，尽管其存在组织器官同人类生理结构更加相似、表面体积较大便于操作等优点，但是碍于费用昂贵、难于驯养等弊端，故难以实施。

2.2 造模方法

2.2.1 注射硬化剂法注射硬化剂法是指将硬化剂注射于动物C₃_-5左侧横突间及周围组织注射，从而造成椎动脉狭窄的造模方法。一方面，硬化剂注射液可刺激椎动脉组织，使得椎动脉管腔收缩、狭窄；其也可刺激周围颈部软组织，使患侧肌肉挛缩，进而颈部力学失衡，出现颈椎偏斜，患侧椎动脉受压，进一步加重椎动脉管腔的狭窄情况。另一方面，C₃_-5椎动脉受椎神经与交感神经双源支配，故于C₃_-5左侧注射硬化剂可刺激椎动脉，使交感神经及椎神经刺激而发生血管收缩^[4]。故该法自2000年被首次报道后，因其造模成功率高、造模操作容易等优点，故被学者多加推崇，并沿用至今，成为目前制作椎动脉型颈椎病动物造模最常使用的方法。

在动物选择方面，朱明双等^[10]通过对于家兔的局部解剖发现，家兔颅底血管拥有与人类大体相似的大脑动脉环及横突切迹后，故该病的实验动物多以兔为主。而大鼠在解剖学上存在着与人类更加相似的横突孔，并且存在价格低廉、生命力顽强、灌药方便等诸多优点，陆永雷等^[22]于2016年首次使用大鼠作为椎动脉型颈椎病模型动物，并且造模成功率较高。因此如果能以大鼠作为新的椎动脉型颈椎病模型动物，将扩大椎动脉型动物模型的研究范围及研究方法。

在硬化剂选择方面，目前大多数研究者选用消痔灵注射液，但是由于目前消痔灵注射液药物制作厂商原因，目前市场上该药的价格过高，故也在一定程度上限制了消痔灵注射液的广泛使用。而罗仁浩等^[17]于2012年则选择5%油酸氨基乙酸，以同等方法进行颈部注射，亦取得了相同的造模效果。因此，消痔灵注射液相比于其他的药物而言，其优势何在，值得思考。

在造模方法方面，亦存在着诸多问题。在剂量选择上，学者对于兔子椎动脉型颈椎病造模的起始硬化剂剂量均为10 mL，大鼠的起始硬化剂剂量为2 mL，但为何使用上述剂量数值进行造模，目前尚不明确；并且同种动物的硬化剂注射频次及造模周期不一，大多数学者沿用朱明双的造模方法，于造模当天及造模后第2周颈部注射硬化剂 10 mL，一般4周即可造模成功。但张昭等^[14-16]于造模当天及造模后2，4，6，8，10周均予以追加颈部硬化剂，造模硬化剂的总剂量及注射频次明显增加，但是造模周期却从之前的4周变长为10周；并且亦有学者纠结于硬化剂剂量是否会造成椎动脉不可逆的损伤，反而不利于对于该病药物治疗的研究。故如何进一步明确硬化剂造模剂量与药物逆转椎动脉退变的剂量之间的区间数值，以及造模的实际周期，值得进一步研究与商榷。

2.2.2 植骨压迫法植骨压迫法是指通过将异体骨植入动物模型的颈部，使一侧椎动脉受压、狭窄的造模方法。该法自1994年首次报道，起始是于C₅-C₆椎体单侧横突内侧面，将一枚骨块植入骨膜下间隙，并逐层缝合。该方法目前相对常见，并且符合人体颈椎退变的过程，但是该方法亦存在诸多争议。

首先，对于植骨骨块大小而言，缺乏有效的科学依据。潘子毅、李俊华等^[24-25]在以兔为造模动物时，选用长8 mm，截面3 mm×3 mm×3 mm的骨块；皮全民等^[26]在以兔为造模动物时则改选用长6 mm，截面2 mm× 3 mm×2 mm的骨块；孙定平等^[27]、李清林^[28]在以大鼠为造模动物时，又选用长3 mm，截面2 mm×2 mm× 2 mm的骨水泥块。然而不同大小的骨块与对椎动脉的机械压迫又存在着正相关的关系，故骨块的大小直接影响了造模的成功率及造模成功后药物治疗的有效率。

其次，对于骨块植入稳定性而言。尽管研究者们将骨块植入骨膜下，逐层缝合，但其无法保证骨块不出现移位。故是否需要坚强的内固定以保证骨块植入的位置，仍有待探索。另外，在植骨的部位上，大多数研究者将骨块植入于C₅-C₆椎体单侧横突内侧面，但是植入颈椎该节段位置的具体原因，文中并未提及。

最后，由于该造模因操作难度大、解剖要求高等原因限制了其进一步推广。故2016年凌泽莎等^[29]对于该造模方法进行了创新，将植骨所需的同种异体骨改为磷酸钙骨水泥(注射复合重组人骨形态发生蛋白2)，并对实验动物猕猴颈部进行注射，显著降低了对于该造模方法对于解剖操作的要求，造模成功率大幅度提高。但是该方法的实验成本较高，且骨水泥的毒性是否会对实验动物造成不良反应，尚未可知。

2.2.3 力学失衡法力学失衡法是指通过一系列操作，使得颈部两侧的肌肉平稳失调，造成颈部一侧偏斜，进而使椎动脉受压的造模方法。该方法最早2002年被提出，起始是将在家兔颈椎向左侧旋转，用7号线将下颌骨与肩胛部缝合在一起，造成力学失衡模型，造模成功率高^[30]。

后于2004年由宋沛松等^[31]加以改进，通过切断一侧颈阔肌、头颈寰最长肌、颈髂肋肌和头半棘肌及部分骨质，造成颈部力学失衡，在造模中亦取得了良好的效果。郭建阔等^[32]在宋沛松的造模基础上，加行颈前路手术损伤C₄_-₅前纵韧带和椎间盘结构，从而加重了力学失衡的状态，使得造模的效果更佳明显。

该造模方法，操作相对简单、易行，且其造模的机制与临床椎动脉型颈椎病患者的发病机制相仿。该方法适用的造模动物范围广，兔、鼠等皆可使用该法进行造模。但是现有的文献报道，该造模方法的时间为4周至4月不等，其造模平均周期较其他的造模方法时间较长，故如何进一步缩短造模周期有待思考。

2.2.4 椎动脉结扎法椎动脉结扎法是指通过切断、夹闭或结扎一侧椎动脉的方式，致使单侧椎动脉供血不足的造模方法。2004年孙永明等^[35]由椎动脉起始段向远端游离，近端结扎切断，远端移向前内侧靠近同侧颈总动脉，行端侧吻合术，颈总动脉在吻合口的远端结扎的方法，在以犬为动物模型时，取得了较好的效果，造模成功率为86.90%。

张清等^[36]、高根德等^[37]对此技术进行改进，分别通过夹闭、结扎单侧椎动脉的方法，通过运用苏木精-伊红染色进行脑组织形态学观察法、海马区域细胞凋亡百分率等指标，验证椎动脉型颈椎病动物模型的成功与否。该方法显著降低了造模的难度，更有利于该造模方式的推广。但该方法据文献报道来看，其造模周期跨度很大，由造模当天至造模后3个月的差距，其中造成如此大差距的原因目前尚不明确。

2.2.5 瘀血阻络法瘀血阻络法是指将动物的同种异体血液制为瘀血，注入模型动物的左侧颈夹肌及头夹肌内，造成瘀滞脉络的造模方法。在中国传统医学方面，明代中期著名医学家虞抟即在《医学正传》中提出“血瘀致眩”学说，以活血化瘀作为该病的治疗方法，并被当代中医学者广泛使用，临床上取得了良好的效果，因此瘀血阻络造模法是一种在中医基础理论指导下的造模方法。温国伟等^[39]于2005年，通过将家兔异体血液(含引物1 mL)9 mL制为瘀血，注入家兔左侧颈夹肌及头夹肌内。张永臣等^[43]将调整注射瘀血的频次，将家兔异体血液(含引物1 mL)10 mL制为瘀血，注入家兔左侧颈夹肌及头夹肌内，并每周注射1次，连续4周。

该造模方法，操作简单，瘀血制备便捷，造模周期较短。但该造模方法是在中医基础理论的指导之下的瘀血阻络证的椎动脉型颈椎病动物模型。而有一些中医学者认为椎动脉型颈椎病当从痰湿论治，故治疗上应化痰祛湿为主，故该造模方法的中医证型限制了它的进一步发展。

2.2.6 混合造模法混合造模法是指由注射硬化剂法、植骨压迫法、力学失衡法、椎动脉结扎法、瘀血阻络法中选取2种及2种以上进行椎动脉型颈椎病动物造模的方法。该法由贾力莉等^[44]率先使用，将力学失衡法与注射硬化剂法相结合，并通过斜板运动功能、影像学评分及经颅多普勒(TCD)明确造模的成功与否，方法简单，操作容易。宋敏等^[22^，^45-46]通过力学失衡法及植骨压迫法相结合，2-4周即可造模成功，但该操作难度大，对操作者的解剖水平要求高。陆永雷^[47]、马江涛^[49]则采用力学失衡法与注射硬化剂法相结合，造模成功率在95%以上。该造模方法既有上述各种方法单个的优点，也有单个方法的缺点，造模难度更大。

2.3 造模评判方法目前对于椎动脉型颈椎病的动物造模中，其评判指标相对较多。且由于现代医学的发展，大多数学者从单纯的通过一般形态学的基础上，联合运用超声多普勒、病理组织形态学、血液流变学等检测加以明确。其评判指标大致可以分为如下5点：①对实验动物的毛色、饮食及饮水量、行为及体质量进行观察、对比，大多数的动物在造模后会出现发量稀疏，饮食、饮水量较少，活动减少，体质量降低等情况；②通过超声多普勒对模型动物进行经颅多普勒(TCD)或者椎动脉彩超等，通过检测血流速度、血流量、血管管腔内径的改变，进行对比。通过与造模前后的自身对照及组间对照，通过比较单位时间内血流量的差异，明确造模的成功与否；③通过实验动物颈部影像学检查，并制定相应的颈椎影像学退变评分标准，描述颈椎的退变情况，进而对比研究；④通过组织形态学，运用苏木精-伊红染色法、免疫荧光染色等方法，对脑组织、椎动脉组织、颈部肌肉组织等进行观察，查看上述组织是否存在变性、萎缩、死亡的情况，从而进行对比；⑤对造模动物血液的血清、血浆学进行检测，通过ELISA检测，计算血液中血清一氧化氮、血浆内皮素、血浆神经肽Y、血浆降钙素相关基因肽、血浆血栓烷B2等数值，进行前后对照。目前对于椎动脉型颈椎病动物模型的评判标准相对较多，在一定程度上，能够对动物造模、以及造模后药物疗效做出一定的评价，但是仍然缺乏针对于椎动脉型颈椎病的特异性的指标。

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引言

材料方法

讨论

目前椎动脉型颈椎病的诊断主要参照1994年国家中医药管理局颁布的中华人民共和国中医药行业标准《中医病证诊断疗效标准》的椎动脉型颈椎病诊断标准、《2008年第三届全国颈椎病专题座谈会纪要》以及《颈椎病的分型、诊断及非手术治疗专家共识(2018年版)》制定的关于椎动脉型颈椎病的诊断标准。由于该病的诊断尚未明确，而Cloud等^[50]又在研究中发现正常人中双侧椎动脉发育不对称，一侧椎动脉管径较细者占 75%以上，却极少出现临床缺血症状，因此对于椎动脉型颈椎病的诊断也一直饱受质疑。对于椎动脉型颈椎病的机制，大多数人认为与椎动脉受压有关，最终出现以眩晕、恶心呕吐及耳鸣等为主的综合征。但近年来，亦有研究表明，颈性眩晕与椎间盘异常感受器长入有关^[51-52]。故面对如此多的争议，如何进一步明确椎动脉型颈椎病的发病机制，进而指导临床治疗迫在眉睫。

作者将20年来的关于椎动脉型颈椎病动物造模的文献进行查阅、对比。在造模方法的选择上，注射硬化剂造模法被使用的最多，该方法又以兔子颈部注射消痔灵法最为突出。但是在造模动物的选择、注射硬化剂品种、硬化剂剂量、造模周期的选择上，缺乏科学依据支撑，其明显限制了该造模方法的进一步发展。植骨压迫法则是仿照机体骨赘形成，压迫椎动脉，从而导致相应症状。其与人体的发病机制最为相仿，但缺点在于造模难度大，骨块大小不一，且骨块无法完全固定在相应位置上。力学失衡法通过切除单侧的肌肉、骨质，造成颈椎失衡，其可操作性相对较高，但其造模周期较长。鉴于椎动脉型颈椎病均有椎动脉的受压，故椎动脉结扎法应运而生，通过解剖进而结扎或夹闭单侧椎动脉。此法虽相对简单、易行，但是椎动脉型颈椎病的发病机制并非简单的椎动脉狭窄，其忽略了体液因子、交感神经及椎神经等对于椎动脉血流速度、管腔大小的影响。瘀血阻络法是在中医辨证论治的基础之上，结合椎动脉型颈椎病的特点而创立的，其虽简单、易行，但是其瘀血阻络证型也限制了中医药从不同证型对于该病的研究。并且瘀血的植入，是否会诱发机体的免疫排异反应不得而知。混合造模法，虽然在一定程度上可以缩短造模的周期，但是它也包含了各个单一造模方法的弊端。

在衡量造模成功与否的指标上，其检测方法众多，包括了血流动力学检测、血清学检测等。随着科学技术进一步的提高，其系统评判椎动脉型颈椎病动物造模的指标也应当更加全面、客观，其需要综合形态学、分子生物学、影像学、病理生理学等多方面加以评判。

随着椎动脉型颈椎病模型动物范围的扩大，椎动脉型颈椎病动物造模的不断完善及疾病机制研究不断深入，椎动脉型颈椎病的治疗也一定会有一个质的飞跃。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

椎动脉型颈椎病动物造模的技术方法与结果评价

Technological methods and result evaluation of establishing the animal models of vertebral artery type of cervical spondylosis

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