过表达GATA-4骨髓间充质干细胞以外泌体修复心肌损伤的相关microRNA

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0528

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (21): 3292-3298.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0528

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过表达GATA-4骨髓间充质干细胞以外泌体修复心肌损伤的相关microRNA

贺继刚，韩金秀，严丹，李贝贝，撒亚莲，谢巧丽

云南省第一人民医院心脏大血管外科，云南省昆明市 650032

修回日期:2018-02-06 出版日期:2018-07-28 发布日期:2018-07-28
通讯作者: 谢巧丽，医师，云南省第一人民医院心脏大血管外科，云南省昆明市 650032
作者简介:贺继刚，男，1980年生，河北省抚宁县人，汉族，2013年苏州大学毕业，博士，副主任医师，主要从事干细胞在终末心脏疾病中的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81460073，31460298)；云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项(2014FB089)；云南省教育厅科学研究基金(2015Z051)；中国博士后科学基金(2015M582764XB)；成都医学院2015年度科研项目(CYZ15-18)；云南省医学后备人才(H-201607)

A molecular study on myocardial repair via exosomes secreted from GATA-4-overexpressed bone marrow mesenchymal stem cells

He Ji-gang, Han Jin-xiu, Yan Dan, Li Bei-bei, Sa Ya-lian, Xie Qiao-li

Department of Cardiovascular Surgery, the First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Revised:2018-02-06 Online:2018-07-28 Published:2018-07-28
Contact: Xie Qiao-li, Physician, Department of Cardiovascular Surgery, the First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:He Ji-gang, M.D., Associate chief physician, Department of Cardiovascular Surgery, the First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81460073, 31460298; Yunnan Science and Technology Department-Kunming Medical University Joint Research Fundamental Special Fund, No. 2014FB089; Science Research Fund of Yunnan Provincial Department of Education, No. 2015Z051; China Postdoctoral Science Foundation, No. 2015M582764XB; Science and Technology Research Project of Chengdu Medical College in 2015, No. CYZ15-18; Yunnan Provincial Medical Reserve Talents Project, No. H-201607

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
exosome：外泌体，是从细胞上产生的鳞片状脱落的囊泡，具有胞外酶的活性。最初认为它仅仅起到一种“垃圾袋”的作用，允许细胞丢掉不需要的蛋白。内涵体和细胞膜相互融合并且释放exosome进入细胞间隔。这些囊泡体从细胞内释放出来，它们就被认为是exosome。现证实它来源于细胞后期内涵体，并且可以在造血干细胞和上皮细胞的培养基中检测到。exosome具有多种生物学功能，它可以使得细胞在不需要直接接触下完成细胞间生物信号转导，其在细胞保护、免疫、疾病诊断等方面成为目前研究的热点。
miRNA微阵列技术：典型的miRNA微阵列是将20-70 nt长的寡核苷酸组成的DNA探针印在具有化学修饰的载玻片上，这类似于许多其他类型的基于寡核苷酸的微阵列，然后将载玻片与标记的样品一起孵育，通过检测荧光的方法来确定与探针杂交的信号。

摘要
背景：GATA-4是与心脏发育特异相关的锌指样转录因子，前期实验发现过表达GATA-4的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分泌的外泌体(exosome)与BMSCs共培养时可以促使BMSCs表达出更多的心肌特异性抗原。当其与心肌细胞在低氧环境下培养可以抑制心肌细胞的凋亡。
目的：探讨过表达GATA-4的BMSCs分泌exosome修复心肌损伤的相关microRNA，从分子水平对其生物学效应进行探讨。
方法：①通过慢病毒载体GV308携带GATA-4转染小鼠BMSCs，构建过表达GATA-4小鼠BMSCs，并加入基因开启剂强力霉素，然后采用ExoQuick-TC法提取分泌的exosome；②实验设5组：GATA-4- BMSCs-exosome+BMSCs共培养组、空载体-BMSCs-exosome+BMSCs共培养组、BMSCs-exosome+ BMSCs共培养组、BMSCs单独培养组、心肌细胞单独培养组。培养24 h采用Q-PCR定量检测心肌特异性抗原cTnT、α-actin、connexin 43、Desmin的表达；③实验设5组：GATA-4-BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组、空载体-BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组、BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组、心肌细胞单独培养组，在低氧(体积分数为1%)无血清培养条件下培养24 h诱导细胞凋亡。以正常条件下单独培养的心肌细胞作为阴性对照组，采用流式细胞技术检测各组细胞的凋亡率；④采用Agilent microRNA芯片检测过表达GATA-4小鼠BMSCs分泌exosome内有关细胞分化及抗凋亡的microRNA。
结果与结论：①Q-PCR和流式细胞技术检测结果显示：过表达GATA-4-BMSCs分泌的exosome可以有效促进BMSCs向心肌细胞转化且具有极强的抗凋亡能力；②Agilent microRNA 芯片检测结果显示：涉及细胞分化的关键microRNA：mmu-miR-199a-3p(microRNA为上调)；mmu-miR-1894-5p(microRNA为下调)。涉及细胞抗凋亡的关键microRNA：mmu-miR-199a-3p、mmu-miR-20a-5p、mmu-miR-330-3p，这3个基因均为上调。其中mmu-miR-199a-3p即涉及细胞分化又涉及细胞抗凋亡，为重点首先需要验证的microRNA。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9974-4525(谢巧丽)

关键词: 小鼠骨髓间充质干细胞, GATA-4, 外泌体, microRNA, 心肌细胞, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: GATA-4 is a zinc finger transcription factor that is specifically associated with cardiac development. Previous experiments have found that exosomes secreted from GATA-4-overexpressed bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) co-cultured with BMSCs can make BMSCs express more myocardial-specific antigens. When co-cultured with myocardial cells in a hypoxic environment, these exosomes can inhibit apoptosis in myocardial cells.
OBJECTIVE: To identify from a molecular level the basic and essential exosomes secreted from GATA-4-overexpressed mouse BMSCs that has a significant role in cardiac repair after myocardial infarction.
METHODS: (1) GATA-4-overexpressed mouse BMSCs were constructed by transfecting mouse BMSCs with GV308 (a lentiviral vector)-carrying GATA-4 before adding doxycycline for gene induction. ExoQuick-TC (SBI Inc.) was then used to extract the secreted exosomes. (2) The BMSCs were co-cultured with GATA-4-BMSCs-Exosome, free-vector-BMSCs-Exosomes, and BMSCs-Exosome. Another BMSCs and mouse myocardial cells were cultured alone. The expression levels of myocardial specific antigens, cTnT, α-actin, connexin 43, and Desmin, were assessed via qPCR quantification at 24 hours of culture. (3) The mouse myocardial cells were then co-cultured with GATA-4-BMSCs-Exosome, free-vector-BMSCs-Exosomes, and BMSCs-Exosome, and were subsequently mono-cultured in hypoxia and in serum-free cultures to construct the apoptosis-positive control group. Normally cultured myocardial cells were as negative controls. Cell apoptosis rates in different groups were determined by flow cytometry. (4) The microRNAs, which were associated with cellular differentiation or anti-apoptosis, in the exosomes secreted from GATA-4-overexpressed mouse BMSCs were detected by Agilent microRNA microarray.
RESULTS AND CONCLUSION: Results from Q-PCR and flow cytometry suggested that the exosomes secreted from GATA-4-overexpressed mouse MBSCs effectively facilitated the differentiation of BMSCs to form myocardial cells and reduce apoptosis. The Agilent microRNA microarray test results showed that the key microRNAs associated with differentiation included mmu-miR-199a-3p (up-regulated) and mmu-miR-1894-5p (down-regulated), while the key microRNAs associated with the anti-apoptotic function included mmu-miR-199a-3p, mmu-miR-20a-5p, and mmu-miR-330-3p, all of which were up-regulated. Among these microRNAs, mmu-miR-199a-3p was the only one associated with both cellular differentiation and anti-apoptosis, and it was therefore considered as the most primary microRNA to be validated.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, GATA4 Transcription Factor, Exosomes, MicroRNAs, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

贺继刚，韩金秀，严丹，李贝贝，撒亚莲，谢巧丽. 过表达GATA-4骨髓间充质干细胞以外泌体修复心肌损伤的相关microRNA[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(21): 3292-3298.

He Ji-gang, Han Jin-xiu, Yan Dan, Li Bei-bei, Sa Ya-lian, Xie Qiao-li. A molecular study on myocardial repair via exosomes secreted from GATA-4-overexpressed bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(21): 3292-3298.

图/表（结果） 2

2.1 小鼠BMSCs流式细胞仪鉴定结果 超过90%的小鼠BMSCs表达CD29(表达率为98%)、CD44(表达率为100%)和SCA-1(表达率为99.5%)，但很少细胞表达CD11b(表达率为0.1%)。

2.2 小鼠BMSCs三系分化结果 见图1。从图中可见小鼠BMSCs可以分化为脂肪细胞、骨细胞及软骨细胞。

2.3 Q-PCR方法检测转染24 h GATA-4基因的表达 见图2。过表达GATA-4组小鼠BMSCs中的GATA-4基因表达丰度为阴性对照组的61.485倍(P < 0.05)。

2.4 ExoQuick-TC法提取的exosome的形态 见图3。扫描电镜下观察可见BMSCs分泌出的exosome为白色，大小介于40-100 nm之间，颗粒成团聚集。

2.5 Q-PCR检测心肌特异性抗原cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin的表达 由表1可见过表达GATA-4-BMSCs-exosome可以促进BMSCs表达出更多心肌特异性抗原。

2.6 流式细胞技术检测各组培养24 h心肌细胞凋亡率 低氧(体积分数为1%)无血清培养条件下，过表达GATA-4-BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组的心肌细胞凋亡率为(7.33±0.32)%，空载体-BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组的心肌细胞凋亡率为(8.80±0.26)%，BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组的心肌细胞凋亡率为(10.97±0.15)%，心肌细胞单独培养组的心肌细胞凋亡率为(12.63±0.46)%，而阴性对照组(在正常培养条件下单独心肌细胞培养)的心肌细胞凋亡率为(1.33±0.06)%。过表达GATA-4-BMSCs-exosome+心肌细胞组细胞凋亡率明显低于空载体-BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组、BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组、心肌细胞单独培养组，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.7 采用小鼠Agilent microRNA 芯片检测过表达GATA-4 BMSCs分泌exosome内有关细胞分化及抗凋亡的microRNA

2.7.1 样品编号及质检 见表2。

2.7.2 对原始数据行聚类分析 当样本在3个及以上时，会根据样品表达模式的相关性进行聚类，给出样本的聚类图。其中数据源自归一化后基因的信号值；聚类分析采用 R语言及其扩展包中的聚类方法，采用 hierarchical，average linkage算法，cluster.atr,.cdt,.gtr，是聚类分析所生成的文件，聚类分析最终结果保存为Cluster.png，见图4。

2.7.3 对样品行两两比较差异miRNA分析结果 对于小于3个生物学重复的项目，采用GeneSpring软件进行数据归一化和差异miRNA分析，差异miRNA筛选标准为：FC(abs)在2.0倍以上。对于具有3个及以上生物学重复的项目，采用GeneSpring软件进行数据归一化和统计学处理的差异表达miRNA分析，包括统计显著性指标：①P，采用T-test unpair方法计算得到的P值；②P(Corr)，采用Benjamini Hochberg FDR方法进行校正得到的P值；③FC(abs)，两组或两个样品的差异倍数；④以2为底，Log FC的绝对值为幂得到的数值。常见筛选标准为：P ≤ 5%，同时FC(abs)在2.0倍以上对FC(abs)列排序，FC(abs)值差异倍数越大，说明两个样品之间的差异越大。

根据筛选标准，保证G vs. N与G vs. M3具有差异且趋势相同的同时(满足P(G vs. N)< 0.05)，M3 vs. N没有差异或者差异很小(FC(abs) [M3] vs. [N]大于1.1不包含)且与G vs. N与 G vs. M3趋势不同，筛选出来的microRNA，根据G vs. N、G vs. M3与M3 vs. N差异microRNA的表达值大于20差异的方法对上调及下调的microRNA进行预测，筛选出优先考虑做验证的microRNA，见表3，4。

再将上述预测与分化、抗凋亡、迁移有关的microRNA与上述表达出现巨大差异的microRNA取交集，最终考虑涉及细胞分化的关键microRNA是：mmu-miR-199a-3p，此microRNA为上调；mmu-miR-1894-5p，此microRNA为下调。涉及细胞抗凋亡的关键microRNA是：mmu-miR-199a-3p、mmu-miR-20a-5p、mmu-miR-330-3p，这3个基因均为上调。可以看到：mmu-miR-199a-3p即涉及细胞分化又涉及细胞抗凋亡，为重点首先需要验证的microRNA。

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引言

材料方法

1.1 设计 回顾性科学研究。

1.2 时间及地点 实验于2017年6至12月在云南省第一人民医院基础研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康4周龄SPF级C57BL/6小鼠20只，体质量(23.8±2.2) g，均为雄性，由成都达硕实验动物中心提供，动物许可证号为SCXK(川)2015-030。所有动物的喂养、观察均按照GLP(非临床研究管理规范)规定执行。

1.3.2 实验试剂和仪器 C57BL/6小鼠BMSCs培养基(低糖培养基，含体积分数为10%胎牛血清)(美国Cyagen Biosciences公司)；Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor^®488 & PI-for Flow Cytometry(美国Invitrogen公司)；CD29、CD44、CD11b、SCA-1抗体(美国BioLegend公司)；CD11bMicroBeads(美国Miltenyi公司)；小鼠BMSCs成脂肪、成骨、成软骨分化试剂盒(美国Cyagen Biosciences公司)；ExoQuick-TC试剂盒及RA800TC-1 seraMir Exosome RNA Amplification kit from Media and Urine试剂盒(美国SBI公司)；小鼠心肌细胞(赛齐(上海)生物工程有限公司)；Q-PCR仪(美国ABI公司)；Accuri C6流式细胞仪(美国BD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠BMSCs的分离、培养及鉴定 全骨髓法培养小鼠BMSCs，胰酶消化传代至第3代时采用CD11b的磁珠负选，去除造血干祖细胞。继续传代，取生长至第8代BMSCs，待细胞融合达80%-90%时，制备单细胞悬液，采用流式细胞仪检测CD29、CD11b、CD44、SCA-1的表达，其中PE-CD29单抗5 μL进行1︰20稀释至100 μL、PE-CD11b单抗5 μL进行1︰40稀释至100 μL、PE/Cy5-CD44 5 μL进行1︰20稀释至100 μL、FITC anti-mouse SCA-1 5 μL进行1︰20稀释至100 μL。然后按Cyagen Biosciences公司脂肪、骨、软骨分化说明书操作完成小鼠BMSCs三系分化检测。

1.4.2 慢病毒载体及基因开启技术构建过表达GATA-4 BMSCs ①将已构建成功的GATA-4基因插入慢病毒包装质粒GV308中，构建GV308-GATA-4重组慢病毒包装质粒；②将构建成功的GV308-GATA-4重组慢病毒包装质粒转染入第10代小鼠BMSCs并加入基因开启剂强力霉素；③转染成功后利用Q-PCR方法检测转染24 h GATA-4基因的表达。

1.4.3 exosome提取 转染后，待细胞长满25 cm²培养瓶时加入强力霉素48 h，按照SBI公司ExoQuick-TC说明书提取exosome并利用扫描电镜观察exosome的形态。

1.4.4 Exosome与BMSCs共培养 提取过表达GATA- 4-BMSCs，空载体-BMSCs，BMSCs分泌的exosome，用BCA法检测各自的蛋白浓度。实验设5组：①GATA-4- BMSCs-exosome+BMSCs共培养组；②空载体-BMSCs- exosome+BMSCs共培养组；③BMSCs-exosome+BMSCs共培养组；④BMSCs单独培养组；⑤心肌细胞单独培养组。将BMSCs和小鼠心肌细胞分别消化后制备成单细胞悬液，并用血球计数板计数，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹。将14 mm细胞爬片放入24孔板中，根据不同的分组将BMSCs和心肌细胞分别接种到24孔板中，每孔5×10⁴个细胞。前4组用小鼠骨髓间充质干细胞专用培养基补足至500 μL，心肌细胞单独培养组用心肌细胞专用培养基补足至500 μL。同时，在前3组的各孔中分别加入不同的exosome，各组exosome 的终质量浓度为20 g/L。每个样品做3个重复孔。

1.4.5 Q-PCR检测共培养后心肌细胞特异性分子表达 GATA-4-BMSCs-Exosome与BMSCs共培养，空载体-BMSCs-Exosome与BMSCs共培养，BMSCs-Exosome与BMSCs共培养、BMSCs单独培养及小鼠心肌细胞单独培养24 h，采用Q-PCR方法检测细胞中cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin的表达。实验重复3次。

1.4.6 Exosome与心肌细胞共培养 提取过表达GATA-4-BMSCs，空载体-BMSCs，BMSCs分泌的exosome，用BCA法检测各自的蛋白浓度。实验设5组：①GATA-4-BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组；②空载体-BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组；③BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组；④心肌细胞单独培养组；⑤阴性对照组。前4组细胞于低氧环境下无血清培养诱导细胞凋亡。阴性对照组心肌细胞在正常条件下单独培养。

1.4.7 流式细胞技术检测细胞凋亡率 GATA-4-BMSCs-exosome与心肌细胞共培养，空载体-BMSCs-exosome与心肌细胞共培养，BMSCs-exosome与心肌细胞共培养以及单独心肌细胞在低氧(体积分数为1%)无血清培养条件下培养24 h诱导细胞凋亡。按Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor^®488 & PI - for Flow Cytometry说明书上流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率，实验重复3次。

1.4.8 提取exosome中的RNA 按照RA800TC-1 seraMir Exosome RNA Amplification kit from Media and Urine 试剂盒说明书提取过表达GATA-4-BMSCs分泌的eosome、空载体-BMSCs分泌的eosome、BMSCs分泌的eosome中的总RNA。

1.4.9 构建MicroRNA芯片 ①RNA质检；②纯化：使用mirVana^TM miRNA Isolation Kit(AM1561)对 total RNA 进行纯化；③总RNA去磷酸化及标记反应；④在Agilent公司杂交炉中过夜杂交。备注：在整个芯片实验过程中，加入Agilent公司的标记外标(Labeling spike-in)RNA和杂交外标(Hyb spike-in) RNA作为整个实验过程的质控；⑤芯片清洗及扫描；⑥数据提取及分析：使用Agilent Feature Extraction(v10.7)软件对杂交图片进行分析并提取数据；然后使用Agilent GeneSpring软件对数据进行归一化，并采用GeneSpring软件进行组间的差异分析，例如T-test方法进行两组差异表达基因分析；ANOVA方法进行多组差异表达基因分析。

1.5 主要观察指标 采用小鼠Agilent microRNA 芯片检测过表达GATA-4 BMSCs分泌exosome内有关细胞分化及抗凋亡的microRNA。

1.6 统计学分析 使用SPSS 15.0软件进行统计分析。数据以x(_)±s表示。各细胞亚群间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni post-hoc检验。所有统计假设检验均为双侧，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

MicroRNAs(miRNA)是长度大约为22个核苷酸的一类新的内源性小的非编码RNA分子。它们做为长初始转录物(pri-miRNA)来自于基因组DNA，然后通过RNase-Ⅲ型酶Drosha和Dicer的修饰，来产生miRNA的前体和后期成熟的miRNA。miRNA作为引导分子，通过与靶mRNA 3'-非翻译区(UTR)部分配对而抑制转录后蛋白质的合成。miRNA在多种调节途径中具有关键作用，包括控制发育、细胞增殖、细胞分化、细胞周期进展、免疫反应、蛋白分泌和许多其他生理和病理过程。因此，为了研究miRNA的重要生理功能，许多实验室开始使用miRNA微阵列技术，来检测和比较不同条件下不同细胞类型和组织中miRNA表达情况。为了构造典型的miRNA微阵列，将20-70 nt长的寡核苷酸组成的DNA探针印在具有化学修饰的载玻片上，这类似于许多其他类型的基于寡核苷酸的微阵列，然后将载玻片与标记的样品一起孵育，通过检测荧光的方法来确定与探针杂交的信号^[3]。

前期实验已经充分证明，过表达GATA-4 BMSCs分泌的exosome可以有效改善心肌梗死后的心功能，其具有抗凋亡、促进BMSCs分化的作用，但其作用机制不清楚。实验基于前期研究基础上，提取exosome中的microRNA，采用miRNA芯片技术对exosome生物学表现的机制进一步探讨。

实验检测GATA-4-BMSCs分泌的exosome(G)、空载体- BMSCs分泌的exosome(N)及BMSCs分泌的exosome(M)。比较3者分泌eoxosome所含microRNA在涉及细胞凋亡、分化方面的区别。采用筛选标准为P ≤ 5%，同时FC(abs)在2.0倍以上为具有显著性差异，并同时需要满足：筛选G vs. N差异microRNA与G vs.M差异microRNA中表达趋势相同，但与N vs. M没有差异或差异很小的microRNA表达趋势不同的microRNA，这样的microRNA共有102个，其中涉及与细胞分化相关的共有8个microRNA是上调的，5个microRNA是下调的。涉及抗凋亡的共有21个microRNA是上调的，4个microRNA是下调的。为了进一步完成microRNA的验证，将上述筛选标准中的差异倍数扩大至20，并同时仍需要满足上述条件，这样共有5个microRNA是上调的，6个microRNA是下调的。再将上述预测与分化、抗凋亡、迁移有关的microRNA与上述表达出现巨大差异的microRNA取交集，最终考虑涉及细胞分化的关键microRNA是：mmu-miR-199a-3p，此microRNA为上调；mmu-miR-1894-5p，此microRNA为下调。涉及细胞抗凋亡的关键microRNA是：mmu-miR-199a-3p、mmu-miR- 20a-5p、mmu-miR-330-3p，这3个基因均为上调。mmu- miR-199a-3p即涉及细胞分化又涉及细胞抗凋亡，为重点首先需要验证的microRNA。

miRNA-199是Lim在2003年通过计算机分析小鼠Fugu rubripes序列时发现的^[4]。在同一年，他们利用人成骨细胞肉瘤细胞系Saos-2克隆了miRNA-199，并通过小鼠皮肤细胞鉴定得以确认。两种假设的发夹结构的前体位于人基因组的19号染色体和1号染色体上。最近的微阵列分析显示，miR-199a-3p在毛囊和一些肿瘤细胞(例如卵巢癌和乳腺癌细胞)中高表达，这说明miR-199a-3p可能参与肿瘤发生进展^[4]。另据报道miR-199a-3p可能参与肿瘤的发生进展或者通过调节IKKb表达来调节卵巢癌肿瘤细胞的耐药性^[5]。Kim等^[6]发现miR-199a-3p的过表达会抑制肿瘤细胞的浸润。Shatseva等发现miR-199a-3p的表达促进了内皮细胞以及乳腺癌细胞的增殖和存活。为了筛选有助于细胞生长的miR-199a-3p的潜在靶标，使用生物信息搜索工具。计算筛选显示，在大鼠和人小窝蛋白-2的3'UTR中存在miR-199a-3p的两个潜在靶位点^[7]。最近的研究已经证明小窝蛋白-2的细胞和组织特异性作用。例如，敲除小鼠的小窝蛋白-2，会发现小鼠有明显的肺部缺陷和细胞过度增殖现象，表明小窝蛋白-2参与肺内皮细胞增殖和分化的调节。miR-199a-3p对小窝蛋白-2表达的抑制可能在癌症发展中具有关键作用^[7]。

另据Wang报道发现，miR-199a-3p在胃癌细胞系和组织中存在显著性上调。功能研究表明miR-199a-3p不管在体外还是体内都能显著增加细胞增殖和抑制细胞凋亡。此外，转录调节锌指结构和同源盒1(ZHX1)被确定为miR-199a-3p直接下游靶标之一。miR-199a-3p能结合ZHX1 30非翻译区(30UTR)来调节ZHX1蛋白表达。如miR-199a-3p的表达与ZHX1在胃癌细胞系中的表达呈负相关。在SGC-7901细胞中miR-199a-3p的过表达会抑制ZHX1表达，而在NCI-N87细胞中减少miR-199a-3p表达却能增强ZHX1表达。此外，在SGC-7901/miR-199a-3p细胞中恢复ZHX1表达，能抑制由miR-199a-3p引起的细胞增殖^[8]。总之，这些发现表明miR-199a-3p可以作为胃癌细胞中的新型肿瘤启动子，并且其致癌活性可能涉及ZHX1的直接靶向和抑制^[8]。

据研究，在心功能恶化组中半乳凝素-3和miR-199a- 3p的相关性可以通过心力衰竭中的心肌重塑和纤维化的相关性来解释。在肝、肾和心脏纤维化以及特发性肺纤维化时，半乳凝素-3表达增加^[9]。miR-199a也与心力衰竭、肺和肝中的纤维化过程有关^[10-11]。Lee等^[12]最近的一项研究中，miR-199a-5p在特发性肺纤维化患者的血清中显著性增加。这些结果表明miR-199a和纤维化过程之间的潜在性相互作用，其也可能在心力衰竭中起到重要的作用。

Weng等^[13]采用模拟微重力方法可以导致心脏重塑，并且其重塑后也可以恢复，但是在恢复的早期阶段，由于压力负荷增加，心脏重塑可能更加强烈。同时，miR-199a-3p可能在由模拟微重力而导致的心脏重塑中起重要作用，miR-199a-3p可作为模拟微重力诱导心脏重塑的生物标志物。据Port等^[14]报道在小鼠心肌梗死早期，梗死心肌局部miR-199a-3p在梗死后表达明显增高。

以上研究均充分表明miR-199a-3p在细胞抗凋亡、分化过程中具有重要作用，其也涉及到心肌重构、心衰等方面。实验发现过表达GATA-4小鼠BMSCs分泌的exosome可以有效从多方面改善心肌梗死后的心功能，其是否与miR-199a-3p相关仍需要进一步研究证实。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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exosome不但有免疫调节作用还有减轻心肌缺血再灌注损伤的效果。Timmers等^[1]报道，为了更好地理解exosome的心肌保护作用，他们将间充质干细胞培养基采用滤膜将其内部成分系统性地分为各个等级，即心肌保护是由直径为50-100 nm的囊泡所介导的。间充质干细胞营养改善心肌缺血已有大量研究，据Tang等^[2]报道间充质干细胞进入缺血心脏，可以减少组织反应，增加血管生成及减少细胞凋亡，相比用间充质干细胞转分化，其旁分泌可以更好地解释这些效果。迄今为止，总是将间充质干细胞的旁分泌局限于细胞因子、化学因子及介导于细胞间信号的生长因子。而exosome的出现从根本上改变了当前对间充质干细胞旁分泌的理解。据Chen等^[3]报道，间充质干细胞分泌的exosome可以改善缺血再灌注损伤，其在狭小心肌修复窗内，通过在细胞间快速传递功能性蛋白和miRNA而启动细胞修复。exosome含有的miRNA主要为一些前体形式。推测在心肌保护中exosome的介入可能代表着其发挥着重要的组织修复功能，也有可能不同的细胞其分泌出不同的exosome，进而修复不同的组织。本研究首次对过表达GATA-4-BMSCs分泌的exosome中所包含的microRNA进行探讨，力图从分子水平解释exosome的生物学功能，处于国内外领先水平。

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过表达GATA-4骨髓间充质干细胞以外泌体修复心肌损伤的相关microRNA

A molecular study on myocardial repair via exosomes secreted from GATA-4-overexpressed bone marrow mesenchymal stem cells

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