氧化应激对人源牙髓干细胞的影响：组织修复应用中的关键问题

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0531

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (17): 2755-2760.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0531

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氧化应激对人源牙髓干细胞的影响：组织修复应用中的关键问题

陈君婷，张静莹

大连大学医学院，辽宁省大连市 116622

修回日期:2018-02-23 出版日期:2018-06-18 发布日期:2018-06-18
通讯作者: 张静莹，博士后，副教授，大连大学医学院，辽宁省大连市 116622
作者简介:陈君婷，女，1992年生，山东省烟台市人，汉族，大连大学在读硕士，主要从事骨组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年基金(81500890)；辽宁省自然科学基金项目(20170540028)

Impact of oxidative stress on dental pulp stem cells: a key issue in tissue repair

Chen Jun-ting, Zhang Jing-ying

Medical School of Dalian University, Dalian 116622, Liaoning Province, China

Revised:2018-02-23 Online:2018-06-18 Published:2018-06-18
Contact: Zhang Jing-ying, M.D., Associate professor, Medical School of Dalian University, Dalian 116622, Liaoning Province, China
About author:Chen Jun-ting, Master candidate, Medical School of Dalian University, Dalian 116622, Liaoning Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81500890; the Natural Science Foundation of Liaoning Province, No. 20170540028

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
氧化应激：是由美国衰老研究工作者Sohal提出，是指机体遭受刺激时，体内氧化与抗氧化系统失衡，活性氧增多或代谢障碍，诱发基因突变、蛋白质变性和脂质过氧化，进而损伤细胞溶酶体、线粒体等，导致机体的生理生化及代谢功能障碍。
衰老：机体的生长发育达到成熟期以后，随着时间的增长，其形态、结构、生理功能逐渐发生退行性变化，如皮肤皱缩、骨质疏松、老年痴呆等。

摘要
背景：氧化应激病理状态下牙种植成功率较低是当前种植手术亟待解决的问题之一。人源牙髓干细胞具有高度繁殖、自我更新及多向分化潜能，应用于组织工程修复组织缺损已取得一定的成绩，但是随着对氧化应激研究的深入，如何消除氧化应激对人源牙髓干细胞在组织工程中应用的不利影响为当务之急。
目的：综述近年来人源牙髓干细胞在组织工程中的应用及氧化应激对人源牙髓干细胞的影响。
方法：以“牙髓干细胞；氧化应激”为中文检索词，以“dental pulp stem cells；oxidative stress”为英文检索词，应用计算机在CNKI数据库和 PubMed数据库检索 2001年1月至2017年12月的相关文章，将所有文章进行初步筛选后，对最终纳入的50篇文献进一步分析、归纳与总结。
结果与结论：①人源牙髓干细胞具有高度增殖、自我更新能力和多向分化潜能；②人源牙髓干细胞的免疫调节功能是通过副分泌机制的可溶性因子和细胞因子，通过抑制T淋巴细胞和调节性T细胞上调导致免疫耐受；③氧化应激作为一种影响细胞存活的重要因素，阻碍细胞增殖和分化，其过程涉及多种信号转导途径；④人源牙髓干细胞应用于组织工程及再生医学中修复组织缺损的研究尚处于起步阶段，其调控机制存在着诸多问题，未来研究有必要进一步确定人源牙髓干细胞的氧化应激机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0003-4700-1142(张静莹)

关键词: 牙髓干细胞, 氧化应激, 分化潜能, 免疫调节, 组织修复, 组织缺损, 衰老, 综述, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The low success rate of dental implants under oxidative stress is one of the problems that needs to be resolved urgently. Human dental pulp stem cells (HDPSCs) have a high potential for multiplication, self-renewal and multidirectional differentiation. HDPSCs have achieved some success in tissue engineering for repairing tissue defects. However, with the in-depth research on oxidative stress, eliminating the adverse effect of oxidative stress on HDPSCs used in tissue engineering becomes urgent.
OBJECTIVE: To review the application progress of HDPSCs in tissue engineering in recent years and to summarize the effects of oxidative stress on HDPSCs.
METHODS: Using “dental pulp stem cells; oxidative stress” as the Chinese and English search terms, we retrieved CNKI and PubMed databases for relevant articles published from January 2001 to December 2017, respectively. After initial screening, 50 eligible articles were further detailed, analyzed and summarized.
RESULTS AND CONCLUSION: HDPSCs have the potential of multiplication, self-renewal and multidirectional differentiation. Immunoregulatory mechanism of HDPSCs is achieved through sub-secreting soluble factors and cytokines and inhibiting the upregulation of T lymphocytes and regulatory T cells, which leads to immune tolerance. Oxidative stress as an important factor affecting cell survival impedes cell proliferation and differentiation via a variety of signal transduction pathways. Current studies on the application of HDPSCs in tissue engineering and regenerative medicine for tissue defect repair are still in its infancy, and there are many problems concerning its regulatory mechanism. Further determination of the oxidative stress mechanism of HDPSCs is warranted.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Dental Pulp, Stem Cells, Oxidative Stress, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈君婷，张静莹. 氧化应激对人源牙髓干细胞的影响：组织修复应用中的关键问题[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(17): 2755-2760.

Chen Jun-ting, Zhang Jing-ying. Impact of oxidative stress on dental pulp stem cells: a key issue in tissue repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(17): 2755-2760.

图/表（结果） 2

2.1 纳入文献基本情况 纳入文献中的中文文献共19 篇，英文文献共31篇。文献检索流程图见图1。

2.2 人源牙髓干细胞

2.2.1 人源牙髓干细胞的提出 Gronthos等^[8]采用酶消化法在人第三磨牙牙髓组织中分离出一些与骨髓基质干细胞相似的细胞，经诱导可形成分散且高密度的钙化小结，第一次提出了人源牙髓干细胞的概念。人源牙髓干细胞是从牙髓组织中分离出的一种成体干细胞，作为理想的组织工程种子细胞，其具有高度繁殖、多向分化潜能和自我更新能力，对组织工程及再生医学的发展具有重要作用。

2.2.2 人源牙髓干细胞的分子标记 研究发现，在起源组织(颌突上皮和外胚间充质)的微血管周围存在人源牙髓干细胞。Shi等^[9]利用间充质干细胞基质细胞抗原能结合牙髓组织血管周细胞抗原的特性来标记人源牙髓干细胞，结果显示10%-20%的STRO-1阳性人源牙髓干细胞被分离出来。

2.2.3 人源牙髓干细胞的生物学特性 高度增殖、自我更新能力和多向分化潜能，是其重要的生物学特性。利用酶消化法分离第三磨牙的牙髓，经鉴定证实为人源牙髓干细胞，且能维持其生物学特性至少25代，随后分别用不同诱导介质在不同的诱导条件下诱导人源牙髓干细胞，发现其具有多向分化的潜能^[10]：有研究发现人源牙髓干细胞在进行体外培养时，可以诱导分化成神经元样细胞和神经胶质细胞，出现神经特异质蛋白标志巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白等^[11]；李景辉等^[12]从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙中提取牙髓组织，酶消化法体外分离培养，单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得人源牙髓干细胞，当培养至第3代时，用成脂诱导培养基诱导，油红O染色结果显示为阳性，RT-PCR检测成脂肪向分化相关基因均有阳性表达，证明了人源牙髓干细胞在体外具有成脂细胞分化的潜能。后续有研究报道人恒牙的人源牙髓干细胞在特定诱导条件下的成骨分化潜力^[13-14]。Tamaoki等^[15]利用病毒载体把c-Myc、Klf4、Oct4、Sox2 和Lin28、Nanog、Oct4、Sox2 因子导入人源牙髓干细胞中，成功获得了多潜能性干细胞。

2.2.4 人源牙髓干细胞体外培养 何飞等^[16]通过酶消化法获取第三磨牙来源的人源牙髓干细胞，体外培养计算细胞克隆形成率、免疫组化、RT-PCR法检测细胞表面分子表达，流式细胞仪测定细胞周期，体外诱导检测细胞多向分化能力。结果发现，细胞体积较小，多为成纤维样细胞；免疫组化及RT-PCR法显示细胞有Vimentin、Ⅰ型胶原、GFAP、Nestin和Osteocalcin表达，ALP化学染色阳性，无MyoD和DSPP表达；流式细胞仪检测大多数细胞处于静止期。

2.2.5 人源牙髓干细胞的免疫调节作用 人源牙髓干细胞的免疫调节功能是通过副分泌机制的可溶性因子和细胞因子，通过抑制T淋巴细胞和调节性T细胞上调导致免疫耐受。Zhao等^[17]发现Fas配体可以调控人源牙髓干细胞的免疫耐受。人源牙髓干细胞中存在Fas配体，当Fas配体敲除后，能降低诱导T细胞凋亡的能力。这表明Fas配体可以调控人源牙髓干细胞的免疫能力。

2.2.6 人源牙髓干细胞的研究意义 人源牙髓干细胞具有以下优点^[18]：①来源丰富，易采集。6-11岁的小孩自然脱落的牙齿、正畸减数拔牙、以及成人需要拔除的智齿中都含有丰富的人源牙髓干细胞；②不良反应少，具有免疫抗炎作用，可用于异体移植研究。免疫原性低，无须经过严格配对，不会引起强烈的排斥反应，具有一定的免疫调节功能；③一定条件下可诱导分化成釉质和牙本质；④可以体外分离扩增；⑤无伦理争议。人源牙髓干细胞在口腔应用方面，作为种子细胞它可以用于再生牙根、骨、牙周软硬组织，可广泛应用于牙周病治疗、牙周再生、颌骨再生、牙齿再生、口腔颌面部放射性骨坏死，双膦酸盐造成的颌骨坏死等疾病，甚至使牙齿再生成为指日可待的新希望。另外，随着越来越多的深入研究发现，乳牙人源牙髓干细胞在治疗阿尔茨海默病、帕金森病、急性炎症、糖尿病等动物实验模型中发挥显著作用^[19]。

2.3 人源牙髓干细胞在组织工程中的应用

2.3.1 人源牙髓干细胞修复骨缺损 在培养人源牙髓干细胞过程中加入含有地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的成骨诱导液，在其诱导作用下人源牙髓干细胞可向成骨细胞方向分化，且能表达成骨标志物。Ito等^[20]将富含血小板的血浆与人源牙髓干细胞的混合物植入犬上颌骨缺损中，8周后植入种植体，然后再培养8周，结果发现种植体周围不仅有骨组织形成，而且提高了种植体与周围骨组织的结合能力。有学者将新西兰兔随机分为实验组和对照组，分别在下颌无牙区制造10 mm×4 mm×4 mm的骨缺损，空白组加入浸有PBS的Bio-oss骨粉，实验组加入人源牙髓干细胞和Bio-oss骨粉，术后6周处死。实验发现，空白组纤维结缔组织较疏松，苏木精-伊红染色未见明显新骨形成，而实验组骨缺损区愈合良好，可见新生骨形成，并且与周围骨结合良好^[21]。从而证实了人源牙髓干细胞具有较好的成骨能力。

2.3.2 人源牙髓干细胞在再生牙组织工程中的应用Iohara等^[22]将犬牙中获得的牙髓侧群细胞自体移植入活髓切断模型中，14 d内可形成含毛细血管和神经细胞的完整牙髓。因此将人源牙髓干细胞与可降解支架材料复合，形成牙本质-牙髓复合体修复受损牙髓，成为组织工程修复受损组织器官一种安全有效的治疗手段。

2.3.3 人源牙髓干细胞成肌肉分化 研究显示，人源牙髓干细胞可表达典型的成肌细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白^[23]。另外，注射人源牙髓干细胞到心肌梗死动物模型内能有效恢复部分心肌功能，减小心肌梗死面积，这提示对人源牙髓干细胞的深入研究可有助于心肌梗死类疾病的治疗。

2.3.4 人源牙髓干细胞成神经元分化 多种实验研究结果表明人源牙髓干细胞具有向神经元细胞分化的潜能。王亦菁等^[24]通过实验研究，在一定的神经诱导条件下，人源牙髓干细胞采用一定的神经元标志物鉴定发现NSE染色阳性，表明人源牙髓干细胞有向神经元分化的潜能。有学者将分离获得的人源牙髓干细胞经诱导后用于治疗中风的大鼠，发现能够帮助中风后的受损组织恢复功能。孔杰等^[26]发现骨髓间充质干细胞对大鼠神经损伤有治疗效应，能上调组织抗氧化能力，促进神经因子分泌，并调节抗氧化物酶活性保护受损神经，减少大鼠缺血性神经元凋亡，从而产生治疗效应。以上实验研究均表明人源牙髓干细胞能修复神经系统损伤组织，为治疗神经系统疾病提供新方法。

2.4 氧化应激

2.4.1 氧化应激的提出及损伤机制 伴随着生物体逐渐衰老，机体抗氧化能力不断下降，导致自由基不断积累，机体在有害刺激因素作用下，氧自由基产生过多或发生代谢障碍，细胞体内氧化及抗氧化体系失衡，诱发基因突变、蛋白质变性和脂质过氧化，进而损伤细胞溶酶体、线粒体等，导致细胞的生理生化及代谢功能障碍。

2.4.2 氧化应激反应与疾病的关系 有资料表明心血管系统疾病如原发性高血压、动脉粥样硬化以及糖尿病患者的发病机制均与氧化应激有关；氧化应激产物激活某些信号通路促进炎性递质释放，与肺部炎症有明确相关性；氧化应激时黄嘌呤氧化酶激活，患者产生的自由基损伤脑细胞，对神经元造成损伤；糖尿病患者普遍存在氧化应激反应增强，与其并发症的发生和发展关系密切^[27]。

2.4.3 氧化应激导致的全身性疾病对口腔牙种植成功率的影响 随着口腔种植技术的推广应用，患有糖尿病、牙周病等患者的种植需求越来越多，但是种植牙在该类疾病中应用的成功率相对较低。牙种植术在健康个体中常规应用有较高的成功率，达95%-99%，但是在糖尿病患者中应用的成功率仅为85.5%-94.3%^[28]。种植牙在糖尿病患者中的高失败率和较低骨结合率已经得到较多的实验及临床证实^[29-30]。

2.5 目前氧化应激对人源牙髓干细胞影响的研究进展

2.5.1 不同浓度过氧化氢诱导人源牙髓干细胞氧化应激损伤 双氧水是一种重要的活性氧，能自由弥散且稳定，可以导致不同形式的氧化改变，触发细胞死亡^[31-32]。徐克等^[33]将人源牙髓干细胞分为3组：分别用PBS，100 μmol/L H₂O₂、200 μmol/L H₂O₂分别刺激2 h，倒置显微镜观察细胞形态，MTT、β-半乳糖苷酶染色观察细胞增殖及衰老程度，免疫荧光检测细胞骨架排列情况和sirt1蛋白表达，测定P16、sirtⅠ蛋白表达。结果显示H₂O₂能有效诱导人源牙髓干细胞氧化应激损伤，细胞形态由成纤维细胞样梭形外观，体积变大、扁平、失去纺锤样结构。同时引起人源牙髓干细胞增殖能力降低，细胞骨架排列紊乱，细胞衰老增强，在此过程中，激活p16、p53等衰老信号通路的活化，P16表达上调，Sirt1蛋白的表达受到抑制，细胞周期停滞。

2.5.2 氧化应激增强抗氧化防御基因上调 Alami等^[34]研究表明环境氧气张力(体积分数21%O₂)通常用于体外培养，但体内生理水平范围在3%-6%之间。通过比较21%对3%氧气张力下人源牙髓干细胞的增殖，发现由于氧化应激增强细胞周期调节蛋白P21、P38激活、NRF-2信号通路抗氧化防御基因上调。

2.5.3 人源牙髓干细胞在抗衰老和组织工程领域的潜在应用 人源牙髓干细胞因具有多向分化能力在组织中具有潜在的应用价值，但是在长期的细胞培养和氧化应激过程中，人源牙髓干细胞的组织再生潜力受到长期的负面调节。为了减少人源牙髓干细胞的细胞衰老和氧化应激，超氧化物歧化酶1的细胞内递送系统发展起来。Jung等^[35]将超氧化物歧化酶1与称为低分子量细胞穿透肽结合，发现，氧自由基对干细胞影响的主要问题是减少其分化和自我更新潜力。H₂O₂导致的早衰细胞中p53激活和p21表达可能是由于H₂O₂导致的DNA氧化损伤。P53是衰老机体的重要标志分子，在细胞衰老和凋亡中起重要作用^[36]。另外，还有研究表明p53/p21途径与p16/pRb途径共同诱导早熟性衰老，p53不仅可以上调促凋亡因子，还能下调抗凋亡因子^[37-38]。

2.5.4 龋牙髓干细胞具有更高的抗氧化蛋白表达 Ma等^[39]通过使用2-D DIGE鉴定人源牙髓干细胞和龋牙髓干细胞差异表达的蛋白质研究结果表明，在4-7的pH值范围内，人源牙髓干细胞和龋牙髓干细胞之间有18个蛋白点差异表达。这些不同表达的蛋白质主要参与调节细胞增殖、分化、细胞骨架和运动。此外，研究结果表明，龋牙髓干细胞具有更高的抗氧化蛋白表达，可以保护龋牙髓干细胞免受氧化应激。此研究对理解人源牙髓干细胞在牙本质-牙髓复合物形成中的分子矿化机制有重大意义。

2.5.5 氧化应激对干细胞重编程的影响 氧化应激、低氧、热处理等均可能引发细胞的重编程过程，使已分化的干细胞去分化和重编程，提供了组织工程种子细胞应用的新途径^[40]。当机体发生氧化应激反应时，细胞将从已分化状态变为未分化状态，重新开始细胞周期。Ondre等^[41]研究发现氧化应激状态时细胞的去分化和重编程过程与氧自由基失衡的时间及各自的量有关。未来针对氧化应激等微环境的改变对细胞重编程的影响机制的研究将为今后诱导多能干细胞提供理论依据。

2.5.6 多种信号转导途径参与了氧化应激骨髓间充质干细胞的衰老及凋亡 研究表明，AKT、p53、p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶等信号分子均参与了氧自由基聚集导致的氧化应激状态下基质干细胞的衰老和凋亡。AKT信号途径磷酸化能激活抗凋亡蛋白，使凋亡因子失活，同时还能增加p38β的活性来降低ROS水平，抑制凋亡分子JNK，是细胞应激状态下存活的重要信号途径^[42]。p38MAPK途径可以通过细胞色素C的释放和Bax的转移诱导基质干细胞的凋亡^[43]。APE/REF-1酶是一种可以修复氧化性损伤的限速酶，能阻碍氧自由基聚集对机体的损伤，氧自由基聚集可以诱导其表达。研究显示mTOR及其下游蛋白在没有干预措施时活性较低，参与正常情况下的细胞增殖分化，当施加低浓度氧化应激干预措施时，mTOR及其下游蛋白表达增高；高浓度的氧化应激干预措施会使mTOR信号通路活性受到明显抑制^[44]。胡明等^[45]研究发现过表达miR- 486-5p能促进氧化应激状态下细胞的凋亡，而抑制其抑制物作用时可以抑制氧化应激状态下细胞的凋亡，其作用机制可能与Akt通路有关。这提示氧化应激导致的细胞凋亡是多种信号通路共同参与的结果，要综合分析才能认清氧化应激对牙髓干细胞影响的作用机制(表1)。

2.6 白藜芦醇促进氧化应激状态下细胞的增殖和黏附 研究发现，通过对骨髓间充质干细胞进行预处理可以减少氧化应激对干细胞的损伤，这对进一步探索氧化应激对人源牙髓干细胞的损伤机制有重要意义^[46]。研究表明，抗氧化剂白藜芦醇可通过 ERK 途径提高骨髓间充质干细胞的增殖能力并诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，且应用ERK特异性抑制剂PD98059后，抗氧化剂的作用明显被抑制^[47]。郭英等^[48]通过研究实验检测白藜芦醇对H₂O₂诱导的氧化应激状态下人源牙髓干细胞在钛种植体表面的增殖及成骨分化情况，发现白藜芦醇能够促进细胞在钛片表面的增殖、黏附及成骨分化。其机制可能是白藜芦醇促进线粒体损伤的修复，抑制P53信号通路，逆转氧化应激损伤^[49]。研究表明，SIRT1基因是动脉粥样硬化患者内皮细胞氧化应激的关键基因，而白藜芦醇是内皮细胞衰老状态下的潜在保护者，白藜芦醇可以通过提高内皮细胞SIRT1基因表达阻止活性氧导致的损伤^[50]。

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引言

人源牙髓干细胞具有高度繁殖、自我更新及多向分化潜能，在组织工程修复组织缺损中的应用已取得一定成果，如心肌梗死、肢体缺血、急性肾衰竭以及肝脏移植等^[1-2]。但仍有许多缺陷，如移植后损伤区域细胞成活率低、移植后短时间出现细胞凋亡和坏死等^[3]。高血糖导致的活性氧生产过剩会对各种蛋白质、脂质膜、DNA以及正常细胞生理功能造成破坏，过量的活性氧通过增加线粒体外膜渗透性，诱导促凋亡因子漏出，使细胞凋亡，造成人源牙髓干细胞在糖尿病骨缺损患者中的应用受到限制^[4]。研究发现人源牙髓干细胞的分化能力与其所处的环境密切相关，例如糖尿病患者中糖代谢异常也会抑制人源牙髓干细胞的成骨分化，引起牙槽骨缺损以及牙的丢失^[5]。通过对人源牙髓干细胞的氧化应激影响机制的研究，有助于为组织工程的发展提供可能的细胞来源，进而指导临床提高人源牙髓干细胞进行组织器官修复的成功率。

人源牙髓干细胞是一种新型的干细胞，具有比骨髓间充质干细胞更强的增殖及分化能力^[6]。作为一种成体干细胞，人源牙髓干细胞具有来源广泛、可塑性强、排斥反应少、不涉及到伦理问题等优点，应用前景广阔^[7]。故深入研究人源牙髓干细胞的氧化应激机制，将为今后其应用于临床预防和修复氧化应激疾病导致的组织器官损伤提供理论指导。文章就氧化应激对人源牙髓干细胞影响的研究进展进行分析、归纳和总结，并对其临床应用前景进行讨论。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

氧化应激对人源牙髓干细胞的影响：组织修复应用中的关键问题

Impact of oxidative stress on dental pulp stem cells: a key issue in tissue repair

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