ITRAQ技术筛选系统性红斑狼疮合并股骨头坏死的血清差异蛋白质组学变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0583

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (3): 476-481.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0583

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ITRAQ技术筛选系统性红斑狼疮合并股骨头坏死的血清差异蛋白质组学变化

范思奇1，曾平2，周怡3，秦刚2，廖小波2，何凯毅2

(1广西中医药大学研究生学院，广西壮族自治区南宁市 530299；2广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023；3广西医科大学医学科学实验中心，广西壮族自治区南宁市 530021)

收稿日期:2018-07-01 出版日期:2019-01-28 发布日期:2021-04-28
通讯作者: 曾平，教授，主任医师，广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023
作者简介:范思奇，男，1993年生，江西省丰城市人，汉族，广西中医药大学在读硕士，医师，主要从事中医药防治股骨头坏死的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81360551)，项目负责人：曾平；国家中医药管理局项目(JDZX2015272)，项目负责人：曾平

Screening differentially expressed proteins in the serum of patients with systemic lupus erythematosus combined with osteonecrosis of the femoral head by iTRAQ technology

Fan Siqi1, Zeng Ping2, Zhou Yi3, Qin Gang2, Liao Xiaobo2, He Kaiyi2

(1Postgraduate College of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530299, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3Medical Scientific Research Center of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China)

Received:2018-07-01 Online:2019-01-28 Published:2021-04-28
Contact: Zeng Ping, Professor, Chief physician, the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Fan Siqi, Master candidate, Physician, Postgraduate College of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530299, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360551 (to ZP); the Project of State Administration of Traditional Chinese Medicine of China, No. JDZX2015272 (to ZP)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
iTRAQ 技术：采用4种或8种同位素编码的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，而后进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。
蛋白质组：本质是研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机制的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，为疾病的早期诊断提供分子标志。

摘要
背景：系统性红斑狼疮合并股骨头坏死是由于长期大剂量应用皮质类固醇糖皮质激素造成股骨头活性成分死亡的病理过程，但其早期诊治缺乏特异的生物标志物。
目的：应用同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ)筛选系统性红斑狼疮合并激素性股骨头坏死的血清标志物。
方法：分别收集系统性红斑狼疮合并激素性股骨头坏死患者血清8例(实验组)、系统性红斑狼疮使用激素后无股骨头坏死的患者血清(对照组)10例，采用iTRAQ联合二维液相色谱-串联质谱技术(2D-LC-MS/MS)对差异蛋白质进行筛选与鉴定。
结果与结论：①共鉴定出10种差异蛋白质，与对照组相比有统计学差异，其中实验组中铜篮蛋白、免疫球蛋白IgG、免疫球蛋白κ链、补体C2等4种蛋白表达上调；内皮细胞蛋白C受体、人源性激肽释放酶结合蛋白、色素上皮衍生因子、四连接素、胰岛素样生长因子2、甲状腺素运载蛋白等6种蛋白表达下调；②KEGG 通路分析提示以上 10个蛋白与Wnt信号通路、补体与凝血级联反应、系统性红斑狼疮这3条信号通路密切相关；③结果说明，通过蛋白质组学技术成功得到了可靠的激素性股骨头坏死血清差异蛋白质，为激素性股骨头坏死的诊断及其发病机制提供了理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-0229-6055(范思奇)

关键词: 系统性红斑狼疮, 激素性股骨头坏死, 蛋白质组学, iTRAQ技术, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Systemic lupus erythematosus (SLE) combined with osteonecrosis of the femoral head (ONFH) is a result of long-term application of steroids that induces death of active ingredients in femoral head. But there is a lack of specific biomarker for early diagnosis.
OBJECTIVE: To screen the systemic markers of SLE with steroid-induced ONFH using isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) technology.
METHODS: Serum of eight patients with SLE and steroid-induced ONFH was collected and used as the experimental group, and serum of 10 patients with SLE but without steroid-induced ONFH served as the control group. The differentially expressed proteins were screened and identified by iTRAQ technique and two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry.
RESULTS AND CONCLUSION: Totally 10 kinds of differentially expressed proteins were identified. There was significant difference between two groups. In the experimental group, the expression levels of copper basket protein, immunoglobulin IgG, immunoglobulin κ chain and complement C2 were significantly up-regulated. The expression levels of endothelial cell protein C receptor, human kallikrein-binding protein, pigment epithelium-derived factor, tetracycline, insulin-like growth factor 2, and thyroxine carrier protein were down-regulated. KEEG pathway analysis indicated that 10 kinds of proteins were closely related to Wnt signaling pathway, coagulation and complement cascades reaction signaling pathway and SLE signaling pathway. In summary, the differentially expressed proteins are obtained successfully in steroid-induced ONFH by proteomics, which provides theoretical basis for the diagnosis and pathogenesis of steroid-induced ONFH.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Lupus Erythematosus, Systemic, Femoral Head Necrosis, Proteomics, Tissue Engineering

中图分类号:

R446

范思奇, 曾平, 周怡, 秦刚, 廖小波, 何凯毅. ITRAQ技术筛选系统性红斑狼疮合并股骨头坏死的血清差异蛋白质组学变化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(3): 476-481.

Fan Siqi, Zeng Ping, Zhou Yi, Qin Gang, Liao Xiaobo, He Kaiyi. Screening differentially expressed proteins in the serum of patients with systemic lupus erythematosus combined with osteonecrosis of the femoral head by iTRAQ technology[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(3): 476-481.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

1.1 设计病例-对照。

1.2 时间及地点实验于2014年5月至2016年8月在广西中医药大学第一附属医院完成。

1.3 对象

1.3.1 一般资料选取同期广西中医药大学第一附属医院初次确诊为系统性红斑狼疮合并激素性股骨头坏死的住院患者，国际骨循环学会分期Ⅱ期6例、Ⅲ期2例。另择10例该院同期使用糖皮质激素后无股骨头坏死的体检志愿者纳入对照组，性别均为女性，平均年龄(43.00±8.15)岁。原发病均为系统性红斑狼疮。

1.3.2 诊断标准股骨头坏死诊断参照《股骨头坏死诊断与治疗的专家建议》^[7]。

1.3.3 纳入标准 ①年龄18-60岁；②激素性股骨头坏死患者符合激素性股骨头坏死诊断标准；③激素的使用符合以下条件：据杨述华^[8]《骨坏死学》连续使用；时间不少于6周；3个月内总量不少于2 000 mg强的松(折合后)。

1.3.4 排除标准 ①非典型的MRI影像，不符合激素性股骨头坏死诊断标准；②符合激素性股骨头坏死的诊断标准但不符合系统性红斑狼疮的诊断标准；③创伤性或酒精性股骨头坏死；④未经患者本人同意；⑤由于其他原因不宜资料收集者。

1.4 材料 iTRAQ试剂盒、TMT试剂盒、Urea试剂盒，DTT试剂，IAM试剂，Bradford kit试剂盒，Trypsin试剂盒，核酸纯化柱(Strata X Spin Column)，四乙基溴化铵(TEAB)，TMT蛋白质标记试剂盒，羟胺50%水溶液(50% Hydroxylamine)。C18脱盐柱、真空浓缩仪；超声清洗仪由Eppendorf公司提供；高效液相色谱、高PHC18 RP柱由Waters公司供应；NanoLC 1000的纳升级高效液相、上样柱、组合式质谱仪、分析柱均由Thermo公司提供。

1.5 实验方法

1.5.1 血清样品的采集与保存清晨空腹采集血清，4 ℃放置1.0-2.0 h，使血液凝固析出血清，3 000×g离心 10 min，收集上清液分装后，-80 ℃保存备用。

1.5.2 蛋白提取按照ProteoExtracr^TM试剂盒操作说明书去除血清中的高丰度蛋白，向去除高丰度蛋白后的上清液中加入3倍体积预冷的10%TCA/丙酮，或5倍体积以上-20 ℃沉淀3 h，离心后晾干蛋白沉淀块，加入适量 Resolution Buffer(8 mol/L Urea，100 mmol/L TEAB，pH 8.0)复溶血清蛋白，见图1。

1.5.3 蛋白浓度测定采用Bradford法对提取出的蛋白进行浓度测定。

1.5.4 蛋白酶解分别取50 μg样品，8 mol/L Urea buffer调整等体积。加入终浓度10 mmol/L DTT于37 ℃孵育 45 min，再加入终浓度25 mmol/L IAM室温避光孵育 55 min，用100 mmol/L TEAB稀释至Urea浓度低于2 mol/L后进行酶解。根据质量比1∶50 加入trypsine，37 ℃酶解过夜，再次按质量比1∶100加入trypsine，37 ℃二次酶解 4 h。

1.5.5 肽段标记 Strata X C18(phenomenex)对酶解后的蛋白样品进行脱盐处理，按照TMT Kit Protocol对肽段进行标记。简单描述如下：将除盐后的肽段溶于适量 100 mmol/L TEAB，41 μL乙腈复溶0.8 mg TMT试剂并与100 μg 肽段合并后室温反应1 h，加入羟胺终止标记反应，合并各组样品后真空干燥。

1.5.6 肽段组分分离 HPLC组分分离肽段分别将3组标记肽段使用Waters HPLC e2695/2998色谱仪，用高pH C18 RP色谱柱(Bridge Peptide BEH C18，130A 3.5 um 4.6*250 mm，Waters)进行馏分分离。待收集的肽段流出组分后，真空抽干后再进行合并成3个组分质谱鉴定。

1.5.7 肽段质谱鉴定分别将3个组分溶于20 μL nanoLC A 液，进样2 μL，经上样柱上样后通过分析柱梯度洗脱进入Orbitrap Elite组合式质谱仪鉴定。

1.5.8 质谱数据搜库使用Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Scientific)软件将Orbitrap Elite对肽段鉴定的原始图谱文件(.raw 文件)转化为.mgf 文件，将其提交 MASCOT2.3.0服务器与Homo Sapiens(9606)Swiss-Prot数据库进行检索。然后通过 MASCOT 服务器上形成的搜库文件，根据FDR< 0.01的标准对数据进行筛选，获得高度可信的定性结果。

1.6 主要观察指标 ①质谱鉴定结果；②差异蛋白KEGG 通路注释聚类分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

系统性红斑狼疮是一种多发于青年女性的累及多脏器的自身免疫性炎症性结缔组织病，因长期需糖皮质激素治疗，系统性红斑狼疮并发激素性股骨头坏死的概率并不小，一旦患上这将对患者的生活带来严重不便。激素性股骨头坏死的初期临床症状并不明显，患者就诊时往往错失最佳的早期治疗阶段，因此找到激素性股骨头坏死的早期生物标志物以助诊断显得尤为必要，这对疾病的预防、诊断、预后都具有重要作用。目前，iTRAQ联合2D-LC-MS/MS技术在寻找生物标志物上有着独特的优势，并广泛应用于常见疾病差异表达蛋白质的鉴定^[9-10]。该研究采用iTRAQ技术联合2D-LC-MS/MS筛选系统性红斑狼疮患者激素性股骨头坏死组与使用激素无股骨头坏死组的差异蛋白，成功鉴别出多种系统性红斑狼疮合并激素性股骨头坏死的特异性血清蛋白标志物。

该研究应用iTRAQ联合2D-LC-MS/MS技术筛选出激素性股骨头坏死组与使用激素无股骨头坏死组之间具有显著性差异的蛋白10个，通过KEGG通路注释进一步提取到与5个差异蛋白相关的7条KEGG信号/代谢通路。显著性差异蛋白主要集中在Wnt信号通路、补体与凝血级联反应、系统性红斑狼疮这3条信号通路上，说明骨代谢、血液凝溶系统及免疫系统与激素性股骨头坏死的发病机制密切相关。

3.1 血液凝溶系统的蛋白表达与激素性股骨头坏死发病机制相关血管内凝血被认为是激素性股骨头坏死的重要发病因素之一^[11-12]。蛋白C(protein C，PC)系统与肝素-抗凝血酶II组成了人体的天然抗凝系统，在血液凝固与抗凝过程中起着重要的作用^[13]。血管内皮细胞蛋白C受体(endothelial protein C receptor，EPCR)是蛋白C系统的重要组成成分之一，主要由大血管内皮细胞表达，它可以与PC/APC特异性结合，极大提高蛋白C的活化率，从而调节凝血反应，是机体抗凝的重要组成部分^[14]。实验中，作者发现激素性股骨头坏死组与使用激素无股骨头坏死组比较，激素性股骨头坏死组中内皮细胞蛋白C受体表达显著下调，这表明激素性股骨头坏死患者中血液普遍呈高凝状态，且内皮细胞蛋白C受体显著富集至补体和凝血级联信号通路中。基此，推测内皮细胞蛋白C受体可能是激素性股骨头坏死特异性蛋白标志物。

人源性激肽释放酶结合蛋白(Kallistatin，Kal) 是一种急性时相反应蛋白，具有抗炎、抗血管生成及抗氧化应激等作用^[15]。国内外研究证实了血管内皮细胞损伤可使局部血液处于高凝状态，进而形成微血栓，使股骨头局部血流减低，血管阻力增高，最终导致股骨头坏死^[16]。研究表明人源性激肽释放酶结合蛋白与多种内皮相关性生理和病理过程密切相关，人源性激肽释放酶结合蛋白可抑制肿瘤坏死因子α引起的内皮细胞活化，抑制内皮细胞损伤和凋亡^[17]。目前还未有研究报道其与激素性股骨头坏死的发病机制有关。该研究结果显示激素性股骨头坏死组与使用激素无股骨头坏死组相比较，激素性股骨头坏死组中人源性激肽释放酶结合蛋白表达下调，提示激素性股骨头坏死患者存在凝血系统及氧化应激水平的改变。由此推测，人源性激肽释放酶结合蛋白可能是激素性股骨头坏死的特异性蛋白物标志，但其在激素性股骨头坏死的作用机制仍需进一步研究阐明。

铜篮蛋白(CP)是血清中一种蓝色含铜并具有氧化酶活性的α2-球蛋白，起着运输铜、氧化铁、诱导血管形成、促进细胞生长等作用^[18]。还未有文献报道其与激素性股骨头坏死的发病机制有关。该研究结果显示：激素性股骨头坏死组与使用激素无股骨头坏死组比较，激素性股骨头坏死组患者表现铜篮蛋白表达显著上调(P < 0.05)，提示激素性股骨头坏死患者股骨头的坏死塌陷及随后出现的修复反应中，血管的生成可能处于一种活跃状态。股骨头的修复与坏死是同时存在且交织进行，因此课题组推测铜篮蛋白可能在股骨头坏死的修复反应中发挥着诱导新血管形成的作用。实验中发现铜篮蛋白显著富集在卟啉和叶绿素代谢这条信号通路，与激素性股骨头坏死的发病机制并不相关，因此作者并不认为铜篮蛋白可能是激素性股骨头坏死的特异性蛋白物标志。

3.2 骨髓基质干细胞脂肪分化与激素性股骨头坏死发病机制相关骨髓基质干细胞可多向分化为成骨细胞、血管内皮细胞和脂肪细胞等^[19-20]。据报道糖皮质激素可以通过抑制骨髓基质干细胞的增殖分化能力，甚至直接诱导骨髓基质干细胞分化为脂肪细胞从而引起骨坏死^[21]。色素上皮衍生因子(pigment epithelium - derived factor，PEDF) 是一种重要的血管生长因子，在细胞生长、增殖分化和调节脂质代谢中起着重要作用^[22]。该研究发现色素上皮衍生因子显著富集于wnt经典信号通路，且有文章报道色素上皮衍生因子可以通过AKT和ERK/MAPK信号通路，提高钙沉积水平来促进人的骨髓基质干细胞向成骨细胞分化^[23]。孙少松等^[24]发现，色素上皮衍生因子能有效地扭转因大量使用糖皮质激素而导致成骨细胞分化为脂肪细胞的这一现象，以此起到保护细胞功能的作用。目前色素上皮衍生因子在相关激素性股骨头坏死差异蛋白的文章中还未报道。该研究结果显示激素性股骨头坏死组与使用激素无股骨头坏死组相比较，激素性股骨头坏死组中色素上皮衍生因子表达下降，提示激素性股骨头坏死患者存在骨代谢水平的改变，其成骨细胞数量明显减少。因此课题组认为色素上皮衍生因子可能是激素性股骨头坏死的特异性蛋白物标志。

3.3 细胞凋亡及骨代谢与激素性股骨头坏死发病机制相关骨细胞和成骨细胞的凋亡与激素性股骨头坏死的发病有着紧密的关联。大量研究表明，糖皮质激素可诱导成骨细胞凋亡，使骨形成、骨重建和修复不充分，未能及时修复微损伤，最终导致股骨头坏死和塌陷^[25]。胰岛素样生长因子是一类具有促细胞分化和增殖活性的多肽，主要包括胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子2 ^[26]。胰岛素样生长因子2与胰岛素样生长因子1受体有高度亲和力，胰岛素样生长因子2可通过胰岛素样生长因子1受体途径激活MAPK途径和PI3K/Akt途径，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡^[27-28]。赵玉岩等^[29]发现在骨关节炎软骨细胞中胰岛素样生长因子2的表达水平低下，推测骨关节软骨的退变过程可能与胰岛素样生长因子2基因有关。该研究结果显示相比于使用激素无股骨头坏死组，激素性股骨头坏死组中胰岛素样生长因子2表达下降，符合激素性股骨头坏死患者成骨细胞水平低下的病理表现，因此课题组认为胰岛素样生长因子2可能是激素性股骨头坏死的特异性蛋白物标志。

四连接素是凝集素c型的家族成员。至今为止，四连接素的生理功能和作用机制仍不清楚。研究表明，四连接素可能在骨组织重塑和骨矿化阶段起着重要作用，并与骨折愈合密切相关^[30]。茹德文等^[31]发现剔除小鼠的四连接素基因后，小鼠脊柱发育畸形，股骨及腰椎的发育特点在组织学上表现为骨小梁稀疏、稀疏、紊乱等特征，骨小梁细胞减少，成骨细胞减少，这与股骨头塌陷的早期病理症状基本一致，也表明四连接素在组织结构改造过程中起重要作用。目前四连接素蛋白在激素性股骨头坏死的相关文章中尚未报道。该研究结果显示激素性股骨头坏死组与使用激素无股骨头坏死组相比较，激素性股骨头坏死组中四连接素表达下降，由此推测四连接素可能是激素性股骨头坏死的特异性蛋白物标志。

3.4 免疫系统的蛋白表达与激素性股骨头坏死发病机制相关补体系统的激活能防止免疫复合物损伤，但是补体活化的直接作用和对免疫细胞功能的影响也可加重疾病的病理损害^[32]。补体C2是补体第一前端反应补体C3转化酶的酶原部分，而补体C3转化酶的形成是补体激活途径的关键步骤，所以补体的激活与补体C2有着密切关联^[33]。免疫球蛋白轻链κ在机体免疫应答调节过度表达时其血清中的含量水平将会增加。据目前研究报道，系统性红斑狼疮患者和骨关节炎患者中的轻链水平均比正常人高^[34]，但未见有激素性股骨头坏死方面的报道。免疫球蛋白IgG在大部分免疫性功能疾病中其含量往往随着病情的加重而加重。该实验激素性股骨头坏死组中补体C2的水平上调，这可能由于补体C3消耗较大，对补体C2的需求增大所导致的。而免疫球蛋白IgG、免疫球蛋白轻链κ的上调提示系统性红斑狼疮合并激素性股骨头坏死患者体内免疫系统紊乱，加重了疾病的病理损害，因系统性红斑狼疮本就存在免疫异常，故并不认为他们是激素性股骨头坏死的特异性蛋白物标志。

甲状腺素运载蛋白(TTR)是一种负极性反应蛋白，主要由肝脏、大脑脉络膜和胰岛A、B细胞合成分泌入血和调节的一种球状蛋白，在体内承担着运输甲状腺素和三碘甲状腺氨酸的使命。甲状腺素运载蛋白可输送含淀粉样成分的营养物质到股骨头的炎性部位满足急性阶段中性粒细胞、单核-巨噬细胞吞噬病毒以及各种代谢产物的需要，从而发挥保护肺、肝脏、骨髓等器官的作用^[35]。蒋洪彦等^[36]发现严重急性呼吸综合征(SARS)康复后并发激素性股骨头坏死的患者中甲状腺素运载蛋白低表达；该研究发现与使用激素无股骨头坏死组相比较，激素性股骨头坏死组甲状腺素运载蛋白表达下调，这与蒋洪彦得出的结果一致，基于此课题组推测甲状腺素运载蛋白可能是激素性股骨头坏死的特异性蛋白物标志。

综上所述，该研究应用iTRAQ联合2D-LC-MS/MS寻找到内皮细胞蛋白C受体、人源性激肽释放酶结合蛋白、色素上皮衍生因子、铜篮蛋白、甲状腺素运载蛋白、四连接素、胰岛素样生长因子2、补体C2等与激素性股骨头坏死相关的差异表达蛋白质，涉及到与激素性股骨头坏死发病机制有关的骨髓基质干细胞脂肪分化、血液凝溶系统、免疫系统、细胞凋亡及骨代谢系统。上述差异蛋白可能是激素性股骨头坏死的特异血清标志物，其结果仍需进一步的表达验证，但这无疑为初步呈现了激素性股骨头坏死早期多种潜在蛋白的变化趋势，更好的揭示了激素性股骨头坏死发病机制，其早期诊断的生物标志物的发现，也为临床辩识早期激素性股骨头坏死提供可供参考的客观依据。然而，该研究并未把系统性红斑狼疮合并激素性股骨头坏死患者的具体病理分期结合起来，未能更细腻的揭示早、中、晚期激素性股骨头坏死相关差异蛋白的表达水平。这也将是该研究的未来发展方向，以期为激素性股骨头坏死的发病机制做出进一步的贡献。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ITRAQ技术筛选系统性红斑狼疮合并股骨头坏死的血清差异蛋白质组学变化

Screening differentially expressed proteins in the serum of patients with systemic lupus erythematosus combined with osteonecrosis of the femoral head by iTRAQ technology

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