慢病毒介导PTEN-Long过表达抑制人脑胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤的生长

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1140

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (11): 1743-1748.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1140

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慢病毒介导PTEN-Long过表达抑制人脑胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤的生长

耿连婷1，李春晖2，单小松2，郑亚北1，曾昭穆1，郑克彬2

(1河北大学，河北省保定市 071000；2河北大学附属医院神经外科，河北省保定市 071000)

收稿日期:2018-12-17 出版日期:2019-04-18 发布日期:2019-04-18
通讯作者: 郑克彬，博士，副教授，河北大学附属医院神经外科，河北省保定市，071000
作者简介:耿连婷，女，1993年生，河北省衡水市人，汉族，河北大学在读硕士。
基金资助:
河北省自然科学基金资助项目(H2016201238)，项目负责人：郑克彬

Lentivirus-mediated overexpression of PTEN-Long inhibits the growth of human glioma U251 cell in nude mice xenografts

Geng Lianting¹, Li Chunhui², Shan Xiaosong², Zheng Yabei¹, Zeng Zhaomu¹, Zheng Kebin²

(1Hebei University, Baoding 071000, Hebei Province, China; 2Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, Hebei Province, China)

Received:2018-12-17 Online:2019-04-18 Published:2019-04-18
Contact: Zheng Kebin, MD, Associate professor, Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, Hebei Province, China
About author:Geng Lianting, Master candidate, Master candidate, Hebei University, Baoding 071000, Hebei Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Hebei Province, No. H2016201238 (to ZKB)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
PTEN-Long：是第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosohatase and tensin homolgue deleted on chromosome 10，PTEN)的翻译变体，是一种新发现的肿瘤抑制基因，在多种肿瘤中存在突变与缺失，与肿瘤的发生与发展有密切关系。
慢病毒属：是反转录病毒科下的一个病毒属，包括8种能够感染人和脊椎动物的病毒，原发感染的细胞以淋巴细胞和巨噬细胞为主，感染个体最终发病。慢病毒感染的显著特点是感染个体在出现典型的临床症状之前，大多经历长达数年的潜伏期，随后缓慢发病，因此这些病原体被称为慢病毒。

摘要
背景：第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosohatase and tensin homolgue deleted on chromosome 10，PTEN)的翻译变体(PTEN-Long)是新发现的一种肿瘤抑制基因，与多种肿瘤的发展密切相关。
目的：探讨PTEN-Long对人脑胶质瘤U251细胞裸鼠异体移植瘤生长的抑制作用及相关分子机制。
方法：①人脑胶质瘤细胞U251购自国家实验细胞资源共享服务平台北京总部，实验将未感染慢病毒的U251为对照组，感染LV-EGFP的U251为空载组，感染LV-PTEN-Long-EGFP的U251为过表达组，用荧光显微镜、Western blot检测转染效率；②实验将购自北京华阜康生物科技股份有限公司的BALB/c-nu雄性裸鼠随机分为3组，将3组细胞分别接种于裸鼠背部皮下，观察裸鼠一般状况及肿瘤生长趋势，分析各组裸鼠皮下肿瘤的体积及质量变化，免疫组织化学染色法检测肿瘤中PTEN-Long，p-Akt及NF-κB p65蛋白表达变化情况。
结果与结论：①一般状况：PTEN-Long过表达后可抑制裸鼠皮下胶质瘤细胞的增殖，与对照组及空载组相比，过表达组裸鼠肿瘤体积及质量减少(P < 0.01)；②免疫组织化学染色显示：与对照组及空载组相比，过表达组PTEN-Long表达量增加(P < 0.05)，p-Akt及NF-κB p65表达量降低(P < 0.05)；③结果显示：PTEN-Long可抑制人脑胶质瘤U251细胞裸鼠异体移植瘤的生长，机制可能与下调PI3K-AKT-NF-κB信号通路有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-4851-5110(郑克彬)

关键词: 胶质瘤, U251细胞, 慢病毒, PTEN-Long, p-Akt, NF-κB p65, 裸鼠, 动物模型, 皮下接种

Abstract:

BACKGROUND: PTEN-Long is a translational variant of phosohatase and tensin homolgue deleted on chromosome 10 (PTEN), which is a newly discovered tumor suppressor gene and is closely related to the development of various tumors.
OBJECTIVE: To investigate the inhibition effect of PTEN-Long on the growth of U251 cells (human glioma cells) in nude mice xenografts and related molecular mechanisms.
METHODS: Human glioma cell U251 was purchased from the National Infrastructure of Cell Line Resource in Beijing. U251 not infected with lentivirus was used as control group. U251 infected with LV-EGFP was empty group. U251 infected with LV-PTEN-Long-EGFP was overexpressed group. Transfection efficiency was measured by fluorescence microscopy and western blot assay. BALB/c-nu male nude mice purchased from Beijing Huakang Biotechnology Co., Ltd. were randomly divided into three groups, and the three groups of cells were inoculated subcutaneously into the back of nude mice. The general condition and tumor growth trend were observed. The volume and weight of subcutaneous tumors in nude mice were analyzed. The expression levels of PTEN-Long, p-Akt and NF-κB p65 protein in tumors were detected by immunohistochemical staining.
RESULTS AND COUNCLUSION: Overexpression of PTEN-Long inhibited the proliferation of subcutaneous glioma cells in nude mice. Compared with the control group and the empty group, the overexpressed group was in poor condition, tumor volume and weight were decreased (P < 0.01). Immunohistochemical staining showed that the expression of PTEN-Long (P < 0.05) was increased, and the expression levels of p-Akt and NF-κB p65 were decreased (P < 0.05). In summary, overexpression of PTEN-Long inhibits the growth of U251 cells in nude mice, and the mechanism may be related to down-regulation of PI3K-AKT-NF-κB signaling pathway.

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Key words: Glioma, Models, Animal, Lentivirus Infections, Tissue Engineering

中图分类号:

耿连婷，李春晖，单小松，郑亚北，曾昭穆，郑克彬. 慢病毒介导PTEN-Long过表达抑制人脑胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤的生长[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(11): 1743-1748.

Geng Lianting¹, Li Chunhui², Shan Xiaosong², Zheng Yabei¹, Zeng Zhaomu¹, Zheng Kebin² . Lentivirus-mediated overexpression of PTEN-Long inhibits the growth of human glioma U251 cell in nude mice xenografts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(11): 1743-1748.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析纳入裸鼠12只，均进入结果分析，无脱失值。

2.2 携带PTEN-Long慢病毒转染的检测结果当感染复数为50时，荧光显微镜下显示细胞的荧光表达率均为80%以上，见图1。相同条件下进行实验重复3次，取所得3组数据进行统计分析。

Western blot分析显示3组PTEN-Long蛋白表达量(吸光度值)差异有显著性意义(P < 0.01)，过表达组(0.59±0.55)表达量高于对照组(0.28±0.04)与空载组(0.23±0.03)；P < 0.01)。对照组与空载组差异无显著性意义(P=0.19)。各组p-Akt表达量差异有显著性意义(P < 0.01)，与对照组(0.46±0.53)、空载组(0.44±0.04)相比，过表达组p-Akt(0.09±0.05)表达量降低(P < 0.01)。各组Akt及PTEN蛋白表达量差异无显著性意义，见图2。

2.3 PTEN-Long抑制裸鼠皮下移植瘤的生长接种肿瘤细胞约1周后可见开始形成肿瘤组织，肿瘤体积逐渐增加。裸鼠一般状态逐渐变差，过表达组与对照组、空载组相比较明显。接种约第4周时，对照组有出现肿瘤坏死的表现，可能主要因为肿瘤生长速度过快造成。研究发现，随着时间的进展，过表达组肿瘤体积增长速度缓于对照组与空载组，肿瘤体积生长变化曲线记录的是各组在不同时间的肿瘤体积的平均值。接种第28天取瘤后测量体积，各组肿瘤体积差异有显著性意义(P < 0.01)，过表达组肿瘤体积明显小于对照组与空载组 (P < 0.01)。各组肿瘤质量差异有显著性意义(P < 0.01)，过表达组肿瘤质量明显小于对照组与空载组(P < 0.01)。结果说明，PTEN-Long可抑制胶质瘤U251细胞体内增殖，见图3。

2.4 PTEN-Long抑制肿瘤组织中p-Akt及NF-κB p65蛋白表达免疫组织化学染色显示，PTEN-Long、p-Akt主要表达于细胞质，偶有表达于细胞核，NF-κB p65主要表达于细胞核，偶有细胞质内表达，染色后阳性结果显示为中度染色或强染色，见图4。与对照组及空载组相比，过表达组PTEN-Long表达水平明显增加(P < 0.01)，p-Akt和p65表达水平明显降低明显降低(P < 0.05，P < 0.01)，见表1。结果说明，PTEN-Long可能通过抑制PI3K-Akt-NF-κB信号通路抑制胶质瘤细胞增殖。

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引言

胶质瘤亦称神经胶质细胞瘤，包括多种发生于神经外胚层细胞的肿瘤，是原发性神经肿瘤中最常见和最具浸润性的一种，极易复发而且预后较差^[1-3]，基因治疗成为目前研究的重点。PTEN-Long是第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosohatase and tensin homolgue deleted on chromosome 10，PTEN)的翻译变体^[4-5]，是一种新发现的肿瘤抑制基因。PTEN在多种肿瘤中存在突变与缺失^[6-7]，与肿瘤的发生与发展有密切关系^[8]，PTEN-Long在多种肿瘤中表达量与正常细胞相比也明显减少^[4]。

PTEN-Long在多种肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，PTEN-Long过表达的培养基可以降低蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，Akt)磷酸化水平并抑制U87细胞增殖^[9]，PTEN-Long胞内过表达及胞外蛋白质都可以抑制丙型肝炎病毒复制^[10]。在裸鼠异体移植瘤的研究中发现PTEN-Long可抑制U87细胞增殖，抑制肾透明细胞癌生长^[11]，抑制人乳腺癌细胞HCC70，MDA-MB-468和SUM149增殖，但在人结肠癌肿瘤细胞系HCT116中未见明显抑制作用^[4]。核转录因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)与细胞存活及凋亡密切相关^[12-13]，在体外研究中发现PTEN-Long可通过抑制PI3K-AKT信号通路，抑制U251及A172细胞增殖、迁移、侵袭并促进凋亡。

实验将进一步探索PTEN-Long在体内的表达水平对U251细胞的影响及与PI3K-AKT-NF-B信号通路的关系。实验还通过构建裸鼠皮下异体移植瘤模型，观察PTEN-Long对U251细胞皮下移植瘤生长的影响，并通过检测组织中相关蛋白的表达情况分析与PI3K-AKT-NF-B信号通路的联系，为神经胶质细胞瘤的基因治疗提供更充足的依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2018年3月至7月在河北大学附属医院中心实验室及河北大学医学综合实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 动物 BALB/c-nu雄性三四周龄裸鼠12只，体质量(12±2) g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。北京市实验动物质量合格证号为11401300078106，许可证号为SCXK(京)2014-0004，饲养于无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级环境。实验经河北大学医学综合实验中心动物伦理委员批准(伦理批准号：2018015)。

1.3.2 细胞及载体人胶质瘤细胞U251购自国家实验细胞资源共享服务平台北京总部，PTEN-Long过表达载体质粒和空载体质粒构建和慢病毒包装由赛业公司完成。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养、转染及鉴定人脑胶质瘤U251细胞在体积分数10%胎牛血清(Gibco公司)、1%青霉素和链霉素的DMEM高糖培养基(Gibco公司)，37 ℃，体积分数5%CO₂、饱和湿度环境的条件下进行连续培养。取对数期细胞接种至12孔板(细胞浓度1×10⁵个/孔)，培养24 h后观察细胞浓度，使细胞汇合度控制在约80%。

转染前更换为新鲜培养基，加入携有目的基因的慢病毒载体或空质粒载体，并根据病毒效价使感染复数(multiplicity of infection，MOI)为50，加入质量浓度5 mg/L的Polybrene溶液。干预6-12 h后观察细胞形态并更换新鲜培养基，嘌呤霉素1.5 mg/L筛选^[14-15]。

实验分为3组：①未感染慢病毒的U251为对照组；②感染LV-EGFP的U251为空载组(U251-EGFP)；③感染LV-PTEN-Long-EGFP的U251为过表达组(U251-PTEN- Long-EGFP)。培养两三天后在显微镜(尼康荧光倒置显微镜，ECLIPSE Ti-S，日本)下观察绿色荧光表达情况。

采用Western blot法进行鉴定，应用β-Actin抗体(Affinity公司)、辣根过氧化酶标记羊抗兔抗体(Affinity公司)、AKT1/2/3抗体(Abways公司)、p-Akt抗体(Abways公司)、PTEN(D4.3)XP®单抗(CST公司)及NF-B p65(D14E12)XP®单抗(CST公司)检测蛋白表达(吸光度值)情况。

1.4.2 U251细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立将12只BALB/c-nu裸鼠随机分为3组，每组4只，收集对数增长期的对照组(U251)、空载组(U251-EGFP)及过表达组(U251-PTEN-Long-EGFP)细胞，PBS洗涤后调整细胞浓度为5×10¹⁰ L^-1，在裸鼠背部皮下注射细胞悬液(0.1 mL/只)，构建裸鼠皮下异体移植瘤模型，以接种部位可见或可触及肿瘤小结节为成瘤标准^[16-17]。观察裸鼠一般状况及肿瘤生长趋势，用游标卡尺测量肿瘤最长径(a)和最短径(b) (1次/周)，计算肿瘤体积：V=ab2×0.5，制作肿瘤生长曲线，4周后处死裸鼠，取瘤后称质量。

1.4.3 免疫组织化学染色检测将所有肿瘤标本用甲醛固定，石蜡包埋并切片，脱蜡至水后，室温下体积分数3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶10 min，PBS洗3次，高压锅柠檬酸(pH 6.0)抗原修复液抗原修复3 min，冷却至室温，PBS洗3次。然后滴加一抗(PTEN-Long过表达组)，4 ℃过夜，滴加二抗，室温孵育1 h，二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色，苏木精复染，常规脱水，封固。

结果判定：标本于低倍镜下(日本尼康荧光倒置显微镜ECLIPSE Ti-S；×100)下选取具有代表性阳性染色视野，在低倍率对染色强度和染色细胞百分比进行评估，每张切片选择观察6个高倍(×400)视野，每视野100个细胞，计数阳性细胞百分数及染色强度，取平均值，记录6张切片的结果。结果采用半定量积分法，根据阳性细胞百分率记录分数：0分(无阳性细胞)，1分(阳性细胞数≤10%)，2分(11%-50%)，3分(51%-75%)，4分( > 75%)；根据细胞染色强度记录分数：1分(弱染色)；2分(中度染色)；3分(强染色)；两者乘积为总分数，阴性(-)0分；弱阳性(+)1-4分；中度阳性(++)5-8分；强阳性(+++)9-12分。由3名病理学专家进行双盲单独阅片，将结果进行汇总，商讨后得出最终结果，避免对颜色界定的主观性影响^[18-19]。

1.5 主要观察指标 ①细胞中绿色荧光蛋白表达情况；②细胞中PTEN-Long，Akt及p-Akt蛋白表达量；③裸鼠皮下移植瘤生长趋势及肿瘤体积；④裸鼠皮下移植瘤质量；⑤移植瘤组织中PTEN-Long，p-Akt及NF-B p65胞内表达位置及表达量。

1.6 统计学分析计量资料以x(_)±s表示，应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，多个样本均数间的比较采用单因素方差分析，事后检验比较采用LSD-t 法。以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

PTEN-Long是近年新发现的肿瘤抑制基因，具有特殊的分子结构，是目前肿瘤基因治疗的研究热点。PTEN-Long是PTEN的一种翻译变体，在编码PTEN的mRNA的N端上游513bp处选择了非典型翻译起始密码子CUG，比PTEN多表达173个氨基酸。

PTEN基因编码的蛋白具有双特异性的磷酸酶活性，作为磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)的拮抗剂^[20-23]，使PIP3去磷酸化并下调PI3K-AKT及下游信号通路^[24-25]，发挥抑制肿瘤增殖、迁移、侵袭促进凋亡的作用。

与PTEN相似，PTEN-Long可抑制AKT磷酸化，特殊的是其具有更强的磷酸酶活性及细胞分泌和穿透作用^[4]，基于以上特点，PTEN-Long可能为基因治疗提供了新靶点。

以往研究证实PTEN-Long可在体外细胞水平下调PI3K-AKT信号通路，其下游通路复杂，实验从体内水平证实PTEN-Long对胶质瘤细胞U251的作用及与PI3K-Akt- NF-κB信号通路的关系，构建稳定表达PTEN-Long的慢病毒载体并感染人脑胶质瘤U251细胞，将U251，U251-EGFP，U251-PTEN-Long-EGFP细胞接种于裸鼠皮下，构建裸鼠异体移植瘤模型，从胶质细胞瘤生长趋势看，PTEN-Long可抑制肿瘤生长。

细胞周期蛋白D1是NF-κB的靶基因，PTEN-Long可抑制NF-κB对细胞周期蛋白D1转录的启动作用，抑制G₀/G₁向S期的转换，进而抑制细胞增殖^[26]。实验最新通过免疫组织化学染色法证实了接种携带有PTEN-Long的肿瘤组织中PTEN-Long蛋白表达量明显增加，抑制Akt磷酸化，抑制NF-κB p65核转位^[27]，细胞核中NF-κB及p65表达量降低，下调PI3K-Akt-NF-κB及其下游信号通路，在体内水平抑制了肿瘤细胞增殖并促进凋亡。

与其他肿瘤抑制基因不同的是，PTEN-Long可能通过蛋白质分泌及穿透优势在体内整个循环系统发挥作用^[28]，为基因治疗提供了新方向。研究表明，已确立的PTEN-Long前导序列本质上是无序的^[29]，并且富含翻译后修饰，增加了PTEN治疗疾病的活力^[30]，使PTEN-Long具有直接递送治疗性蛋白质的治疗能力，提供一种新方法来改善临床中的癌症治疗^[31-39]，避免腺病毒介导治疗的不良反应^[40]。

综上，实验结果证实了PTEN-Long可在异体体内抑制胶质细胞瘤生长，其可能通过PI3K-Akt-NF-κB信号通路发挥作用，其有希望成为胶质细胞瘤治疗的新靶点。对于胶质瘤的基因治疗实验尚有局限性，与其他肿瘤不同的是胶质瘤的治疗存在血脑屏障问题，有研究显示通过以具有癌细胞归巢能力的神经干细胞为载体，表达人轻链IgG前导序列并代替PTEN-Long前导序列的PTEN-Long构建体可解决胶质细胞瘤中由于血脑屏障引起的药物吸收障碍问题，并且可稳定PTEN-Long前导序列的细胞间转移能力^[32]。所以，未来实验可构建裸鼠脑肿瘤模型，继续深入探索存在血脑屏障的情况下PTEN-Long对胶质瘤的治疗作用及其作用机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

慢病毒介导PTEN-Long过表达抑制人脑胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤的生长

Lentivirus-mediated overexpression of PTEN-Long inhibits the growth of human glioma U251 cell in nude mice xenografts

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