火针刺激骨关节炎模型兔犊鼻、内膝眼穴位后软骨细胞外基质及Wnt信号通路的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1139

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
Wnt信号通路：1982年在小鼠乳腺癌发现了Wnt基因，由于此基因激活依赖小鼠乳腺癌相关病毒基因的插入，因此，当时被命名为Int1基因，之后的研究表明，Int1基因在小鼠正常胚胎发育中起重要作用，相当于果蝇的无翅(Wingless)基因，可控制胚胎的轴向发育。此后大量研究提示了Int1基因在神经系统胚胎发育中的重要性，因此将Wingless与Int1结合，称为Wnt基因。人Wnt基因定位于12q13.在胚胎发育中，Wnt基因调控的重要信号传导系统即为Wnt通路。
火针：较为常见的一种针刺方法，该疗法汇集了毫针激发经气、火气温阳散寒的功效，可以直接刺激病灶的反应点，迅速消除或改善局部组织水肿、充血、渗出、粘连、钙化、挛缩、缺血等病理变化，从而加快循环、促进代谢，使受损组织和神经重新修复，治疗效果明显。

摘要
背景：针灸能够改善骨关节炎的关节症状、降低炎症反应。火针属于针灸的一种，有学者报道称火针能够治疗骨关节炎，疗效确切，但具体机制尚不明确。
目的：明确火针刺激犊鼻、内膝眼对兔骨关节炎模型作用效应及具体机制。
方法：4月龄新西兰大白兔32只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验分为4组：假手术对照组、骨关节炎组、西药治疗组、火针治疗组。除假手术对照组外，其他3组兔通过高分子固定带固定新西兰兔右膝的方法制造膝关节骨性关节炎模型，造模开始后的第7天，分别用玻璃酸钠、火针刺激犊鼻及内膝眼对西药治疗组、火针治疗组家兔进行治疗，每隔3 d治疗1次，连续6次。疗程结束后采用ELISA法测定各组家兔血清中基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂1水平；番红-O染色用于骨关节炎组织学评估，Mankin评分评估骨关节炎模型；定量PCR和Western-blotting检测软骨组织中Wnt信号通路的变化。
结果与结论：①西药治疗组、火针治疗组家兔软骨Mankin评分及组织学染色显示，软骨退化水平相较于模型组有下调趋势；②经治疗后，西药治疗组、火针治疗组家兔血清中基质金属蛋白酶1和金属蛋白酶组织抑制剂1表达较骨关节炎组分别出现显著的降低和显著升高(P < 0.05)；③西药治疗组、火针治疗组家兔软骨中基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂1及Wnt信号通路分子β-catenin的mRNA和蛋白表达相较于模型组分别有下调、上调及下调的趋势，差异有显著性意义；④结果说明，火针刺激犊鼻、内膝眼是治疗膝关节骨性关节炎的一种简便有效方法，其作用机制可能是通过降低血清中异常升高的基质金属蛋白酶1水平，调节基质金属蛋白酶1和金属蛋白酶组织抑制剂1比例关系，调节细胞外基质的降解过程及影响Wnt信号通路，从而减缓软骨退变的进程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-1824-1692(奥晓静)

关键词: 骨关节炎, Wnt信号通路, 火针, 基质金属蛋白酶

Abstract:

BACKGROUND: Acupuncture and moxibustion can improve the articular symptoms of osteoarthritis and alleviate inflammatory reaction. Fire-needle moxibustion has been reported to treat osteoarthritis, showing exact efficacy, but the underlying mechanism remains unclear.
OBJECTIVE: To clarify the effect of fire-needle moxibustion at Dubi (ST 35) and Neixiyan on the rabbit models of osteoarthritis, and the underlying mechanism.
METHODS: Thirty-two 4-month-old New Zealand rabbits were selected (provided by Shanghai Slac Laboratory Animals Co., Ltd.). There were four groups, including sham operation, osteoarthritis, Western medicine, and fire-needle moxibustion groups. The rabbit knees in the latter three groups were fixed using polymer fixing band to establish the model of knee osteoarthritis. Seven days later, the rabbits were treated by sodium hyaluronate, and fire-needle moxibustion at Dubi and Neixiyan, respectively, for 6 consecutive courses with 3 days in between. The levels of matrix metalloproteinase-1 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in serum of rabbits in each group were determined by ELISA after treatment. Safranin-O staining was used for osteoarthritis histological evaluation. Mankin score was used to evaluate osteoarthritis model. Changes of Wnt signaling pathway in cartilage tissues were detected by qualified PCR and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Mankin score and histological staining results showed that the cartilage degradation level in the Western medicine, and fire-needle moxibustion groups was downregulated compared with the osteoarthritis group. After treatment, compared with the osteoarthritis group, the serum levels of matrix metalloproteinase-1 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 were significantly decreased and increased in the Western medicine and fire-needle moxibustion groups, respectively (P < 0.05). The levels of matrix metalloproteinase-1 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1, and β-catenin mRNA and protein in cartilage in the Western medicine and fire-needle moxibustion groups were significantly lower, higher and lower than those in the osteoarthritis group, respectively. These results indicate that fire-needle moxibustion at Dubi and Neixiyan is a simple and effective method for knee osteoarthritis. The mechanism may be through reducing the abnormally increased metalloproteinase-1 level, regulating ratio of metalloproteinase-1 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1, regulating the degradation process of extracellular matrix and affecting the Wnt signaling pathway, thereby alleviating the progression of cartilage degeneration.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoarthritis, Signal Transduction, Matrix Metalloproteinases, Tissue Engineering

中图分类号:

R446

奥晓静，苗茂，谭亚芹，郝华. 火针刺激骨关节炎模型兔犊鼻、内膝眼穴位后软骨细胞外基质及Wnt信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(11): 1662-1668.

Ao Xiaojing, Miao Mao, Tan Yaqin, Hao Hua. Changes of cartilage extracellular matrix and Wnt singling pathway in rabbit models of osteoarthritis after treatment by fire-needle moxibustion at Dubi and Neixiyan[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(11): 1662-1668.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析实验选用新西兰大白兔32只，分为4组，实验过程无脱失，32只均进入结果分析。

2.2 火针对兔骨关节炎大体及病理形态学的影响假手术对照组骨关节表面光滑规整，关键间隙正常，未见骨刺的形成。骨关节炎组关节软骨表面粗糙、不光滑，关节软骨变薄、甚至剥脱，关节间隙变窄，关节周围可见骨赘形成。火针治疗组和西药治疗组骨关节炎症状较骨关节炎组明显好转。番红-O染色的结果显示，玻璃酸钠治疗和火针治疗均能够降低骨关节炎兔中细胞外基质的降解。见图1。

2.3 病理学评分评价火针治疗对骨关节炎的效应骨关节炎组的OARSI评分显著高于假手术对照组(P < 0. 05)。火针治疗组和西药治疗组的OARSI评分显著低于骨关节炎组(P < 0.05)。同时，在软骨结构、细胞应答、糖胺聚糖组分及汇总的Mankin评分中也观察到一致的效应，即火针治疗和西药玻璃酸钠治疗均能够显著降低骨关节炎兔的病理积分。见图2，3。

2.4 火针治疗对骨关节炎兔血清基质金属蛋白酶1及金属蛋白酶组织抑制剂1水平的影响骨关节炎组的血清基质金属蛋白酶1水平显著高于假手术对照组及金属蛋白酶组织抑制剂1水平显著低于假手术对照组(均P < 0.05)。火针治疗组和西药治疗组的血清基质金属蛋白酶1水平显著低于骨关节炎组及金属蛋白酶组织抑制剂1水平显著高于假手术对照组(均P < 0.05)。见表3。

2.5 火针治疗对基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂1及Wnt信号通路关键分子β-catenin的mRNA水平的影响见图4。从结果可见，骨关节炎组骨组织中的基质金属蛋白酶1及β-catenin的mRNA显著高于假手术对照，金属蛋白酶组织抑制剂1水平显著低于假手术组，差异有显著性意义(P < 0.05)。火针治疗组和西药治疗组基质金属蛋白酶1及β-catenin的mRNA显著低于骨关节炎组，金属蛋白酶组织抑制剂1水平显著高于骨关节炎组，差异有显著性意义 (P < 0.05)。提示火针治疗能够通过降低基质金属蛋白酶1，升高金属蛋白酶组织抑制剂1及降低Wnt信号通路关键分子β-catenin的mRNA和蛋白水平来影响骨关节炎的进展。
2.6 火针治疗对基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂1及Wnt信号通路关键分子β-catenin的蛋白表达的影响见图5。从结果可见，骨关节炎组骨组织中的基质金属蛋白酶1及β-catenin的蛋白表达水平显著高于假手术对照，金属蛋白酶组织抑制剂1水平显著低于假手术组(P < 0.05)。火针治疗组和西药治疗组基质金属蛋白酶1及β-catenin的蛋白表达水平显著低于骨关节炎组，金属蛋白酶组织抑制剂1水平显著高于骨关节炎组(P < 0.05)。提示火针治疗能够通过降低基质金属蛋白酶1，升高金属蛋白酶组织抑制剂1及降低Wnt信号通路关键分子β-catenin的蛋白水平来影响骨关节炎的进展。

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引言

骨关节炎是指以关节软骨的退行性改变、周围结缔组织的增生为主要病理特征的一类退行性关节病，其主要的临床表现为关节的疼痛和功能障碍等^[1-2]。骨关节炎好发于中老年人群，据报道，60岁以上的人群中骨关节炎患病率达50%，75岁的人群中高达80%，致残率可高达53%，严重影响患者的健康和生活质量^[3]。目前，骨关节炎的早期治疗多采用非类固醇类抗炎药(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)来缓解病情^[4-5]，虽可缓解部分症状，却无法延缓疾病的进展^[6]。因此，为了寻找有助于病情改善、延缓甚至逆转疾病进展的治疗方法具有重要意义。

针灸在骨关节炎的治疗方面有着明显的优势^[7-8]，其中，火针是较为常见的一种针刺方法，该疗法汇集了毫针激发经气、火气温阳散寒的功效^[9-10]，可以直接刺激病灶的反应点，迅速消除或改善局部组织水肿、充血、渗出、粘连、钙化、挛缩、缺血等病理变化，从而加快循环、促进代谢，使受损组织和神经重新修复，治疗效果明显。曾红文等^[11]研究表明，刺血合火针点刺治疗膝关节骨性关节炎疗效确切，可显著改善患者膝部肿胀及疼痛症状，且经1年后随访未见复发。王立兴等^[12]研究亦表明火针结合电针疗法能有效改善膝关节骨性关节炎患者的膝关节疼痛、肿胀、功能障碍等症状，减轻患者关节僵硬度，改善其关节活动能力，疗效优于单纯电针疗法。多项临床研究均提示火针对骨关节炎具有良好的疗效^[13-14]，具有一定的延缓病变进展的作用。但目前，有关火针对骨关节炎疾病治疗作用机制的实验评价研究尚不多见。

该研究通过高分子固定带固定新西兰兔右膝的方法制造膝关节骨性关节炎模型，并给予火针刺激犊鼻、内膝眼治疗，旨在探讨火针刺激犊鼻、内膝眼治疗骨关节炎的作用效应及具体机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2017年9月至2018年9月在内蒙古医科大学中医学院实验室完成。

1. 3 材料 4月龄新西兰大白兔32只，体质量3.2-3.8 kg，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物质量合格证号：SCXK(沪)2016-0011。所有动物饲养于清洁级环境的动物实验中心，温度为22-24 ℃，12 h昼/12 h夜日常节律，自由饮食、饮水。研究已获得内蒙古医科大学中医学院医院伦理委员会批准开展。

1.4 方法

1.4.1 分组及处理采用随机数字表法将32只实验兔随机分为4组，每组8只。①假手术对照组，仅给予高分子固定带正常力度绑缚；②骨关节炎组：参照文献报道的方法^[15]，使用高分子固定带(南京双威生物技术有限公司)在右膝180°伸展时进行固定；所有兔子需要进行正常的体质量负重，固定4周后，取出胶带并收集股骨样品用于后续实验，模型制作在预实验基础上完成，成功率达到了100%；③西药治疗组：将实验兔按照上述方法建立骨关节炎模型开始后的第7天起，注射玻璃酸钠注射液(上海百加壹医药有限公司生产)，每只动物右后肢膝关节外侧均注射0.3 mL，注射方法为：膝关节轻弯，经髌腱外侧进针，右后肢膝关节腔内注射，注射完毕后消毒并屈伸活动膝关节5次，每隔3 d注射1次，连续注射6次；④火针治疗组：将实验兔按照上述方法建立骨关节炎模型开始后的第7天起进行火针治疗，治疗方法如下：针刺腧穴分别取犊鼻和足三里、内膝眼和阴陵泉、鹤顶和阳陵泉3组穴位，每次1组，穴位选取参照中国针灸学会实验针灸研究会1992年制定的《实用动物穴位定位标准》以及参照相应骨性标志定位。穴区局部消毒后，以左手持乙醇灯，右手将火针在外焰烧针至针体白亮后，运用手腕力量持针迅速垂直刺入，深度为3 mm，每隔3 d治疗1次，连续治疗6次。实验设计经动物保护委员会同意，动物使用和处理遵照美国国立卫生署颁布的《实验动物关护和使用指南》。

1.4.2 样品采集和组织学评估在造模开始后的第4周，采用空气栓塞法处死实验兔，将其固定于固定台上，术野常规脱毛、消毒、铺孔巾切开，在右髌骨上缘2 cm处做一弧形切依次逐层分离皮肤、皮下组织、浅筋膜、肌膜，钝性分离肌肉组织，充分显露关节囊，切开膝关节囊、滑膜及髌骨，清理股骨及胫腓骨周围的软组织，留取股骨外髁软骨组织，放入冰生理盐水中清洗干净后，取一部分于病理组织学的评估，余部分置于EP管中，-80 ℃保存备用。将一部分软骨组织用体积分数4%中性甲醛固定24 h，5%硝酸脱钙4 d，不同浓度梯度的乙醇溶液脱水，二甲苯清除，石蜡包埋和5 μm厚的切片切割。行苏木精-伊红染色，使用光学显微镜(日本Nikon公司)进行Mankin’s评分进行软骨病理评分；观察糖胺聚糖分布用番红O(Safranin-O)染色，并采用国际骨关节炎研究协会OARSI推荐方法进行OARSI评分^[16]，评估软骨的退变情况。

1.4.3 Mankin评分系统评估关节炎的严重程度^[16] 通过Mankin评分法对其关节面的病理标本进行评估，总分为14分，观察项目包括结构及软骨细胞两部分，具体评价标准，见表1。

表1 Mankin’s评分

Table 1 Mankin scoring system

观察项目	分值	观察项目	分值
结构正常	0	软骨细胞正常	0
表面不规则	1	弥漫性血管数量增多	1
表面股规则及血管翳	2	增生性血管簇	2
裂隙深达软骨移行层	3	潮线完整	0
裂隙深达软骨放射层	4	有血管穿越	1
裂隙深达软骨钙化层	5	染色情况	1-4
结构完全破坏	6

实验动物造模过程相关问题：
造模目的：	观察火针刺激犊鼻、内膝眼治疗骨关节炎的作用效应及具体机制。
借鉴已有标准实施动物造模：	参考文献[15]的方法建立骨关节炎模型。
选择动物的条件：	①新西兰大白兔；②4月龄；③体质量3.2-3.8 kg。
模型与所研究疾病的关系：	以运动诱导骨关节炎模型兔观察火针刺激犊鼻、内膝眼穴位对骨关节炎模型兔的治疗作用及其机制。
动物来源及品系：	新西兰大白兔32只购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
造模技术描述：	骨关节炎模型建立：①使用高分子固定带在兔右膝180°伸展时进行固定；②实验兔需要进行正常的体质量负重；③固定4周。
动物数量及分组方法：	32只新西兰大白兔分为4组：假手术对照组n=8，骨关节炎组n=8，西药治疗组n=8，火针治疗组n=8。
造模成功评价指标：	大体及病理形态学观察：骨关节炎兔关节软骨表面粗糙、不光滑，关节软骨变薄、甚至剥脱，关节间隙变窄，关节周围可见骨赘形成。
造模后实验观察指标：	①兔骨关节炎大体及病理形态学观察；②关节面病理学评分；③兔血清基质金属蛋白酶1及金属蛋白酶组织抑制剂1水平；④测定兔股骨组织基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂1及β-catenin的mRNA和蛋白表达。
造模后动物处理：	造模开始的第4周，麻醉后采用空气栓塞法处死兔，取股骨外髁软骨组织。
伦理委员会批准文件：	研究获得内蒙古医科大学中医学院医院伦理委员会批准。

1.4.4 酶联免疫吸附法检测血清基质金属蛋白酶1和金属蛋白酶组织抑制剂1水平通过颈总动脉取血法从上述不同分组实验兔中获得血清样品，采用美国R&D公司生产的基质金属蛋白酶1和金属蛋白酶组织抑制剂1酶联免疫检测试剂盒检测二者的水平，所有步骤按厂商说明书进行处理。

1.4.5 定量PCR检测基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂1及Wnt信号通路关键分子β-catenin的mRNA水平上述不同分组股骨组织的总RNA抽提采用TRIzol试剂。反转录反应采用Promega公司的RT试剂盒进行。PCR反应条件如下：94 ℃，4 min；94 ℃，40 s；52 ℃，40 s； 72 ℃，40 s共40个循环。定量PCR采用Takara公司的SYBR Premix Ex Taq在ABI 7500扩增仪上进行。PCR结果分析采用2^-^??Ct法进行分析。用β-actin作为内参，PCR引物由上海生工生物公司设计和合成，具体序列见表2。

1.4.6 Western-blotting法检测基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂1及Wnt信号通路关键分子β-catenin的蛋白水平上述不同分组股骨组织的蛋白分离后，进行Western-blotting检测。其方法简述如下：组织经液氮研磨后获得蛋白采用SDS-PAGE胶电泳进行分析并转膜至PVDF膜上。将PVDF膜采用5%的脱脂牛奶封闭后，采用anti-基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂1及β-catenin单克隆抗体进行孵育，采用GAPDH单克隆抗体作为内参。蛋白采用化学发光法进行检查。将获得的蛋白条带采用Image J软件进行定量后，分析蛋白水平。

表2 定量PCR引物序列

Table 2 Sequence of primer for qualified PCR

基因名	引物序列	产物长度(bp)
基质金属蛋白酶1	5′-CAG GAG CCT TCC CAA GAG GAA-3′	79
	5′-CTT GTC TCT TGC ATA TCA GGA TGA TG-3′
金属蛋白酶组织抑制剂1	5′-CAA CTG CGG AAC GGG CTC TTG -3′	102
	5′-CGG CAG CGT AGG TCT TGG TGA A-3′
β-catenin	5′-CGT ACG CAC CAT GCA GAA CAC AAA-3′	165
	5′-ATC CAC TGG TGA ACC GAG CAT CTT-3′
β-actin	5′-CCA GCC TTC CTT CTT GGG TAT-3′	102
	5′-TTG GCA TAG AGG TCT TTA CGG-3′

1.5 主要观察指标 ①兔骨关节炎大体及病理形态学观察；②关节面病理学评分；③兔血清基质金属蛋白酶1及金属蛋白酶组织抑制剂1水平；④兔股骨组织基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂1及β-catenin的mRNA和蛋白表达。

1.6 统计学分析所有数据以x(_)±s表示，两组间均数比较采用两独立样本t 检验，同组干预前后均数比较采用配对t检验。组间均数比较采用单因素方差分析。P < 0.05认为差异有显著性意义。所有统计学数据均采用GraphPad Prism 6.0和SPSS 18.0统计学软件分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

骨关节炎是一种慢性关节退行性疾病，其特征在于关节软骨的退化和缺失以及软骨下骨和关节边缘的骨质增生^[17-18]。骨关节炎在膝关节炎中最常见，主要表现为生化和代谢紊乱以及关节软骨结构的损伤^[19-20]。局部结构性软骨损伤结合了滑膜的炎症和关节囊的纤维组织增生，最终导致膝关节疼痛、肿胀和功能障碍，可能导致残疾^[21-22]。与运动相关的骨关节炎主要由于过度磨蚀而发生，并可能导致关节老化和早期关节退化^[23]。此次研究旨在通过建立运动诱导的骨关节炎实验兔模型，研究明确火针刺激犊鼻、内膝眼对兔骨关节炎模型作用效应及具体机制，为临床应用提供分子方面的理论依据。

骨关节炎可归属于中医学的“痹证”范畴^[24]。《素问•痹论》曰“风寒湿三气杂至，合而为痹。”故中医学认为骨关节炎多是在正虚虚弱，卫外不固，导致风寒湿邪气乘虚而入，导致经脉凝滞，气血不畅，日久可损害肝肾，故本病老年体虚、肝肾不足为骨关节炎发病的基础，风寒湿邪留恋、经脉闭阻是其主要的致病因素^[25-26]。火针是临床常用的传统针刺疗法，在操作中通过温热刺激穴位和部位，促进血液循环，鼓舞人体阳气，正气充沛，脏腑强壮，并激发经气，温补经脉，活血行气^[27-28]。此次研究结果显示，火针治疗组和西药治疗组骨关节炎的炎症症状及关节炎病理损伤程度显著轻于骨关节炎组。番红-O染色结果显示，火针治疗组和西药治疗组均能降低骨关节炎兔中细胞外基质的降解。且OARSI评分及软骨结构、细胞应答、糖胺聚糖组分及汇总的Mankin评分均显著低于模型组，提示火针刺激犊鼻、内膝眼可显著改善骨关节炎的关节炎症症状，延缓关节软骨的炎症损伤程度，延缓关节软骨组织的退行性变。

Wnt信号通路调节许多过程，包括生长、发育、疾病、衰老和死亡、细胞形态和功能^[29-30]。研究发现，其与骨骼发育密切相关，参与了软骨组织的细胞分化、生长、凋亡、死亡、骨量调节等病理过程^[31]。研究发现，Wnt信号通路信号转导的异常，可诱发骨骼系统代谢失衡，促进骨关节炎的发生发展^[32-33]。β-catenin是一种多功能蛋白，可调节细胞黏附和信号转导，是Wnt/β-catenin通路中最重要的成分^[34-36]，其可能通过参与基质金属蛋白酶(基质金属蛋白酶3，13)靶基因的转录，来调控细胞增殖、凋亡、炎症和基质代谢等过程。此次实验发现，骨关节炎组骨组织中的β-catenin的基因及蛋白表达水平显著高于假手术对照组，提示Wnt/β-catenin通路可能参与了骨关节炎的发生发展。Zhou等^[37]之前的研究显示在骨关节炎兔模型中β-catenin水平可显著升高，因此认为Wnt/β-联蛋白信号通路在骨关节炎治疗中发挥有用作用，可能成为治疗骨关节炎的潜在靶点，这与此次研究结果类似。此次结果还显示火针治疗组和西药治疗组β-catenin基因及蛋白表达水平显著低于骨关节炎组，提示火针治疗可能通过降低Wnt信号通路关键分子β-catenin的水平来影响骨关节炎的进展。

现在普遍认为，软骨细胞衰老和破坏是异常生物力学因素的最终结果，生化和遗传因素也在这些细胞的正常功能活动中起重要作用。基质金属蛋白酶受到很多关注，因为它们特异性地降解天然胶原蛋白和蛋白多糖。基质金属蛋白酶作为Wnt信号通路的重要下游信号分子，在细胞增殖、凋亡、炎症和基质代谢等过程中发挥重要作用^[38]。骨关节炎患者软骨中基质金属蛋白酶水平升高，金属蛋白酶组织抑制因子1水平降低^[39]。在这些酶中，基质金属蛋白酶1和基质金属蛋白酶13在降解软骨基质的组分，尤其是聚集蛋白聚糖和胶原蛋白中起主要作用。活性溶基质素(基质金属蛋白酶3)也可作为潜在胶原酶的激活剂，消化人关节软骨中的蛋白多糖聚集体^[40]。金属蛋白酶组织抑制剂充当基质金属蛋白酶的抑制剂，在骨关节炎软骨中金属蛋白酶组织抑制剂水平升高，可能反映了对活性蛋白酶活性水平升高的内源性适应性反应^[41]。此次研究中观察到，骨关节炎组骨组织中的基质金属蛋白酶1的基因及蛋白表达水平显著高于假手术对照，金属蛋白酶组织抑制剂1水平显著低于假手术组。提示Wnt信号通路下游分子基质金属蛋白酶1的水平的上调，可能是骨关节炎进展的重要因素。同时，结果还显示火针治疗组和西药治疗组基质金属蛋白酶1及β-catenin的蛋白表达水平显著低于骨关节炎组，金属蛋白酶组织抑制剂1水平显著高于骨关节炎组。提示火针治疗能够通过降低基质金属蛋白酶1，升高金属蛋白酶组织抑制剂1的水平来影响骨关节炎的进展。

结论：研究结果认为，火针刺激犊鼻、内膝眼是治疗膝关节骨性关节炎的一种简便有效方法，可显著延缓骨关节炎的病理损伤状态，其作用机制可能是通过降低血清中异常升高的基质金属蛋白酶1水平，调节基质金属蛋白酶1和金属蛋白酶组织抑制剂1比例关系，调节细胞外基质的降解过程及影响Wnt信号通路，从而减缓软骨退变的进程。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程