骨髓间充质干细胞来源外泌体保护软骨细胞延缓骨关节炎的发生发展

doi:10.12307/2021.137

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (31): 4964-4969.doi: 10.12307/2021.137

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

骨髓间充质干细胞来源外泌体保护软骨细胞延缓骨关节炎的发生发展

凌华军1，王其友2，林伟文1，罗鹏刚1

1佛山市高明区人民医院骨二科，广东省佛山市 528500；2中山大学附属第三医院脊柱外科，广东省广州市 510630

收稿日期:2020-06-22 修回日期:2020-06-30 接受日期:2020-08-11 出版日期:2021-11-08 发布日期:2021-04-25
通讯作者: 王其友，博士，副主任医师，中山大学附属第三医院脊柱外科，广东省广州市 510630
作者简介:凌华军，男，1982年生，广东省吴川市人，汉族，2008年广东医学院毕业，副主任医师，主要从事骨外科学研究。

Bone marrow mesenchymal stem cell derived exosomes delay the occurrence and development of osteoarthritis through cartilage protection

Ling Huajun1, Wang Qiyou2, Lin Weiwen1, Luo Penggang1

Second Department of Orthopedics and Traumatology, The People’s Hospital of Gaoming District, Foshan 528500, Guangdong Province, China; 2Department of Orthopedics and Traumatology, The Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China

Received:2020-06-22 Revised:2020-06-30 Accepted:2020-08-11 Online:2021-11-08 Published:2021-04-25
Contact: Wang Qiyou, MD, Associate chief physician, Department of Orthopedics and Traumatology, The Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
About author:Ling Huajun, Associate chief physician, Second Department of Orthopedics and Traumatology, The People’s Hospital of Gaoming District, Foshan 528500, Guangdong Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

外泌体：是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150 nm)，文中数据显示大鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体呈现典型茶托样形态，粒径小于100 nm，ALIX及HRS蛋白呈阳性表达。
骨关节炎：是一种以关节软骨退行性改变引发无菌性炎症并累及整个关节组织的最常见的关节疾病，最终会发生关节软骨退变、断裂、缺损，甚至整个关节面的损害。文中使用碘乙酸诱导大鼠骨关节炎模型。
背景：骨关节炎是最常见的关节退行性疾病，目前骨髓间充质干细胞已应用于骨关节炎治疗中，但与骨髓间充质干细胞相比，骨髓间充质干细胞来源外泌体移植具有更多优势，例如非免疫原性、非致瘤性以及储存和运输方便。
目的：探索骨髓间充质干细胞来源外泌体对骨关节炎的保护作用。
方法：①提取SD大鼠骨髓间充质干细胞并通过细胞形态及流式细胞学进行鉴定，利用超速离心法提取细胞上清液中的外泌体并通过透射电镜、粒径及western blot进行鉴定；②提取原代乳鼠肋软骨细胞，与荧光标记外泌体共培养12 h，观察软骨细胞吞噬情况。体外通过白细胞介素1β诱导软骨细胞损伤，加入含有50 μg外泌体的PBS溶液100 μL干预24 h，采用免疫荧光检测基质金属蛋白酶13及Ⅱ型胶原纤维α1蛋白表达，评估外泌体对于损伤软骨细胞的保护作用；③体内通过碘乙酸诱导大鼠骨关节炎模型，关节腔内注射外泌体，通过苏木精-伊红染色及番红-固绿染色观察骨关节炎关节结构变化，通过免疫组织化学染色检测基质金属蛋白酶13及Ⅱ型胶原纤维α1蛋白表达，评估外泌体对体内软骨损伤的保护作用。
结果与结论：①原代骨髓间充质干细胞呈现典型的梭形，放射状排列，表达CD73和CD105而几乎不表达CD45、CD34和CD3；透射电镜显示外泌体呈现典型茶托样形态，粒径小于100 nm，ALIX及HRS蛋白呈阳性表达；②软骨细胞内可观察到典型的红染颗粒证实外泌体可以被软骨细胞摄取，同时外泌体可以促进软骨细胞Ⅱ型胶原纤维α1蛋白表达及抑制基质金属蛋白酶13表达，证实外泌体可以减弱白细胞介素1β对软骨细胞的损伤作用；③外泌体可以促进损伤关节软骨形态恢复及Ⅱ型胶原纤维α1表达，抑制基质金属蛋白酶13表达，同样证实外泌体可以缓解碘乙酸对骨关节软骨的破坏作用；④上述结果表明，骨髓间充质干细胞外泌体通过软骨保护机制延缓骨关节炎的发生与发展。
https://orcid.org/0000-0001-8817-5291(王其友)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 外泌体, 骨关节炎, 软骨保护, 软骨细胞, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: Osteoarthritis is the most common joint degenerative disease. At present, bone marrow mesenchymal stem cells have been used in the treatment of osteoarthritis. However, compared with bone marrow mesenchymal stem cells, bone marrow mesenchymal stem cell derived exosome transplantation has more advantages, such as non-immunogenicity, non-tumorigenicity, convenient storage and transportation.
OBJECTIVE: To explore the protective effect of bone marrow mesenchymal stem cell exosomes on osteoarthritis.
METHODS: (1) SD rat bone marrow mesenchymal stem cells were extracted and identified by cell morphology and flow cytometry. Exosomes in the cell supernatant were extracted by ultracentrifugation and identified by transmission electron microscopy, particle size and western blot assay. (2) Primary costal chondrocytes were extracted from suckling rats and cocultured with fluorescently labeled exosomes for 12 hours. The phagocytosis of chondrocytes was observed. In vitro chondrocyte damage was induced by interleukin-1β. PBS (100 μL) containing 50 μg exosomes was added for 24 hours. The expression of matrix metalloproteinase-13 and type II collagen fiber α1 protein was detected by immunofluorescence to evaluate the protective effect of exosomes on injured chondrocytes. (3) The rat model of osteoarthritis was induced by iodoacetic acid in vivo. Exosomes were injected into the joint cavity, and the changes of joint structure of osteoarthritis were observed by hematoxylin-eosin staining and safrane-fast green staining. The expression of matrix metalloproteinase-13 and type II collagen fiber α1 protein was measured by immunohistochemical staining to evaluate the protective effect of exosomes on cartilage in vivo.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The extracted primary cells showed a typical fusiform shape and arranged radially. The extracted cells highly expressed CD73 and CD105, but slightly expressed CD45, CD34 and CD3. Transmission electron microscopy showed that the obtained particles showed a typical saucer-like morphology. The particle size was less than 100 nm. Meanwhile, nanoparticles showed positive expression of ALIX and HRS protein. (2) Typical red-stained particles could be observed in chondrocytes, which confirms that exosomes could be taken up by chondrocytes, and exosomes could promote chondrocyte type II collagen fiber α1 protein expression, but inhibit the expression of matrix metalloproteinase-13, which confirmed that exosomes could attenuate the damage effect of interleukin-1β on chondrocytes. (3) Exosomes could promote the morphological recovery of damaged articular cartilage and the up-regulate type II collagen fiber α1 expression, while inhibited the expression of matrix metalloproteinase-13, which also confirmed that exosomes can alleviate the effects of iodoacetic acid on articular cartilage damage. (4) Above findings results indicate that bone marrow mesenchymal stem cell exosomes delay the occurrence and development of osteoarthritis through a chondroprotective mechanism.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, exosomes, osteoarthritis, cartilage protection, chondrocyte, rat

中图分类号:

凌华军, 王其友, 林伟文, 罗鹏刚. 骨髓间充质干细胞来源外泌体保护软骨细胞延缓骨关节炎的发生发展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(31): 4964-4969.

Ling Huajun, Wang Qiyou, Lin Weiwen, Luo Penggang. Bone marrow mesenchymal stem cell derived exosomes delay the occurrence and development of osteoarthritis through cartilage protection[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(31): 4964-4969.

图/表（结果） 6

2.1 骨髓间充质干细胞形态及鉴定结果显微镜观察细胞形态大多数为梭形，呈放射状排列，见图1A。流式细胞仪检测结果表明，CD73和CD105抗体的阳性率分别为99.2%和83.7%，CD45、CD34和CD3抗体的阳性率分别为0.062%，0.042%及0.060%，与间充质干细胞的标志物表达一致，表明分离提取的细胞为骨髓间充质干细胞，见图1B。

2.2 外泌体鉴定结果透射电镜可以看出提取物呈现出典型的中间有一个凹陷的茶托状囊泡结构，这完全符合外泌体的外形形态，见图2A。粒径分析表明，提取的物质大多数粒径在90-100 nm之间，这与外泌体的粒径一致，见图2B。Western blot检测提取物相对于骨髓间充质干细胞高表达ALIX及HRS表面标志物，见图2C。

2.3 软骨细胞的外泌体吞噬作用将骨髓间充质干细胞来源外泌体添加到软骨细胞培养基中以观察其吞噬作用。如图3所示，软骨细胞胞核被染成蓝色，细胞骨架被染成绿色，外泌体被染成红色，可以看到外泌体位于细胞骨架内细胞核周围，证明大鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体被大鼠软骨细胞吞噬进入细胞质内。

2.4 外泌体减弱了白细胞介素1β对软骨细胞的损伤为了研究骨髓间充质干细胞外泌体是否对软骨细胞外基质功能有影响，使用免疫荧光染色检测软骨细胞外基质水解酶(基质金属蛋白酶13)及合成代谢标记(Ⅱ型胶原纤维α1)的表达。白细胞介素1β处理后软骨细胞中基质金属蛋白酶13的表达较外泌体治疗组明显升高，而Ⅱ型胶原纤维α1的表达较外泌体治疗组明显降低，见图4，差异均有显著性意义(P < 0.05，n=5)。

2.5 骨关节炎关节结构变化 30只SD大鼠随机分为3组，每组10只，均进入结果分析。苏木精-伊红染色显示生理盐水组大鼠关节软骨表面完整性丧失，出现不同程度的纤维化，基质着色不均匀，软骨细胞数量减少，潮线模糊不清，见图5。

2.6 关节组织中Ⅱ型胶原纤维α1和基质金属蛋白酶13的表达外泌体组软骨组织中Ⅱ型胶原纤维α1的表达显著高于生理盐水组(P < 0.05，n=3)，同时基质金属蛋白酶13在生理盐水组软骨组织中显著上调，外泌体组软骨组织中基质金属蛋白酶13的表达显著低于生理盐水组(P < 0.05，n=3)，见图6。

参考文献

[1] 陆文忠,杨现莉,韦喜.外泌体治疗骨关节炎作用机制的研究进展[J].右江民族医学院学报,2019,41(3):342-345,355.
[2] TSUNO H, ARITO M, SUEMATSU N, et al. A proteomic analysis of serum-derived exosomes in rheumatoid arthritis. BMC Rheumatol. 2018;2:35.
[3] WANG R, JIANG W, ZHANG L, et al. Intra-articular delivery of extracellular vesicles secreted by chondrogenic progenitor cells from MRL/MpJ superhealer mice enhances articular cartilage repair in a mouse injury model. Stem Cell Res Ther. 2020;11(1):93.
[4] WANG R, XU B, XU H. TGF-β1 promoted chondrocyte proliferation by regulating Sp1 through MSC-exosomes derived miR-135b. Cell Cycle. 2018;17(24):2756-2765.
[5] 罗欣,余丽梅.外泌体在间充质干细胞治疗骨性关节炎中的作用:新策略与新思路[J].中国组织工程研究,2018,22(1):140-145.
[6] 周晓雯,李鹰扬,刘政,等.外泌体在骨性关节炎发病机制中的研究进展[J].中国骨科临床与基础研究杂志,2018,10(6):361-366.
[7] 王思捷,廖淑珍,招春飞,等.间充质干细胞源外泌体治疗类风湿性关节炎动物模型和临床研究进展[J]. 中国比较医学杂志,2019, 29(3):109-112.
8] 朱海,刘璠.间充质干细胞来源外泌体在骨性关节炎中的应用[J].江苏医药,2017,43(16):1181-1185.
[9] WITHROW J, MURPHY C, LIU Y, et al. Extracellular vesicles in the pathogenesis of rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 2016;18(1):286.
[10] WU J, KUANG L, CHEN C, et al. miR-100-5p-abundant exosomes derived from infrapatellar fat pad MSCs protect articular cartilage and ameliorate gait abnormalities via inhibition of mTOR in osteoarthritis. Biomaterials. 2019;206:87-100.
[11] WU X, WANG Y, XIAO Y, et al. Extracellular vesicles: Potential role in osteoarthritis regenerative medicine. J Orthop Translat. 2019;21:73-80.
[12] 董贵俊,闫前,吴燕,等.间充质干细胞来源外泌体在运动调节骨关节炎中的作用[J].体育科学,2020,40(1):89-97.
[13] ASGHAR S, LITHERLAND GJ, LOCKHART JC, et al. Exosomes in intercellular communication and implications for osteoarthritis. Rheumatology (Oxford). 2020;59(1):57-68.
[14] CARPI S, SCODITTI E, MASSARO M, et al. The Extra-Virgin Olive Oil Polyphenols Oleocanthal and Oleacein Counteract Inflammation-Related Gene and miRNA Expression in Adipocytes by Attenuating NF-κB Activation. Nutrients. 2019;11(12):2855.
[15] CHANG YH, WU KC, HARN HJ, et al. Exosomes and Stem Cells in Degenerative Disease Diagnosis and Therapy. Cell Transplant. 2018; 27(3):349-363.
[16] 李培霆,李龙.类风湿关节炎相关外泌体及其治疗作用的研究进展[J].山东医药,2018,58(45):111-113.
[17] 陈桂婷,董甜甜,余婕,等.外泌体及miRNA与类风湿性关节炎[J].生命的化学,2019,39(5):955-960.
[18] 邓雷弘,龚芸,黄晓林,等.外泌体在类风湿性关节炎发病机制中的研究进展[J].中国医学科学院学报,2019,41(4):556-561.
[19] COSENZA S, RUIZ M, MAUMUS M, et al. Pathogenic or Therapeutic Extracellular Vesicles in Rheumatic Diseases: Role of Mesenchymal Stem Cell-Derived Vesicles. Int J Mol Sci. 2017;18(4):889.
[20] COSENZA S, RUIZ M, TOUPET K, et al. Mesenchymal stem cells derived exosomes and microparticles protect cartilage and bone from degradation in osteoarthritis. Sci Rep. 2017;7(1):16214.
[21] D’ARRIGO D, ROFFI A, CUCCHIARINI M, et al. Secretome and Extracellular Vesicles as New Biological Therapies for Knee Osteoarthritis: A Systematic Review. J Clin Med. 2019;8(11):1867.
[22] DILSIZ N. Role of exosomes and exosomal microRNAs in cancer. Future Sci OA. 2020;6(4):FSO465.
[23] REZA-ZALDIVAR EE, HERNÁNDEZ-SAPIÉNS MA, GUTIÉRREZ-MERCADO YK, et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes promote neurogenesis and cognitive function recovery in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neural Regen Res. 2019;14(9):1626-1634.
[24] 苏永蔚,周山健,肖大伟,等.负载miRNA-27b的BMSCs来源的外泌体治疗实验性骨关节炎[J].中国矫形外科杂志,2019,27(8):726-734.
[25] ZHANG R, MA J, HAN J, et al. Mesenchymal stem cell related therapies for cartilage lesions and osteoarthritis. Am J Transl Res. 2019;11(10):6275-6289.
[26] ZHAO Y, XU J. Synovial fluid-derived exosomal lncRNA PCGEM1 as biomarker for the different stages of osteoarthritis. Int Orthop. 2018; 42(12):2865-2872.
[27] 高坤,朱文秀,曹亚飞.类风湿关节炎和骨关节炎发病及治疗中的外泌体[J].中国组织工程研究,2018,22(36):5858-5864.
[28] XIE F, LIU YL, CHEN XY, et al. Role of MicroRNA, LncRNA, and Exosomes in the Progression of Osteoarthritis: A Review of Recent Literature. Orthop Surg. 2020;12(3):708-716.

引言

骨关节炎是最常见的关节退行性疾病[1]，其特征是进行性关节软骨退化、软骨下骨增厚、骨赘形成、滑膜炎症和韧带钙化[1-4]。骨关节炎有多种病因，包括关节损伤、衰老、肥胖和遗传。骨关节炎的发病机制仍知之甚少，但软骨细胞损伤被认为起着重要的作用。骨关节炎早期非手术治疗包括教育、运动、体质量管理、药物和注射治疗，主要使用的药物包括止痛药和非类固醇抗炎药[5]。但是，这些治疗是对症治疗而非治愈性治疗，仅能减轻疼痛和控制症状。大多数患者随着病情的加重最终需要手术干预，手术干预虽然可以减轻疼痛和逆转关节畸形，但其费用高昂，同时也可能会引起术后相关并发症[2]。因此寻求创伤小并且疗效佳的治疗手段成为目前临床治疗骨关节炎的迫切问题。
骨髓间充质干细胞具有多系分化潜能，已应用于治疗骨关节炎。动物研究表明，骨髓间充质干细胞关节腔内注射对骨关节炎具有良好的治疗效果[6-7]。目前越来越多的研究发现骨髓间充质干细胞的治疗效果主要归因于其旁分泌机制，具有抗炎和软骨保护作用。骨髓间充质干细胞产生大量的外泌体在细胞间通讯中起着重要的作用。此外，与骨髓间充质干细胞治疗相比，骨髓间充质干细胞来源外泌体移植具有更多优势，例如非免疫原性、非致瘤性以及储存和运输方便[8-11]，因此，骨髓间充质干细胞来源外泌体可能是骨关节炎治疗的良好选择[12-15]。
然而目前使用骨髓间充质干细胞外泌体通过软骨保护作用治疗骨关节炎的研究较少，该研究分离获得大鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体，通过关节腔注射到骨关节炎大鼠膝关节内，评估骨髓间充质干细胞来源外泌体治疗大鼠骨关节炎的效果，为后期的临床应用提供理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2019年1至11月在中山大学附属第三医院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 4周龄雌性SD大鼠2只，体质量100 g左右，用于分离提取骨髓间充质干细胞；1周龄雌性SD大鼠2只，体质量20 g左右，用于分离提取软骨细胞；6-8周龄雌性SD大鼠30只，体质量200-250 g，用于制备骨关节炎模型。所有大鼠购买于广东省实验动物中心。
1.3.2 实验试剂和仪器 PKH26荧光染料(Sigma)；培养基、胎牛血清(Gibco)；鬼笔环肽染液 (Beyotime)；Ⅱ型胶原纤维α1抗体、基质金属蛋白酶13抗体(Abcam)；荧光二抗(Invitrogen)；CD73抗体、CD105抗体、CD45抗体、CD34抗体、CD3抗体(eBioscience)；ALIX抗体、HRS抗体(CST)；蛋白二抗(ZSGB Bio)；共聚焦显微镜(Zeiss)；切片机(Leica)；qNano®粒径检测系统(Izon Science)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离与鉴定在无菌条件下将4周龄SD大鼠股骨及胫骨取出后，使用骨髓腔冲洗法提取骨髓，然后进行密度梯度离心，去除杂质细胞，提高骨髓间充质干细胞纯度，将提取获得的骨髓间充质干细胞培养于含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中，在37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱培养。在光镜下进行形态学观察以及流式细胞技术检测骨髓间充质干细胞表面抗体，包括阳性抗体：CD73、CD105(1∶1 000稀释)，阴性抗体：CD45、CD34、CD3(1∶1 000稀释)，验证骨髓间充质干细胞提取是否成功。

1.4.2 骨髓间充质干细胞来源外泌体的分离和鉴定镜下观察第4代骨髓间充质干细胞生长密度达到80%时，更换无外泌体培养基后继续培养48 h，收集培养基以300×g离心10 min，2 000×g离心10 min及10 000×g离心30 min以去除死细胞及细胞碎片；最后将上清液置于超速离心机内以100 000×g离心90 min，弃去上清，并用少量PBS洗涤重悬沉淀获得外泌体悬液。使用透射电子显微镜观察外泌体的形态及超微结构，使用qNano®系统检测外泌体的粒径大小，使用Western blot检测表面标志分子ALIX(1∶1 000稀释)及HRS(1∶1 000稀释)的表达。
1.4.3 Western blot检测ALIX和HRS的表达收集骨髓间充质干细胞及骨髓间充质干细胞来源外泌体，使用含有RIPA裂解液在冰上裂解1 h，12 000×g离心30 min，从上清液中收集组织裂解物，使用BCA蛋白质检测试剂盒测定蛋白浓度后，将蛋白上样缓冲液(5×)加入样品中，并将样品在100 ℃加热10 min以使蛋白变性。将等量(40 μg)蛋白悬液加入聚丙烯酰胺凝胶上样，通过凝胶电泳分离蛋白质并转移到PVDF膜上，PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗ALIX(1∶1 000稀释)及HRS(1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶缀合的二抗(1∶2 000稀释)温育2 h，使用增强化学发光试剂盒分析荧光，并使用ImageJ软件计算每个条带的吸光度值。
1.4.4 大鼠软骨细胞提取取出1周龄SD大鼠肋骨，剪碎后使用0.1%Ⅱ型胶原酶消化分离出大鼠软骨细胞。将所得细胞用含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素的DMEM/F12培养基培养，放入37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱，每3 d更换1次培养基。
1.4.5 大鼠软骨细胞摄取外泌体实验使用红色荧光染料(PKH26)标记骨髓间充质干细胞来源外泌体。当大鼠软骨细胞以1×104在激光共聚焦皿中培养12 h后，加入荧光标记的外泌体(10 mg/L)，在37 ℃下与大鼠软骨细胞共培养12 h，然后将细胞用PBS清洗3次，使用40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤3次，使用鬼笔环肽染液染色1 h，再使用DAPI染液进行细胞核染色，使用荧光显微镜观察软骨细胞内的外泌体红色信号。
1.4.6 软骨细胞体外损伤模型及实验分组制备骨关节炎样软骨细胞体外模型，主要将含有白细胞介素1β(10 μg/L)的培养基加入软骨细胞中培养24 h，诱导软骨细胞损伤。通过免疫荧光染色观察软骨细胞内Ⅱ型胶原纤维α1及基质金属蛋白酶13蛋白表达，判断软骨损伤诱导是否成功。将诱导损伤的软骨细胞分为PBS组及外泌体治疗组，将损伤的细胞以1×105接种于12孔板中，PBS组加入PBS溶液100 μL，外泌体治疗组加入含有50 μg外泌体的PBS溶液100 μL，放入37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱干预24 h，采用免疫荧光染色观察软骨细胞内Ⅱ型胶原纤维α1及基质金属蛋白酶13表达。每组重复实验次数为5次。
1.4.7 细胞免疫荧光染色检测软骨细胞内Ⅱ型胶原纤维α1及基质金属蛋白酶13蛋白表达待检测的细胞使用40 g/L多聚甲醛在4 ℃下固定20 min，用体积分数为5%山羊血清和0.2%Triton X-100制备的破膜液室温下封闭破膜1 h，加入Ⅱ型胶原纤维α1一抗(1∶1 000稀释)及基质金属蛋白酶13一抗(1∶1 000稀释)4℃孵育过夜，第2天加入相应荧光二抗(1∶1 000稀释)染色1 h，最后用DAPI细胞核染色液染色5 min，使用共聚焦显微镜检测相应蛋白的位置及表达量。
1.4.8 大鼠骨关节炎模型制作及外泌体注射将30只6-8周龄SD大鼠随机将大鼠分为假手术组(n=10)、生理盐水组(n=10)及外泌体组(n=10)，后两组进行骨关节炎造模，使用6%戊巴比妥钠腹腔麻醉，剔除大鼠关节处毛发，碘酊消毒1次，体积分数为75%乙醇脱碘2次，为了保证大鼠手术后具备正常运动功能，手术均在左膝的髌骨下韧带进行单次关节穿刺，注射碘乙酸钠(2 mg溶于50 μL无菌盐水中)。待大鼠复苏后放入笼中，保持室内温度在25-27 ℃并让大鼠可以自由获得充足的水及食物。造模后生理盐水组大鼠关节腔注射100 μL生理盐水，外泌体组大鼠关节腔注射含有100 μg外泌体的等量生理盐水溶液，假手术组实施关节腔穿刺但不做任何处理，每周注射1次，直至第6周取材。
1.4.9 苏木精-伊红染色及番红-固绿染色取大鼠关节组织放于40 g/L多聚甲醛中固定3 d，之后放入脱钙液中脱钙2周，每3 d更换1次脱钙液，将脱钙好的关节组织石蜡包埋后切片，切片厚度为10 μm，将切片脱蜡、水化后放入苏木精水溶液中染色5 min，流水冲洗1 h后入蒸馏水片刻，加入体积分数为70%和90%乙醇中梯度脱水各10 min，再加入乙醇伊红染色液染色3 min，脱水后封固获得苏木精-伊红染色切片。将切片脱蜡、水化后用铁苏木素液染色10 min后流水冲洗10 min，加入快绿液染色5 min，再用1%醋酸液快速漂洗15 s，加入0.1%番红O染色5 min，脱水后封固获得番红-固绿染色切片。
1.4.10 免疫组织化学检测关节组织中Ⅱ型胶原纤维α1和基质金属蛋白酶13的表达将脱蜡的切片浸泡在EDTA(pH 9.0)中，以便通过微波方法进行抗原回收。将切片放置在体积分数为3%的过氧化氢溶液中，并在室温下避光孵育25 min，然后在室温下用3%BSA封闭30 min，加入Ⅱ型胶原纤维α1一抗(1∶500稀释)及基质金属蛋白酶13一抗(1∶500稀释)4 ℃孵育过夜，第2天加入相应荧光二抗(1∶ 1 000稀释)染色1 h，PBS洗涤后添加3，3'二氨基联苯胺-过氧化物酶底物和苏木精溶液，镜下观察阳性细胞面积，每组重复测量3次。
1.5 主要观察指标 ①免疫荧光染色检测外泌体干预后软骨细胞中基质金属蛋白酶13及Ⅱ型胶原纤维α1的表达；②关节腔注射外泌体后损伤关节软骨的形态；③免疫组织化学检测关节腔注射外泌体后关节软骨组织中Ⅱ型胶原纤维α1和基质金属蛋白酶13的表达。
1.6 统计学分析使用SPSS 20.0软件进行统计学处理。两组间比较进行t 检验统计学分析，多组间比较进行单因素方差分析(ANOVA)以及Bonferroni统计学分析，P < 0.05为差异有显著性意义。使用GraphPad构图，所有数据用x±s表示。

讨论

实验结果表明，在碘乙酸诱导的大鼠骨关节炎模型中，关节内注射骨髓间充质干细胞来源外泌体显著阻碍了关节软骨的破坏。免疫组织化学检测结果显示，骨髓间充质干细胞来源外泌体可以增加软骨基质中Ⅱ型胶原纤维α1(主要软骨基质成分)的表达，并降低基质金属蛋白酶13的表达。
众所周知，骨髓间充质干细胞的旁分泌功能可介导间充质干细胞对多种疾病发挥有益治疗作用，其旁分泌物质包括多种细胞因子、外泌体和核酸[16-18]。研究表明，骨髓间充质干细胞来源外泌体在多种疾病中具有治疗作用[19-23]。此次研究旨在证实骨髓间充质干细胞来源外泌体是否可以同样保护软骨细胞缓解骨关节炎的发生与发展[8，24]。体外研究证实外泌体可以减缓白细胞介素1β对软骨细胞的损伤作用，外泌体治疗可以显著降低基质金属蛋白酶13的表达。基质金属蛋白酶广泛存在于结缔组织中，被认为是人体组织生理重建和病理破坏的重要调控系统之一。研究证实，基质金属蛋白酶13是最重要的水解酶，具有很强的激活各种基质金属蛋白酶前体的能力，以降解软骨和骨骼的细胞外基质。外泌体抑制基质金属蛋白酶13的表达对于软骨保护具有重要意义[25-26]。骨髓间充质干细胞来源外泌体可以通过抑制基质金属蛋白酶13表达，促进Ⅱ型胶原纤维α1表达，进而起到软骨保护的作用。
尽管这项研究表明骨髓间充质干细胞外泌体在阻止骨关节炎进展中起着重要作用，但结果仍然存在一些局限性，在动物实验中只设置了1个时间点和1个剂量，在以后实验中应增加更多的干预时间点以探讨骨关节炎疾病是否存在治疗窗口，对临床治疗更具有指导意义。此外，需要优化外泌体的有效剂量。迄今为止，外泌体中的活性成分尚不清楚。由于外泌体中包含脂质、DNA、mRNA、miRNA、LncRNA甚至各种蛋白质，它们在不同疾病模型中可能通过免疫调节、生物功能或生化功能发挥治疗作用[27-28]。因此，它们对骨关节炎治疗作用的潜在机制需要进一步详细研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

[1]	李永杰, 付申宇, 夏渊, 张达宽, 刘洪举. 膝骨关节炎女性伸膝肌力、步态时空参数与峰值膝关节屈曲/内收力矩关系[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1354-1358.
[2]	齐浩东, 鲁超, 徐韩博, 王孟飞, 郝阳泉. 糖尿病对初次全膝关节置换围术期失血量和疼痛的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1383-1387.
[3]	陈凯佳, 刘景云, 曹宁, 孙建波, 周燕, 梅建国, 任强. 组织工程技术在股骨头坏死治疗中的应用及前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1450-1456.
[4]	白晨, 杨文骞, 孟志超, 王宇泽. 损伤前交叉韧带修复及促进移植物愈合的策略[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1457-1463.
[5]	黄夏荣, 胡莉芝, 孙光华, 彭昕珂, 廖瑛, 廖源, 刘静, 尹林伟, 钟培瑞, 彭婷, 周君, 屈萌艰. 电针干预老年膝骨关节炎大鼠关节软骨及软骨下骨P53、P21的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1174-1179.
[6]	岳云, 王佩佩, 袁兆鹤, 何生存, 贾戌生, 刘倩, 李占涛, 付慧玲, 宋斐, 贾孟辉. 巴豆霜干预脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区JNK/p38 MAPK及神经元凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1186-1192.
[7]	赵嘎日达, 任逸众, 韩长旭, 孔令跃, 贾岩波. 蒙药额尔敦-乌日勒修复骨关节炎大鼠模型的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1193-1199.
[8]	阮蓉, 娄旭佳, 金其贯, 章立冰, 徐尚, 胡玉龙. 白藜芦醇可调控运动性疲劳大鼠的糖异生[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1229-1234.
[9]	李蕊, 张桂红, 王涛, 樊萍. 人参多糖干预创伤性骨关节炎模型大鼠前列腺素E2/6-酮-前列腺素F1α的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1235-1240.
[10]	王姗姗, 舒晴, 田峻. 物理因子促进干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1083-1090.
[11]	潘小龙, 樊飞燕, 应春苗, 刘飞祥, 张运克. 中药抑制间充质干细胞衰老的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1091-1098.
[12]	徐灿丽, 何文星, 汪磊, 吴芳婷, 王佳慧, 段雪琳, 赵铁建, 赵斌, 郑洋. 肝脏类器官研究的文献计量学分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1099-1104.
[13]	刘瀚峰, 王晶晶, 余云生. 人造外泌体治疗心肌梗死：应用现状及前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1118-1123.
[14]	马树微, 何生, 韩冰, 张缭云. 间充质干细胞来源外泌体治疗动物急性肝衰竭的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1137-1142.
[15]	孙宇康, 宋丽娟, 温春丽, 丁智斌, 田昊, 马东, 马存根, 翟晓艳. 基于Web of Science近十年干细胞治疗心肌梗死的可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1143-1148.

骨髓间充质干细胞来源外泌体保护软骨细胞延缓骨关节炎的发生发展

Bone marrow mesenchymal stem cell derived exosomes delay the occurrence and development of osteoarthritis through cartilage protection

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价