载药肿瘤细胞外泌体联合放疗对乳腺癌肿瘤干细胞增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0502

摘要/Abstract

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文题释义：
外泌体：是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150 nm)，现今其特指直径40-100 nm的盘状囊泡。在正常及病理状态下，很多细胞均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，其内含有大量功能蛋白质、mRNA及microRNA，是细胞间进行物质交换、信息交流的重要载体，在腹水、乳汁、外周血及尿液中可检测到。
肿瘤外泌体对肿瘤细胞增殖与转移的作用：目前的研究显示，肿瘤外泌体也参与细胞间的信息交流，其内基因发生突变，然后通过膜融合将突变信息传给正常细胞，激活原癌基因，促进肿瘤细胞的生长与转移；肿瘤外泌体表面表达转化生长因子β，其与周围纤维细胞膜表面受体结合后，降解肿瘤基质细胞，促进肿瘤细胞的转移。但是近年来研究发现，载药肿瘤细胞外泌体与相应起源的肿瘤细胞具有较高的亲和性，与其他细胞的结合力较低，因而成为一种高效的靶向药物载体。

摘要
背景：近年来研究发现，载药肿瘤细胞外泌体与相应起源的肿瘤细胞具有较高的亲和性，与其他细胞的结合力较低，因而成为一种高效的靶向药物载体。
目的：观察载药肿瘤细胞外泌体联合放疗对乳腺癌肿瘤干细胞增殖的影响。
方法：采用超速离心法从人乳腺导管癌细胞ZR-75-30中分离肿瘤细胞外泌体，并用其包裹甲氨蝶呤，制备载药肿瘤细胞外泌体。采用流式细胞技术从人乳腺导管癌细胞ZR-75-30中分离CD133⁺乳腺癌肿瘤干细胞，分5组培养：空白组常规培养，肿瘤细胞外泌体组加入含载药肿瘤细胞外泌体的RPMI 1640培养基，低、中、高剂量放疗组加入含载药肿瘤细胞外泌体的RPMI 1640培养基培养24 h，然后分别接受2，4，6 Gy的X射线照射1次；培养7 d后，倒置显微镜下观察肿瘤球形成数量及肿瘤球体积，Western Blot 检测Nanog、Sox-2、Oct-4的表达。
结果与结论：①与空白组比较，肿瘤细胞外泌体组肿瘤球数量、体积明显减少(P < 0.05)；与肿瘤细胞外泌体组比较，低、中、高剂量放疗组肿瘤球数量、体积明显减少(P < 0.05)，且随放疗剂量增高，减少幅度增大；②与空白组比较，肿瘤细胞外泌体组Nanog、Sox-2、Oct-4表达降低(P < 0.05)；与肿瘤细胞外泌体组比较，低、中、高剂量放疗组Nanog、Sox-2、Oct-4表达降低(P < 0.05)，且随放疗剂量增高，减少幅度增大；③结果表明，载药肿瘤细胞外泌体协同放疗发挥抑制CD133⁺乳腺癌肿瘤干细胞的增殖活性，且呈放疗剂量依懒性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-6708-5617(罗琼)

关键词: 乳腺癌, 肿瘤干细胞, 细胞外泌体, 放疗, 细胞增殖, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, studies have found that drug-loaded tumor exosomes have a high affinity with tumor cells from corresponding origins, but have a low binding force to other cells, thus becoming an efficient targeted drug carrier.
OBJECTIVE: To observe the effect of drug-loaded tumor exosomes combined with radiotherapy on the proliferation of breast cancer stem cells.
METHODS: Tumor exosomes were isolated from ZR-75-30 human breast ductal carcinoma cells by ultracentrifugation and used to wrap methotrexate and prepare drug-loaded tumor exosomes. CD133⁺ ZR-75-30 was isolated from human breast cancer cells in breast cancer stem cells by flow cytometry. The CD133⁺ cells were cultured in routine medium as blank control group, in RPMI 1640 medium containing drug-loaded tumor exosomes for 24 hours as exosome group, and in RPMI 1640 medium containing drug-loaded tumor exosomes for 24 hours followed by 2, 4, 6 Gy X-ray irradiation as low-, middle- and high-dose groups. After 7 days of culture, tumor spheres formed under inverted microscope, and sphere number and volume were recorded. Expression of Nanog, Sox-2, and Oct-4 was detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank control group, the tumor exosome group had significantly decreased number and size of tumor spheres (P < 0.05); compared with the tumor exosome group, low-, middle- and high-dose radiotherapy groups had significantly decreased number and size of tumor spheres (P < 0.05), and the reduction was increased with the increasing of radiation dose. Compared with the blank control group, lower expression of Nanog, Sox-2, and Oct-4 was found in the tumor exosome group (P < 0.05); compared with the tumor exosome group, there was also a significant reduction in the expression of Nanog Sox-2, Oct-4 in the three radiotherapy groups (P < 0.05), and the reduction was increased with the increasing of radiation dose. To conclude, the combined use of radiotherapy and drug-loaded tumor exosomes inhibits the proliferation activity of CD133⁺ breast cancer stem cells in a radiation dose-dependent manner.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Breast Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, Exosomes, Radiotherapy, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

罗琼，高国香，覃世运. 载药肿瘤细胞外泌体联合放疗对乳腺癌肿瘤干细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(21): 3286-3291.

Luo Qiong, Gao Guo-xiang, Qin Shi-yun. Drug-loaded tumor exosomes combined with radiotherapy inhibit the proliferation of breast cancer stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(21): 3286-3291.

图/表（结果） 1

2.1 乳腺癌肿瘤干细胞的分离与鉴定 利用流式细胞仪成功收集到CD133⁺和CD133^-细胞，分选前后CD133阳性表达率分别为(5.20±1.68)%和(86.36±1.64)%(图1)。

2.2 CCK-8增殖实验检测CD133⁺细胞增殖能力 CCK-8检测结果显示，两组细胞吸光度值随着培养时间的延长逐渐升高，CD133⁺细胞培养3，5，7 d的吸光度值明显高于CD133^-细胞(P < 0.05)，见图2，说明CD133⁺细胞具有更强的增殖能力。

2.3 Transwell小室检测CD133⁺细胞侵袭能力 Transwell小室实验结果显示，CD133⁺细胞的侵袭能力明显高于CD133^-细胞(P < 0.05)，见图3，说明CD133⁺细胞具有更强的侵袭能力。

2.4 CCK-8检测筛选最佳肿瘤细胞外泌体稀释倍数 培养72 h后CCK-8检测发现，CD133⁺肿瘤干细胞增殖活性受到不同程度的影响，随着稀释比例的增加，细胞存活率逐渐降低，当载药肿瘤细胞外泌体稀释比例>1︰1 000时，细胞存活率下降明显(图4)，因此实验选择稀释倍数1 000进行后续实验。

2.5 CD133⁺乳腺癌肿瘤干细胞肿瘤球形成实验结果

2.5.1 肿瘤球数量 与空白组比较，肿瘤细胞外泌体组肿瘤球数量明显减少(P < 0.05)；与肿瘤细胞外泌体组比较，低、中、高剂量放疗组肿瘤球数量明显减少(P < 0.05)；与低剂量放疗组比较，中、高剂量放疗组肿瘤球数量明显减少(P < 0.05)；与中剂量放疗组比较，高剂量放疗组肿瘤球数量明显减少(P < 0.05)，见表1。

2.5.2 肿瘤球体积 与空白组比较，肿瘤细胞外泌体组肿瘤球体积明显减小(P < 0.05)；与肿瘤细胞外泌体组比较，低、中、高剂量放疗组肿瘤球体积明显减小(P < 0.05)；与低剂量放疗组比较，中、高剂量放疗组肿瘤球体积明显减少(P < 0.05)；与中剂量放疗组比较，高剂量放疗组肿瘤球体积明显减小(P < 0.05)，见表1。

2.6 CD133⁺肿瘤干细胞表面标志物表达 与空白组比较，肿瘤细胞外泌体组Nanog、Sox-2、Oct-4表达降低(P < 0.05)；与肿瘤细胞外泌体组比较，低、中、高剂量放疗组Nanog、Sox-2、Oct-4表达进一步降低(P < 0.05)；与低剂量放疗组比较，中、高剂量放疗组Nanog、Sox-2、Oct-4表达明显降低(P <0.05)；与中剂量放疗组比较，高剂量放疗组Nanog、Sox-2、Oct-4表达明显降低(P < 0.05)，见图5。

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引言

外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150 nm)，现今其特指直径40-100 nm的盘状囊泡。在正常及病理状态下，很多细胞均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。肿瘤细胞外泌体在促进肿瘤增殖、血管形成、放化疗耐药、免疫耐受、上皮间质转化等方面扮演着重要角色^[1-3]。相关研究显示，外泌体可抑制Notch-1依赖的细胞存活途径，从而诱导胰腺癌细胞凋亡^[4-5]；还有研究显示，外泌体可刺激胶质瘤细胞的增殖，促进肿瘤生长^[6-7]。关于外泌体对肿瘤细胞的直接作用是促进其增殖还是促进其凋亡，至今没有明确的定论。但是近年来研究发现，载药肿瘤细胞外泌体与相应起源的肿瘤细胞具有较高的亲和性，与其他细胞的结合力较低，因而成为一种高效的靶向药物载体^[8-9]。

近年来，随着危险因素、人口增长的多重作用，乳腺癌的发病率逐年上升，且有年轻化趋势，使其成为中国增长幅度较大的恶性肿瘤之一。尽管乳腺外科手术技术与肿瘤学在不断进步与发展，但常规手术结合放化疗治疗后的预后并不乐观。肿瘤干细胞学说认为，肿瘤干细胞在肿瘤发展、耐药、复发转移中发挥着重要作用。肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中具有高侵袭性、高致瘤性、高度自我更新及增殖潜能的一群细胞，因此找到抑制肿瘤干细胞增殖的方法，可提高临床疗效，降低复发率。CD133是目前较常用的肿瘤干细胞标志物，并且研究已证实CD133⁺细胞具有较强的增殖、侵袭及致瘤性^[10-11]。

甲氨蝶呤具有广谱抗肿瘤特性，可单独或联合其他化疗药物应用于乳腺癌治疗。放疗也是治疗恶性肿瘤的主要手段，多数患者通过放疗可获得不同程度的疗效。实验从人乳腺导管癌细胞ZR-75-30中分离肿瘤细胞外泌体，将其包裹化疗药物甲氨蝶呤，观察载药肿瘤细胞外泌体联合放疗对CD133⁺乳腺癌肿瘤干细胞增殖的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 对比观察肿瘤细胞外泌体的生物学作用。

1.2 时间及地点 实验于2017年1至7月在海南省第三人民医院实验室完成。

1.3 材料 人乳腺导管癌细胞ZR-75-30(上海钰博生物科技有限公司)；RPMI 1640培养基(美国SIGMA)；胎牛血清(美国Gibco公司)；甲氨蝶呤注射液(浙江万马药业有限公司)；CCK-8试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)；总蛋白提取试剂盒、碱性成纤维细胞生长因子(美国Sigma公司)；重组人表皮生长因子、B27添加剂(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；鼠抗人Nanog、Sox-2、Oct-4单抗(Abcam公司)；GAPDH鼠抗人单克隆抗体(武汉博士德)；CD133-PE鼠抗人抗体及同型对照抗体(美国BD公司)；流式细胞仪(贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司)；酶标仪(上海闪谱生物科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 乳腺癌细胞的培养 取冻存的人乳腺导管癌细胞ZR-75-30，常规复苏，然后加入含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中，观察到细胞铺满培养瓶底后进行消化传代。

1.4.2 肿瘤细胞外泌体的制备 采用超速离心法分离肿瘤细胞外泌体^[12]。收集培养48 h后的人乳腺导管癌细胞ZR-75-30上清液，4 ℃条件下，300×g离心5 min、2 000×g离心20 min、10 000×g离心70 min。随后将上清液移入高速离心管中，4 ℃条件下，1 000 000×g离心120 min，得到沉淀物，在离心管中加满PBS，再次1 000 000×g离心120 min，得到提纯的肿瘤细胞外泌体沉淀。将沉淀以PBS重悬，0.22 μm滤膜过滤除菌，-80 ℃保存备用。

1.4.3 载药肿瘤细胞外泌体的制备 将肿瘤细胞外泌体均匀铺于10 cm培养皿，常规培养，加入甲氨蝶呤注射液，使其最终质量浓度为5 g/L，经紫外灯照射1 h，在恒温培养箱中培养。培养12 h后，收集培养液，30 ℃条件下400×g离心10 min，去除沉淀，取上清液，15 ℃条件下10 000×g离心2 min，再次去除沉淀，取上清液，4 ℃条件下100 000×g离心60 min，得沉淀。将沉淀在0.5 mL PBS中溶解，4 ℃条件下100 000×g离心60 min，反复洗涤沉淀，最后以0.5 mL PBS溶解，4 ℃条件下保存备用。将载药肿瘤细胞外泌体分别进行50，100，200，500，1 000，2 000倍稀释^[13]，使其中甲氨蝶呤质量浓度分别为0.1，0.05，0.025，0.01，0.005，0.002 5 g/L。

1.4.4 肿瘤干细胞的分离培养 参照文献[14]方法，取处于对数生长期的人乳腺导管癌细胞ZR-75-30，消化后制成单细胞悬液，分装入2个离心管中，100×g离心5 min，去除上清，其中1个离心管中加入100 μL的CD133-PE鼠抗人抗体，另一个加入等量CD133-PE鼠抗人抗体的同型对照，4 ℃避光静置孵育10 min。采用流式细胞仪分选出CD133⁺细胞与CD133^-细胞。将两种细胞培养于含20 μg/L重组人表皮生长因子与20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的RPMI 1640培养基中，置于37 ℃、含体积分数5%CO₂、饱和湿度环境下培养。

1.4.5 肿瘤干细胞相关特性检测

CCK-8增殖实验^[15]：取分离培养的CD133⁺细胞与CD133^-细胞，以2×10³/孔的密度接种到96孔板中，加入含20 μg/L重组人表皮生长因子与20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的RPMI 1640培养基，每组5个复孔，置入37 ℃、含体积分数5%CO₂培养箱中培养1，3，5，7 d，检测细胞活性，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续在37 ℃、含体积分数5%CO₂培养箱中培养2 h，然后使用酶标仪在450 nm波长处检测吸光度A值。

侵袭实验^[16]：取分离培养的CD133⁺细胞与CD133^-细胞，去血清饥饿培养12 h。取出细胞，弃去培养液，无菌PBS清洗，消化后制成单细胞悬液，加入无血清RPMI 1640培养基，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-¹。将200 μL细胞悬液加入Transwell小室上室，将600 μL含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基加入Transwell小室下室，每组细胞3个复孔。将Transwell小室置于37 ℃、含体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h。取出Transwell小室上室，洗出残余液体，PBS清洗3次后自然风干。轻轻去除基质胶和上室内未侵袭的细胞，以0.1%结晶紫染色，PBS清洗3次，自然风干。取风干的Transwell小室上室，置于倒置显微镜下观察，随机选取6个视野计数细胞，取均值。

1.4.6 CCK-8检测筛选最佳肿瘤细胞外泌体稀释倍数 取分离培养的CD133⁺细胞，加入含20 μg/L重组人表皮生长因子与20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的RPMI 1640培养基，制备单细胞悬液，以1×10⁷ L^-¹的细胞浓度接种于96孔板，分别加入含稀释倍数50，100，200，500，1 000，2 000载药肿瘤细胞外泌体的细胞培养基，以单纯细胞培养基培养的细胞为对照组，培养72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续在37 ℃、含体积分数5%CO₂培养箱中培养2 h，然后使用酶标仪在450 nm波长处检测吸光度A值，计算细胞存活率，细胞存活率=实验组A值÷对照组A值× 100%。筛选最佳稀释倍数，用于后续实验。

1.4.7 肿瘤球形成实验 取分离培养的CD133⁺细胞，加入无血清悬浮干细胞培养基，制备单细胞悬液，以1×10⁶ L^-1的细胞浓度接种于低黏附24孔板，每孔200 μL^[17]。培养24 h后分5组，每组3个复孔：①空白组常规培养；②肿瘤细胞外泌体组加入含载药肿瘤细胞外泌体的RPMI 1640培养基；③低、中、高剂量放疗组先将CD133⁺细胞在含载药肿瘤细胞外泌体的RPMI 1640培养基中培养24 h，然后分别接受2，4，6 Gy的X射线照射1次，射线由细胞贴壁面经有机玻璃垂直照射。照射后的细胞放回培养箱中继续培养，每三四天更换1次培养液。培养7 d后，倒置显微镜下观察肿瘤球形成数量，测量肿瘤球半径，计算肿瘤球体积。

1.4.8 Western Blot 检测肿瘤干细胞表面标志物表达 取分离培养的CD133⁺细胞，加入干细胞培养基，制成单细胞悬液，以1×10⁶ L^-¹的细胞浓度接种于培养皿，分组及干预方式同上，继续培养24 h后，提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转膜，加入一抗鼠抗人单克隆抗体(鼠抗人Nanog、Sox-2、Oct-4单抗与GAPDH鼠抗人单克隆抗体)，4 ℃孵育过夜，加入TRITC标记的羊抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h，显色曝光，以GAPDH作为内参^[18]。

1.5 主要观察指标 载药肿瘤细胞外泌体联合放疗干预后，CD133⁺肿瘤干细胞的肿瘤球形成能力及干细胞表面标志物Nanog、Sox-2、Oct-4的表达。

1.6 统计学分析 实验数据采用SPSS 15.0统计学软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t 检验，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

外泌体是细胞主动分泌的纳米级囊性小泡，电镜下呈杯状，其内含有大量功能蛋白质、mRNA及microRNA，是细胞间进行物质交换、信息交流的重要载体，在腹水、乳汁、外周血及尿液中可检测到。早期研究发现，由树突状细胞及肿瘤细胞分泌的外泌体，含有丰富的MHC分子与肿瘤抗原，可辅助抗原呈递，诱发免疫反应，抑制免疫耐受，为肿瘤免疫治疗提供了新的思路^[19-21]。有研究利用树突状细胞外泌体作为肿瘤疫苗，在动物实验中取得了成功，应用患者自体肿瘤细胞外泌体对患者进行治疗，Ⅰ期临床试验获得了一定的疗效^[22]。外泌体的提取方法主要有超速离心法、过滤离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠法及色谱法，其中以超速离心法应用较广泛，其可通过逐步离心除掉细胞器、细胞碎片及大分子蛋白等，最后通过高速离心获取外泌体沉淀^[23-25]。该实验采用超速离心法从人乳腺导管癌细胞ZR-75-30中分离外泌体沉淀。

关于肿瘤外泌体对肿瘤细胞增殖与转移的作用，目前的研究显示，肿瘤外泌体也参与细胞间的信息交流，其内基因发生突变，然后通过膜融合将突变信息传给正常细胞，激活原癌基因，促进肿瘤细胞的生长与转移^[26-28]；肿瘤外泌体表面表达转化生长因子β，其与周围纤维细胞膜表面受体结合后，降解肿瘤基质细胞，促进肿瘤细胞的转移。但是近年来研究发现，载药肿瘤细胞外泌体与相应起源的肿瘤细胞具有较高的亲和性，与其他细胞的结合力较低，因而成为一种高效的靶向药物载体。查阅近期国内文献发现相关文献不多，刘允刚^[29]实验显示，单独使用外泌体、CpG ODN或二者联合使用，都能显著抑制CT-26细胞在体内的生长，但外泌体组和CpG ODN组之间对肿瘤的生长抑制无明显差异，而与外泌体组和CpG ODN组相比，联合组对肿瘤的生长抑制更明显，说明二者联合用药能更有效抑制小鼠结肠癌皮下移植瘤的生长。实验将化疗药物甲氨蝶呤包裹于肿瘤细胞外泌体中，观察其联合放疗对乳腺癌肿瘤干细胞增殖的影响，目前相关研究不多见。

实验成功从人乳腺导管癌细胞ZR-75-30中分离出具有较强增殖及侵袭能力的CD133⁺乳腺癌肿瘤干细胞，观察载药肿瘤细胞外泌体对其增殖的影响。首先进行了肿瘤形成实验，结果显示肿瘤细胞外泌体组肿瘤球数量、体积明显低于空白组(P < 0.05)，说明载药肿瘤细胞外泌体对CD133⁺乳腺癌肿瘤干细胞具有一定的抑制作用；联合放疗干预后，CD133⁺乳腺癌肿瘤干细胞形成肿瘤球数量、体积明显进一步减少，并且呈放疗剂量依懒性抑制CD133⁺乳腺癌肿瘤干细胞肿瘤球的形成，提示载药肿瘤细胞外泌体协同放疗发挥抑制CD133⁺乳腺癌肿瘤干细胞增殖。Western Blot 检测结果显示肿瘤细胞外泌体组Nanog、Sox-2、Oct-4表达明显低于空白组(P < 0.05)，说明载药肿瘤细胞外泌体可一定程度地抑制增殖活性；联合放疗干预后，低、中、高剂量放疗组CD133⁺乳腺癌肿瘤干细胞Nanog、Sox-2、Oct-4表达进一步降低(P < 0.05)，并呈放疗剂量依赖性降低Nanog、Sox-2、Oct-4的表达，提示载药肿瘤细胞外泌体协同放疗发挥抑制CD133⁺乳腺癌肿瘤干细胞的增殖活性。该研究仅从体外实验观察了载药肿瘤细胞外泌体协同放疗对CD133⁺乳腺癌肿瘤干细胞增殖的作用，下一步将进行动物体内成瘤实验，观察其在体内对肿瘤干细胞增殖的作用，并且关于其具体的作用机制还需要更深入的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程