去血清饥饿条件下肌卫星细胞增殖及自噬蛋白LC3、Beclin1的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1062

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
肌卫星细胞：骨骼肌干细胞，是一系列未分化的单核细胞，位于肌原纤维基膜与基底膜之间，生理情况下，肌卫星细胞通常处于静止状态，一旦细胞的基膜遭到破坏，肌卫星细胞便开始活跃、增殖、分化、融合成为新生的肌纤维。
自噬：自噬是真核细胞中依赖溶酶体途径自我消化的过程，表现为胞质中废弃的蛋白质和细胞器在自噬体中逐渐降解成氨基酸、核酸等小分子，是细胞的一种自我保护反应，可维持细胞内稳态，帮助细胞渡过难关。

摘要
背景：自噬可促进低氧环境下肌卫星细胞的存活，然而基于自噬有明显的时效性，不同时间的自噬水平与肌卫星细胞增殖能力间的关系如何未见探讨。
目的：探讨不同时间去血清饥饿对大鼠肌卫星细胞增殖能力及自噬微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)及Beclin1表达的变化。
方法：原代分离培养雄性SD大鼠(广州中医药大学动物实验中心提供，体质量约120 g)多裂肌卫星细胞，取第3代细胞，培养至对数生长期后，分别设置正常血清组(体积分数10%胎牛血清)、空白血清(仅含培养基，无胎牛血清)6 h组、空白血清12 h组、空白血清24 h组，CCK-8检测各组细胞的增殖情况，并采用Western-blot法和RT-PCR法检测LC3及Beclin1蛋白及基因的表达。
结果与结论：①细胞增殖能力：空白血清诱导12 h后细胞增殖能力较正常血清组及诱导6 h时下降(P < 0.01)，诱导24 h后细胞增殖能力较诱导12 h下降(P < 0.05)；②LC3及Beclin1蛋白及基因的表达：空白血清诱导 6 h后，LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ及Beclin1蛋白及基因的表达较正常血清组明显升高(P < 0.05)，诱导12 h及诱导24 h后LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表达较诱导6 h时明显升高(P < 0.01)，Beclin1的表达较诱导6 h时升高(P < 0.05)，LC3及Beclin1基因的表达较6 h均升高(P < 0.05)；③结果证实，去血清饥饿可以诱导肌卫星细胞发生自噬，自噬在去血清早期(12 h内)可保护细胞的增殖能力，12 h后细胞可出现过度自噬，不利于细胞的增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-5185-2188(刘通)

关键词: 去血清, 饥饿, 肌卫星细胞, 增殖, 自噬, LC3, Beclin1, 大鼠, 去血清饥饿条件, 过度自噬, 肌卫星细胞自噬

Abstract:

BACKGROUND: Autophagy can promote the survival of muscle satellite cells in hypoxic environment. However, based on the obvious time-dependent nature of autophagy, the relationship between the level of autophagy and the proliferation ability of muscle satellite cells at different time has not been explored.
OBJECTIVE: To observe the effect of different time of serum-free starvation on the proliferative capacity and expression of autophagy-related proteins, microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) and Beclin1, in rat muscle satellite cells.
METHODS: Primary multifidus muscle satellite cells were isolated and cultured from male Sprague-Dawley rats (provided by the Animal Experimental Center, Guangdong University of Chinese Medicine in China, about 120 g of weight). Passage 3 cells cultured in logarithmic phase were assigned into normal serum group (10% fetal bovine serum), 6-hour blank serum group, 12-hour blank serum, and 24-hour blank serum group. Proliferative capacity of cells was detected by cell counting kit-8, while the expression of LC3 and Beclin1 at protein and mRNA levels was determined by western blot and RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) No difference was found between the 6-hour blank serum group and the normal serum group in term of the proliferative capacity (P > 0.05), while the proliferative capacity of cells in the 12-hour blank serum group was lower than that in the normal serum group and 6-hour blank serum group (P < 0.01). The proliferative capacity of cells in the 24-hour blank serum group was lower than that in the 12-hour blank serum group (P < 0.05). (2) Compared with the normal serum group, the protein and mRNA expressions of LC3II/LC3I and Beclin1 in the 6-hour blank serum group increased significantly (P < 0.05), while compared with the 6-hour blank serum group, the protein and mRNA expressions of LC3II/LC3I and Beclin were increased significantly in the 12-hour and 24-hour blank serum groups (P < 0.01 or P < 0.05). To conclude, serum-free starvation can induce autophagy in muscle satellite cells, and the autophagy can protect the cell proliferation within 12 hours. However, excessive autophagy maybe occurs after 12 hours, which is detrimental to the cell proliferation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Muscle, Skeletal, Autophagy, Tissue Engineering

中图分类号:

R456
R318

刘通, 于佳妮, 刘悦, 陈欢, 邝伟川, 王小寅, 张淑静, 江烨, 邱晓佳, 文希. 去血清饥饿条件下肌卫星细胞增殖及自噬蛋白LC3、Beclin1的表达[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(11): 1657-1661.

Liu Tong, Yu Jiani, Liu Yue, Chen Huan, Kuang Weichuan, Wang Xiaoyin, Zhang Shujing, Jiang Ye, Qiu Xiaojia, Wen Xi . Effects of serum-free starvation on proliferative capacity of muscle satellite cells and expression of autophagy-related proteins LC3 and Beclin1 [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(11): 1657-1661.

图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。

1.2 时间及地点于2017年3月至2018年2月在广东省第二中医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验用主要试剂 RPMI 1640培养基(Solarbio)，布比卡因盐酸盐(Bupivacaine Hydrochloride，BPVC) (Sigma)；CCK-8试剂盒(日本同仁公司)，SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒(TOYOBO)；RIPA裂解缓冲液、BCA快速蛋白定量试剂盒、super ecl plus超敏发光液(北京普利莱公司)；胎牛血清(四季青公司)，Ⅰ型胶原酶(Genebio)，0.25%EDTA-胰蛋白酶(Solarbio)，LC3抗体(CST)，Beclin1抗体(CST)，β-actin抗体(Bioss)，蛋白Marker(Biorad)。

1.3.2 实验用主要仪器超净工作台(SAE-4Al，新加坡ESCO科技有限公司)；CO₂培养箱(CB210，德国BINDER公司)；蛋白质电泳及转膜系统(美国Bio-Rad公司)；凝胶成像系统(FluorChem FC2，美国Alpha Innotech公司)；PCR仪(Biorad)；Real-Time PCRStepOne(Applied Biosystem)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养及干预取体质量约120 g的SPF级雄性SD大鼠1只(来源于广州中医药大学动物实验中心)，原代分离、培养多裂肌卫星细胞，具体方法同前期实验^[8-9]。选取第3代细胞，培养至对数生长期：①CCK-8检测：按2×10⁴/孔将细胞悬液接种到96孔板中，待细胞浓度达70%融合时，以PBS洗涤3遍，分别设置正常血清组(RPMI 1640培养基+体积分数10%胎牛血清，n=6)、空白血清6 h组(RPMI 1640培养基培养6 h，n=6)、空白血清12 h组(RPMI 1640培养基培养12 h，n=6)、空白血清24 h组(RPMI 1640培养基培养24 h，n=6)；②Western-blot和RT-PCR检测：按1×10⁶/皿将细胞悬液接种到100 mm培养皿中，待细胞浓度达70%融合时，PBS洗涤3次，分别设置正常血清组(n=5)、空白血清6 h组(n=5)、空白血清12 h组(n=5)、空白血清24 h组(n=5)，各组处理方法同前，分别于相应时间节点收集细胞行相关检测。

1.4.2 CCK-8检测各组细胞增殖情况各组细胞分别培养相应时间后，将96孔板取出，每孔加入10 μL CCK-8溶液，放回培养箱，37 ℃继续培养1 h。1 h后，取出96孔板，于酶标仪上450 nm波长处测定各孔吸光度值。将各组所测得的吸光度值进行数据统计。吸光度值越大，说明细胞数目越多，细胞增殖能力越强。

1.4.3 Western-blot法检测各组细胞LC3及Beclin1蛋白的表达各组细胞分别培养相应时间后，提取细胞总蛋白并测定蛋白含量，于沸水中煮沸5 min进行蛋白变性，按每孔50 μg蛋白上样，80 V电泳至浓缩胶与分离胶分界线处，然后换为100 V电泳70 min，以肉眼观察溴酚蓝的条带距胶底约1 cm停止电泳，换100 V电转70 min。5%脱脂奶粉的TBST封闭 1 h，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h，ECL显色。β-actin为内参对照。Alpha Innotech^® Fluor Chem FC2凝胶成像系统采集图像，ImageJ软件定量分析LC3及Beclin1与β-actin的吸光度值，取LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1/β-actin吸光度比值进行统计分析。

1.4.4 RT-PCR检测各组细胞LC3 mRNA以及Beclin1 mRNA的表达各组细胞分别培养相应时间后，Trizol法提取各组细胞总RNA，并用紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度(A_{260 nm}/A_{280 nm}>1.8)。根据浓度取2 μg总RNA按照反转录试剂盒操作说明在PCR扩增仪上65 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min将RNA反转录为cDNA。引物序列见表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因名称	引物序列(5’-3’)	片段长度(bp)
LC3	正义：CAA CAT GAG CGA GTT GGT CAA GA	97
LC3	反义：ACT CAC CAT GCT GTG CTG GTT C
Beclin1	正义：ATG CAG GTG AGC TTC GTG TG 反义：CTG GGC TGT GCT AAG TAA TGG A	120
β-actin	正义：GGC CAA CCG CGA GAA GAT	61
β-actin	反义：GTA CAT GGC TGG GGT GTT GAA

除β-actin引物购自上海生工生物技术公司外，其余引物均由上海英潍捷基生物技术公司合成。在无菌去酶的Eppendorf管中按照说明书将配置好的RT-PCR反应液(反应总体积为20 μL)离心数秒，混匀后迅速置入实时荧光定量PCR仪中，预变性94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，扩增40个循环，获得各样本待测基因的Ct值。以β-actin作为内参照校正，采用2^-^??Ct法进行试验数据处理，其结果代表各目的基因表达的相对定量。

1.5 主要观察指标各组LC3及Beclin1的蛋白及mRNA的表达变化。

1.6 统计学分析应用SPSS 21.0软件进行统计学处理。各组数据以x(_)±s表示。数据均服从正态分布，多组间数据差异采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

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讨论

自噬作用是细胞在应激或饥饿状态下，通过分解细胞质内生物大分子为恶劣条件下的存活提供能量，同时清除细胞内衰老细胞器、受损结构及蛋白质分子的过程，是细胞应对不良环境的自我保护机制。正常条件下，细胞自噬处于较低水平，在营养缺乏、缺氧、蛋白质错误折叠等情况下，自噬可增强。研究发现，自噬与多种干细胞正常生理功能的发挥及病理紊乱均有密切的联系^[10-12]，对于骨骼肌干细胞——肌卫星细胞而言，自噬是一个决定性的干细胞命运调控者^[13]，自噬可通过保持肌卫星细胞的静止状态，维持其干性特征，而关于自噬与肌卫星小增殖能力间的关系尚未见相关研究。

LC3和Beclin 1是常用的自噬小体标志物，用于评价细胞自噬的水平^[14]。LC3是酵母Atg8在哺乳动物中的同源物，LC3的修饰过程对自噬泡的形成起关键作用。LC3主要包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种，LC3-Ⅰ主要分布于细胞质内，当自噬体形成时，自噬基因Atg7可以活化LC3-Ⅰ，活化的LC3-Ⅰ经Atg3泛素化修饰后与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-Ⅱ。由于LC3-Ⅱ定位于自噬体内外膜，其含量与自噬泡的数量成正比关系。Beclin1是哺乳动物酵母Atg6基因的同源物，其参与自噬的机制主要是通过与Ⅲ型磷脂酰肌醇激(PI3K)形成复合物参与募集其他蛋白质，促进自噬体膜的形成，并引导其他Atg蛋白定位于自噬体膜。因此，通过Western-blot检测LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的转化以及Beclin1的表达，可以明确细胞内自噬水平。

适当的自噬对机体起到保护作用，过度的自噬则会引起细胞的损伤，甚至死亡，也被称为Ⅱ型程序性或细胞自噬性死亡^[15-18]。实验结果发现在饥饿6 h时，自噬水平明显升高，但细胞的增殖能力并未见明显降低，说明自噬对恶劣环境下肌卫星细胞的增殖有一定的促进作用，这与先前的研究结果相符^[19]。诱导12 h及24 h后，尽管存在自噬水平的继续升高，但细胞增殖能力较6 h时却出现了下降，且24 h时较12 h下降更明显，说明诱导12 h及24 h后细胞的自噬不再能保护细胞的正常增殖，这可能是因为细胞出现了过度的自噬，此时自噬功能发生紊乱，造成溶酶体、线粒体等细胞器结构和功能的破坏。

尽管目前已有研究探讨了低氧环境诱导的自噬对颏舌肌卫星细胞增殖与凋亡的影响^[20]，然而该研究仅仅探讨了单一时间点自噬与增殖的关系，基于自噬有明显的时效性，不同时间的自噬水平与细胞增殖能力间的关系如何未见探讨。Zhang等^[21]虽然探讨了不同时间低氧诱导对颏舌肌卫星细胞自噬蛋白表达的影响，而对自噬与增殖的关系缺乏探讨。实验以去血清饥饿法对体外培养的多裂肌肌卫星细胞进行干预^[22-24]，初步明确了不同时间自噬水平与肌卫星细胞增殖能力的关系。在正常血清培养条件下，细胞仅存在微弱程度的自噬水平，这可能是细胞保证自身增殖能力，防止向衰老转化的重要保证^[25]。在缺血清诱导的肌卫星细胞自噬过程中，自噬随着时间进展呈现先增强后平稳的趋势，该结果与Loos等^[18]的研究结果相似。

尽管实验明确了去血清饥饿可诱导肌卫星细胞自噬蛋白的表达，但其中的机制仍缺乏探讨。有研究表明，DNA损伤修复蛋白Mec1特异性的参与了能量匮乏诱导的自噬，并发现在能量匮乏条件下，Snf1(AMPK分子在酵母中的同源物)、DNA损伤修复蛋白Mec1(ATR分子在酵母中的同源物)和自噬蛋白Atg1特异性的招募到线粒体上通过调节线粒体的呼吸作用来控制细胞自噬的发生^[26]。也有研究表明，在葡萄糖饥饿的情况下，活化的AMPK可以磷酸化PAQR3的第32位苏氨酸，进而促进ATG14 L相关的3型PI3K的激活以及自噬小体的形成^[27]。关于自噬蛋白促进细胞增殖的机制，有研究认为饥饿可诱导细胞FoxO3a的过量表达，进一步促进一系列E3泛素酶如Atrogin-1及Murf-1的表达，促使细胞向萎缩和凋亡的方向发展，而自噬蛋白如LC3的表达在一定程度上可以抑制FoxO3a调控的细胞萎缩倾向，如Paolini等^[28]的研究也认为在饥饿处理肌细胞的前12 h内，抑制自噬的表达可以促进肌细胞向萎缩的转化。

实验结果可能为促进临床上肌肉损伤或萎缩后的修复提供一定的干预靶点，肌肉损伤早期，损伤局部会出现炎性因子的大量浸润，同时由于局部微循环的破坏，肌细胞内能量物质逐渐耗竭，代谢产物大量累积，肌细胞的代谢功能出现严重紊乱^[29-30]。此时，促进自噬可通过降解细胞内的代谢废物，维持细胞内环境的相对稳定，从而为恶劣环境下的细胞生存提供保证，防止细胞的凋亡坏死，而12 h后，细胞内的代谢废物可能已经基本清除，此时则需要适度的降低自噬水平，以防止细胞出现过度自噬，诱发凋亡。当然，该结论仍需要动物体内实验及临床上的进一步验证。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程