黄芪甲苷通过炎症小体活化影响软骨细胞炎性因子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1068

摘要/Abstract

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文题释义：
NLRP3炎症小体：NLRP3炎症小体位于巨噬细胞等多种免疫细胞中，主要作用是识别外界的刺激信号，活化的NLRP3炎症小体可以激活半胱天冬氨1，进一步剪切白细胞介素1β，18等促炎介质诱导炎性反应。
黄芪甲苷：提取于豆科草本植物黄芪，具有抗肿瘤、增强免疫及促进生长等药理活性，还发现其可以抑制基质金属蛋白酶活性，改善膝关节炎的临床症状。

摘要
背景：有研究表明黄芪甲苷对关节炎具有保护作用，但其对软骨细胞炎症反应及其作用机制尚不明确。
目的：探讨黄芪甲苷对脂多糖促使软骨细胞NLRP3炎症小体活化及炎性因子表达的影响。
方法：体外原代培养武汉巴菲尔生物有限公司提供的SD大鼠软骨细胞，根据不同干预方法分为对照组、脂多糖(1 mg/L)诱导组、脂多糖+低剂量(25 mmol/L)黄芪甲苷组、脂多糖+中剂量(50 mmol/L)黄芪甲苷组、脂多糖+高剂量(100 mmol/L)黄芪甲苷组，脂多糖与不同浓度黄芪甲苷共同处理细胞24 h，采用细胞计数法分析细胞相对存活率，酶联免疫吸附实验检测白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α水平，蛋白免疫印迹法检测NLRP3炎症小体、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1、白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α蛋白表达水平。
结果与结论：①软骨细胞形态：细胞核呈蓝色、胞质呈红色。与脂多糖诱导组比较，不同浓度黄芪甲苷组中软骨细胞相对存活率显著升高(P < 0.05)；②炎性因子变化：黄芪甲苷各剂量组细胞上清中炎性因子白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α水平显著降低(P < 0.05)，软骨细胞中NLRP3炎症小体、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1、白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α蛋白表达水平显著降低(P < 0.05)，呈浓度依赖性；③结果证实，黄芪甲苷能够抑制NLRP3炎症小体活化影响软骨细胞白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α蛋白的产生，进而抑制关节软骨细胞炎症损伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-4905-4643(余素姣)

关键词: 黄芪, 黄芪甲苷, 软骨, 软骨细胞, 炎症小体, 炎症因子, 软骨组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Astragaloside IV has been shown to hold a protective effect on arthritis, but its effect on inflammatory response in chondrocytes and the underlying mechanism are not yet clear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of astragaloside IV on the activation of NLRP3 inflammasome and the releases of inflammatory cytokines in chondrocytes.
METHODS: Sprague-Dawely rat knee chondrocytes (Wuhan Bafeier Biological Co., Ltd.) were cultured in vitro, which were identified by type II collagen immunofluorescence. Chondrocytes were divided into five groups, including control group, lipopolysaccharide (1 mg/L)-induced group, and lipopolysaccharide plus low-dose (25 mmol/L), medium-dose (50 mmol/L), and high-dose (100 mmol/L) astragaloside IV groups. Cells were
treated with lipopolysaccharide and astragaloside IV for 24 hours. The relative cell survival rate was analyzed by cell count. The levels of interleukin-1β and tumor necrosis factor-α were detected by ELISA. The protein expression levels of NLRP3, caspase-1, interleukin-1β, and tumor necrosis factor-α were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The cell nucleus of chondrocytes was blue and cytoplasm was red under the fluorescent microscope. Compared with lipopolysaccharide-induced group, the relative survival rate of chondrocytes in each astragaloside IV group was significantly increased (P < 0.05). The levels of interleukin-1β and tumor necrosis factor-α in supernatant were significantly decreased (P < 0.05). The expression levels of NLRP3 inflammasome, caspase-1 and interleukin-1β and tumor necrosis factor-α were significantly decreased in a dose-dependent manner (P < 0.05). These results indicate that astragaloside IV can inhibit the expression of interleukin-1β and tumor necrosis factor-α protein in chondrocytes through inhibiting the activation of NLRP3 inflammasome, and further inhibit the inflammatory reaction of articular chondrocytes.

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Key words: Tissue Engineering, Chondrocytes, Lipopolysaccharides

中图分类号:

R453
R364

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图/表（结果） 2

2.1 细胞鉴定结果刚接种细胞为悬浮的圆颗粒，置于培养箱中1 d后贴壁生长，形态为梭形，部分为多角形；到第7天细胞贴壁增殖为单层，形态为不规则立体“铺路石”样。前6代细胞形态规则、大小均一、增殖较快。Ⅱ型胶原免疫荧光染色可见胞核为深蓝色，以圆形、椭圆为主，见图1。

2.2 黄芪甲苷对软骨细胞增殖的影响与对照组相比，脂多糖诱导组细胞增殖受到明显抑制(P < 0.05)。与脂多糖诱导组相比，低、中、高剂量黄芪甲苷可以明显促进细胞增殖，3个药物组间比较细胞相对存活率差异有显著性意义 (P < 0.05)，并且随着药物剂量升高细胞相对存活率也明显增高(P < 0.05)。结果见图2。

2.3 黄芪甲苷对软骨细胞上清中白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α水平的影响黄芪甲苷作用软骨细胞24 h后，低、中、高剂量药物对细胞分泌白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α的影响如表1所示。脂多糖诱导组细胞分泌的白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α水平显著高于正常对照组(P < 0.05)；而经过低、中、高剂量黄芪甲苷干预后，白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α分泌水平显著低于脂多糖诱导组(P < 0.05)。可见随着黄芪甲苷浓度上升，白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α分泌水平显著降低，3个药物组间比较白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α水平差异有显著性意义(P < 0.05)，说明黄芪甲苷呈浓度依赖性影响脂多糖诱导软骨细胞炎症反应。

2.4 黄芪甲苷对软骨细胞NLRP3炎症小体及Caspase-1表达的影响与对照组相比，脂多糖诱导组软骨细胞中NLRP3及Caspase-1表达水平显著升高(P < 0.05)。与脂多糖诱导组相比，低、中、高剂量黄芪甲苷可以明显抑制NLRP3及Caspase-1表达，并且随着药物剂量升高细胞中NLRP3及Caspase-1表达水平随着降低(P < 0.05)；而且3个药物组间比较NLRP3及Caspase-1表达水平差异有显著性意义(P < 0.05)。结果见图3。

2.5 黄芪甲苷对软骨细胞白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α表达的影响与对照组相比，脂多糖诱导组软骨细胞中白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α表达水平显著升高(P < 0.05)。与脂多糖诱导组相比，低、中、高剂量黄芪甲苷可以明显抑制白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α表达，并且随着药物剂量升高细胞中白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α表达水平随着降低(P < 0.05)；3个药物组间比较白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α表达水平差异有显著性意义(P < 0.05)。结果见图4。

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引言

膝关节炎属于临床上常见的老年化相关的退行性关节炎，其中主要为膝关节退变^[1-3]。近十年来发现，代谢性炎症在骨关节炎的发生发展过程中有着重要影响^[4-5]，因此能够寻找抑制骨关节炎中炎性因子表达的药物，降低其损伤，对治疗骨关节炎有着重大意义。NLRP3炎症小体属于胞内固有免疫受体，由半胱天冬氨酸前体1(caspase-1)及凋亡相关斑点样蛋白组成的蛋白复合体。NLRP3炎症小体位于巨噬细胞等多种免疫细胞中，主要作用是识别外界的刺激信号，活化的NLRP3炎症小体可以激活半胱天冬氨酸1，进一步剪切白细胞介素1β，18等促炎介质诱导炎性反应^[6-8]。

NLRP3炎症小体下游的caspase-1是一个重要的效应分子，其活性变化能够作为重要的致病因素，介导多种自身免疫病的发生^[9-10]。临床研究表明关节炎患者发病初期就存在caspase-1的过度激活现象，并且认为caspase-1可以作为治疗关节炎的一个药物作用靶点^[11]。相关研究报道NLRP3炎症小体参与骨关节炎发生发展，其过度表达是出现关节炎的发病机制之一^[12-13]，于是抑制软骨细胞NLRP3炎症小体表达也是改善骨关节炎的手段之一。因此，该文把NLRP3炎症小体作为治疗关节炎的一个药物靶点，观察药物对软骨细胞炎症反应的机制。

黄芪甲苷提取于豆科草本植物黄芪，具有抗肿瘤、增强免疫及促进生长等药理活性，还发现其可以抑制基质金属蛋白酶活性，改善膝关节炎的临床症状^[14-15]。早期已有研究证实黄芪甲苷对NLRP3信号传导具有抑制作用，进而降低内质网的氧化应激损伤^[16]、改善神经炎性反应^[17]、抑制心肌纤维化等^[18]。虽然已有学者提出黄芪甲苷对关节炎具有改善作用，但是缺乏体外研究去探讨黄芪甲苷对软骨细胞炎性反应影响的分子机制。

实验探讨了黄芪甲苷对软骨细胞炎症损伤的影响，同时观察了其对NLRP3/Caspase-1炎性通路的影响。因此，实验采用脂多糖诱导软骨细胞炎性模型，采用25，50， 100 mmol/L黄芪甲苷处理软骨细胞24 h后，探讨黄芪甲苷对软骨细胞NLRP3炎症小体活化及炎性因子表达的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照细胞实验。

1.2 时间及地点于2017年3月至2018年5月在恩施土家族苗族自治州中心医院中心试验室完成。

1.3 材料

1.3.1 大鼠软骨细胞原代软骨细胞由武汉巴菲尔生物有限公司提供。

1.3.2 药品、试剂与仪器黄芪甲苷(批号130659- 200809)购自中国药品生物制品检定所；改良型1640培养基(上海吉诺公司)；Ⅱ型胶原酶(Gibco公司)；脂多糖(Sigma公司)；CCK8试剂盒购自日本同仁研究所；白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α ELISA试剂盒购自CUSABIO公司；β-actin、NLRP3、Caspase-3、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α一抗均购自美国CST公司；二抗羊抗兔IgG购自美国LI-COR Biosciences。

单人超净台(AIRTECH)；CB15C02细胞培养箱(德国Binder)；Victor3 1420 Multilable Counter酶标仪(美国Perkin Elmer公司)；DYCZ-24DN SDS-PAGE凝胶电泳(背景六一仪器厂)；Ⅸ71/Ⅸ81型荧光倒置显微镜(北京斯内克创新科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养及鉴定将细胞悬于体积分数10%FBS及1%A-A(100 U/mL青霉素-100 U/mL链霉素)培养基中，放入恒湿培养箱中，条件设置为37 ℃、体积分数5%CO₂， 2 d后观察细胞贴壁情况，第3天采用Ⅱ型胶原免疫组化染色法鉴定细胞。将细胞培养于有爬片的皿中，细胞贴壁后PBS轻洗2次，加入40 g/L多聚甲醛处理20 min，PBS漂洗后血清封闭20 min，甩干封闭液加入Ⅱ型胶原抗体溶液 4 ℃过夜，然后孵育二抗后，DAB显色。将培养的第2代细胞进行后续实验。将细胞分为对照组、脂多糖(1 mg/L)诱导组、脂多糖+低剂量(25 mmol/L)黄芪甲苷组、脂多糖+中剂量(50 mmol/L)黄芪甲苷组、脂多糖+高剂量 (100 mmol/L)黄芪甲苷组，脂多糖与不同浓度黄芪甲苷共同处理细胞24 h。每组实验重复3次。

1.4.2 CCK8实验将细胞重悬后，以1×10⁴个/孔的细胞浓度种于96孔板中，待细胞贴壁生长到50%-60%时，取出培养板，弃去旧培养基，分别加入不同浓度的黄芪甲苷稀释培养液(0，25，50，100 mmol/L)，继续培养24 h后加入CCK8试剂，轻轻震荡均匀继续孵育1 h，取出置于酶标仪中，于 450 nm处测定吸光度值(A)，设6个复孔，计算细胞相对存活率。细胞相对存活率(%)=(A_实验组/A_对照组)×100%。

1.4.3 ELISA实验将细胞重悬后，以1×10⁵个/孔的细胞浓度种于6孔板中，细胞长满至50%-60%后，取出培养板，弃去旧培养基，分别加入不同浓度的黄芪甲苷稀释培养液(0，25，50，100 mmol/L)，继续培养24 h后，收集细胞及上清。上清用于炎性因子白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α水平分析。白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α水平检测步骤严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.4.4 Western Blot实验将细胞用RIPA裂解液充分裂解，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清。采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。向蛋白裂解液中加入蛋白上样缓冲液，于100 ℃加热煮沸7 min。每孔加入50 μg蛋白上样，在10%的SDS-PAGE凝胶中电泳分离，分离胶电泳时电压设置为70 V，浓缩胶电泳分离时电压设置为120 V；分离完成后在270 mV电流转膜90 min；体积分数5%脱脂牛奶封闭1 h；加兔抗鼠入β-actin、NLRP3、Caspase-3、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α单克隆一抗(1∶1 000)反应过夜后，再二加抗(1∶3 000)室温反应1 h，用TBST洗膜3次，用ECL显色液显色后，采用X射线胶片曝光。利用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin为参照计算蛋白相对表达量。

1.5 主要观察指标 CCK8方法分析了软骨细胞相对存活率；ELISA实验检测了软骨细胞上清中白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α水平；Western Blot方法分析了软骨细胞NLRP3炎症小体及Caspase-1表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计分析，实验数据用x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析检验，事后检验采用SNK检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

炎性通路的活化是导致膝关节炎的主要病理机制。当前对膝关节炎的治疗药物较多，但是临床疗效均不是很可观；其中非类固醇抗炎药居多，即使其抗炎效果显著，但引发的毒性反应明显。近十年来，中药在治疗膝关节炎的应用也越来越广泛，其中独活寄生汤、姜黄素等较多。黄芪甲苷表现出降血压、调节免疫功能、抑制骨组织磨损等药理活性^[19]。前期研究已表明黄芪甲苷可通过抑制退变软骨细胞白细胞介素1β表达来缓解病变速度^[15]；调节软骨细胞Ⅱ型胶原及ACAN表达进一步减慢膝关节软骨细胞衰变的速度^[20]；低浓度黄芪甲苷可以降低退变软骨细胞中基质金属蛋白酶1/3表达，来达到减慢软骨细胞退变的速度^[14^，^21]。

膝关节炎主要为软骨细胞来源减少并且凋亡增高导致，异于正常细胞凋亡机制，细胞凋亡会加速软骨组织及细胞的坏死。于是，降低膝关节炎软骨细胞的过度凋亡，是延缓该疾病的一种有效治疗方法。实验发现黄芪甲苷干预后细胞增殖增强，与药物浓度呈依赖关系，而且随着药物浓度的升高，黄芪甲苷能明显抑制炎性因子白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α的分泌。早期研究报道黄芪甲苷能够通过抑制白细胞介素1β诱导的关节炎症及损伤，从而被当做抗关节炎药物使用^[22]；还发现黄芪甲苷还能降低缺血/再灌注鼠脑组织中白细胞介素1β、caspase-3基因的表达^[23]。除此之外，黄芪甲苷对促炎症因子肿瘤坏死因子α的表达也有下调作用，进而改善多种炎性疾病^[24-25]。为了进一步研究黄芪甲苷通过何种途径抑制炎症因子的产生，实验采用Western blot方法进一步观察了NLRP3炎性小体表达水平的变化。

药物对炎性通路的抑制能够改善炎症损伤。炎性小体分布于细胞质中的一类蛋白复合体。炎性小体为固有免疫的组成成分，可以模式识别受体相互作用识别病原菌及风险刺激，进一步活化caspase-1，产生成熟的白细胞介素1β，引发炎性反应^[26-27]。近期研究报道，NLRP3炎性小体的异常表达在类风湿关节炎的发生发展中起着重要作用。Simard等^[28]研究提示钙结合蛋白S100A8及S100A9蛋白在膝关节炎中发挥的促炎作用与它们活化NLRP3炎性小体密切相关。NLRP3蛋白在静息条件下不能自身抑制，而始终保持激活状态，于是通过形成炎性小体的方式持续分泌白细胞介素1β，诱导很强的炎性反应。研究还报道NLRP3基因突变与关节炎患者的易感性及肿瘤坏死因子α治疗反应性均有密切关系^[29-30]。于是，作者假设对NLRP3炎性小体表达进行抑制可以帮助缓解软骨细胞炎性损伤，降低膝关节炎的发病速度。

因此，实验体外培养原代小鼠的软骨细胞，采用脂多糖诱导细胞炎症模型，进而观察黄芪甲苷干预对软骨细胞炎性因子分泌及NLRP3/Caspase-1信号通路活化的影响。实验发现黄芪甲苷能显著抑制NLRP3炎症小体及Caspase-1蛋白表达，进一步降低了其下游白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α蛋白表达水平。发现黄芪甲苷不仅仅增强了软骨细胞增殖、抑制炎性因子白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α的产生，还显著抑制了NLRP3及Caspase-1表达，说明黄芪甲苷具有治疗膝关节炎的潜在价值。综上所述，黄芪甲苷能抑制脂多糖诱导的软骨细胞炎症反应、促使软骨细胞增殖，其作用机制可能与抑制NLRP3炎性小体的表达相关。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程