Notch1/Hes1信号调控CCAAT/增强子结合蛋白α表达对高氧损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖与分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0386

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (32): 5209-5214.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0386

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Notch1/Hes1信号调控CCAAT/增强子结合蛋白α表达对高氧损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖与分化的影响

万峰云，卢红艳，万雪晴，郝晓波，朱玥

江苏大学附属医院儿科，江苏省镇江市 212001

收稿日期:2018-05-26 出版日期:2018-11-18 发布日期:2018-11-18
通讯作者: 卢红艳，博士，博士生导师，主任医师，江苏大学附属医院儿科，江苏省镇江市 212001
作者简介:万峰云，女，湖北省随州市人，江苏大学在读硕士，主要从事新生儿肺发育方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81741052)；江苏省自然科学基金资助项目(BK20161356)

Effect of Notch1/Hes1 signal regulating the expression of CCAAT/enhancer-binding protein alpha on the proliferation and differentiation of type II alveolar epithelial cells induced by hyperoxia

Wan Feng-yun, Lu Hong-yan, Wan Xue-qing, Hao Xiao-bo, Zhu Yue

Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China

Received:2018-05-26 Online:2018-11-18 Published:2018-11-18
Contact: Lu Hong-yan, MD, Doctoral supervisor, Chief physician, Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China
About author:Wan Feng-yun, Master candidate, Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81741052; the Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. BK20161356

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
C/EBPα：CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein alpha，C/EBPα)是亮氨酸拉链转录因子家族成员之一，在细胞增殖、分化、信号传导、肿瘤发生以及机体的免疫、应激反应、能量代谢、血液生成等方面发挥重要作用。在肺泡上皮细胞中，C/EBPα可调节其增殖与分化，并促进肺表面活性物质生成，从而促进肺发育。
Notch1/Hes1信号：Notch信号通路是一条进化上十分保守的信号转导系统，由受体、配体和DNA结合蛋白3部分组成。Notch配体与受体相互作用，Notch蛋白经过3次剪切，由胞内段释放入胞质，并进入细胞核与转录因子CSL结合, 形成NICD/CSL转录激活复合体，从而激活Hes1等碱性-螺旋-环-螺旋(basichelix-loop-helix，bHLH)转录因子家族的靶基因，发挥生物学作用。Notch受体通过与配体的相互作用传导细胞信号，在多种组织和器官的早期发育过程中以及细胞增殖、分化、凋亡中发挥重要调控作用。

摘要
背景：Notch1/Hes1信号和CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein alpha，C/EBPα)在肺发育及肺损伤中均发挥重要作用。前期研究发现，高氧可引起肺泡Ⅱ型上皮细胞(type Ⅱ alveolar epithelial cell，AECII)增殖分化异常，并与C/EBPα异常表达有关，而这种异常是否与Notch1/Hes1信号调控有关，目前尚不清楚。
目的：探讨Notch1/Hes1信号调控C/EBPα表达对高氧损伤AECII增殖与分化的影响。
方法：体外培养人AECII，将细胞随机分为空气组、空气激活剂组(Notch通路激活剂Jagged1蛋白500 μg/L)、高氧组(按3 L/min 通入体积分数95%O2和5%CO2高纯混合气体且持续10 min)、高氧激活剂组(在通氧前30 min加入Notch通路激活剂Jagged1蛋白500 μg/L)。于干预后24 h收获各组细胞，采用RT-PCR和Western blot 法分别检测Notch1、Hes1及C/EBPα mRNA与蛋白表达水平；CCK-8法检测AECII细胞增殖；流式细胞术标记肺泡Ⅰ型上皮细胞特异性表面标志蛋白AQP5检测AECII分化。
结果与结论：与空气组比，空气激活剂组Notch1、Hes1、C/EBPα mRNA和蛋白表达显著增加(P < 0.05)，AECII增殖增加而分化减少(P < 0.05)；高氧组和高氧激活剂组Notch1、Hes1、C/EBPα mRNA和蛋白表达显著降低(P < 0.05)，AECII增殖减少而分化增加(P < 0.05)；与高氧组比，高氧激活剂组Notch1、Hes1、C/EBPα mRNA和蛋白表达增加(P < 0.05)，AECII增殖增加而分化减少(P < 0.05)；结果提示，Notch1/Hes1信号可调控C/EBPα表达并能影响高氧损伤AECII增殖与分化功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-7898-2548(万峰云)

关键词: 肺泡Ⅱ型上皮细胞, Notch1/Hes1信号, CCAAT增强子结合蛋白α, 高氧, 增殖, 分化

Abstract:

BACKGROUND: Notch1/Hes1 signal and CCAAT/enhancer-binding protein alpha (C/EBPα) play important roles in lung development and injury. Preliminary studies have shown that hyperoxia can induce abnormal proliferation and differentiation of type II alveolar epithelial cells (AECII), which is related to C/EBPα expression. But, whether Notch1/Hes1 signal is involved remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Notch1/Hes1 signal regulating C/EBPα on the proliferation and differentiation of AECII induced by hyperoxia.
METHODS: Human AECIIs were cultured in vitro, and randomly divided into air group, air activator group (Notch pathway activator Jagged1 protein, 500 μg/L), hyperoxia group (95% O2 and 5% CO2 mixture gas administered at the speed of 3 L/minute for 10 minutes), hyperoxia activator group (500 μg/L Notch pathway activator Jagged1 protein added at 30 minutes before oxygen administration). AECIIs of each group were collected after 24 hours of intervention. The expression of Notch1, Hes1 and C/EBPα at mRNA and protein levels was determined by RT-PCR and western blot assay. The proliferation of AECII was measured by cell counting kit-8 assay. Flow cytometry labeled AQP5 was applied to detect the differentiation of AECII.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the air group, the mRNA and protein expression levels of Notch1, Hes1 and C/EBPα were increased significantly in the air activator group (P < 0.05), the proliferation of AECII was increased and the differentiation was reduced significantly (P < 0.05). In the hyperoxia and hyperoxia activator groups, the mRNA and protein expression levels of Notch1, Hes1 and C/EBPα were significantly decreased, the proliferation of AECII was decreased and the differentiation was increased significantly (P < 0.05). Compared with the hyperoxia group, the mRNA and protein expression levels of Notch1, Hes1 and C/EBPα were significantly increased in the hyperoxia activator group (P < 0.05), and the proliferation of AECII was increased and the differentiation was decreased significantly (P < 0.05). These results suggest that Notch1/Hes1 signal regulates the expression of C/EBPα and affects the proliferation and differentiation of AECII after exposure to hyperoxia.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Pulmonary Alveoli, Epithelial Cells, Hyperoxia, CCAAT-Enhancer-Binding Protein-alpha, Cell Proliferation, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

万峰云，卢红艳，万雪晴，郝晓波，朱玥. Notch1/Hes1信号调控CCAAT/增强子结合蛋白α表达对高氧损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖与分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(32): 5209-5214.

Wan Feng-yun, Lu Hong-yan, Wan Xue-qing, Hao Xiao-bo, Zhu Yue. Effect of Notch1/Hes1 signal regulating the expression of CCAAT/enhancer-binding protein alpha on the proliferation and differentiation of type II alveolar epithelial cells induced by hyperoxia[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(32): 5209-5214.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2018年2月5日在江苏大学附属医院心内实验室完成。

1.3 材料人AECII细胞系(上海赛百慷公司)；胎牛血清(南京维森特公司)；1640培养基(美国Hyclone公司)；胰蛋白酶、TRIzol(美国Invitrogen公司)；Prime-Script RT reagent Kit 试剂盒、SYBR Premix Ex Taq ^TM试剂盒(日本TaKaRa公司)；兔抗人Hes1单克隆抗体(美国Immunoway 公司)；兔抗人Notch1多克隆抗体、鼠抗人β-actin抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；山羊抗人C/EBPα多克隆抗体、鼠抗人AQP5多克隆抗体(美国Santa Cruz 公司)；辣根过氧化物酶标记的抗兔、抗鼠或抗山羊IgG(南京福麦斯公司)；PE标记的羊抗鼠IgG(上海翊圣生物公司)；苯甲基磺酰氟(Phenyl methane sulfony fluoride，PMSF)、RIPA裂解液、SDS-PAGE 配胶试剂盒、蛋白酶抑制剂及上样缓冲液(北京康为世纪公司)；CCK-8 细胞增殖试剂盒(Biosharp公司)；Notch通路激活剂(rh Jagged1，美国R&D systems公司)；细胞培养箱(德国Thermo公司)；LightCycler® 96实时荧光定量PCR仪(上海罗氏公司)；凝胶成像及分析系统(美国Gene公司)；酶标仪(美国Bio-Rad公司)；FACS Canto^TMII流式细胞仪(美国BD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 AECⅡ高氧细胞损伤模型建立及分组人AECII细胞系购买后，显微镜下观察细胞无异常，于超净台中严格无菌操作，将细胞用0.25%含EDTA的胰酶消化3 min，收集细胞于离心管内离心，900 r/min离心5 min，1 mL培养基重悬，细胞浓度大约5×10⁹ L^-1，取1×10⁶个细胞种于培养瓶中，剩余细胞冻存。1 d换液1次，3 d传代1次。从第3代开始用于实验研究，用1640培养基(含体积分数10% FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素)将AECⅡ细胞置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱内培养。

将细胞随机分为空气组(空气，加等体积PBS缓冲液)、空气激活剂组(空气+Notch通路激活剂Jagged1蛋白 500 μg/L)、高氧组(按3 L/min 通入体积分数95%O₂和5%CO₂高纯混合气体且持续10 min，加等体积PBS缓冲液)、高氧激活剂组(在通氧前30 min 加入Notch通路激活剂Jagged1蛋白500 μg/L)。建模成功后均置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中，于造模成功后24 h收获各组细胞，每次实验均重复3次。

1.4.2 实时荧光定量PCR检测Notch1、Hes1、C/EBPα mRNA表达用TRIzol 法提取各组AECII总mRNA，纯度及浓度使用微量分光光度计检测。cDNA按试剂盒说明书合成。PCR反应体系：12.5 μL SYBR Premix Ex Taq^TM；PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL；0.5 μL ROX Reference Dye Ⅱ(×50)；2.0 μL DNA模板；9.0 μL ddH₂O；合计 25 μL。PCR 反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。引物序列见表1，结果以β-actin作内参，用2^-^??Ct相对定量法分析。

表1 基因引物序列

Table 1 Primer sequences

基因	引物序列	退火温度(℃)	长度(bp)
β-actin	5'-GCA GAA GGA GAT TAC TGC CCT-3' 5'-GCT GAT CCA CAT CTG CTG GAA-3'	59	136
Notch1	5'-TAG ATC CAA CCC TTG TGT C-3' 5'-GAC GCA CAC TCG TTG ATG TT-3'	60	120
Hes1	5’-GAG TGC ATG AAC GAG GTG AC-3’ 5’-GGT CAT GGC ATT GAT CTG G-3’	56	117
C/EBPα	5'-GGT GGA CAA GAA CAG CAA CG-3' 5'-GGT CAG CTC CAG CAC CTT CT-3'	58	124

1.4.3 Western blot 法检测Notch1、Hes1、C/EBPα蛋白表达用含有PMSF和蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液提取各组AECII蛋白。按20 μg/泳道上样，进行电泳，湿转至PVDF膜上。37 ℃封闭后，分别加入兔抗人Notch1多克隆抗体(1︰100)，兔抗人Hes1多克隆抗体(1︰1 000)，山羊抗人C/EBPα多克隆抗体(1︰200)，鼠抗人 β-actin抗体 (1︰1 000)，4 ℃孵育过夜；用TBST洗膜后，加入HRP标记的山羊抗兔IgG、HRP标记的兔抗山羊IgG或HRP标记的山羊抗鼠IgG(1︰1 000)，37 ℃孵育1 h，化学发光显色，用凝胶分析成像系统扫描并分析，测定蛋白质条带的吸光度(A)值，以A_目的蛋白/A_β-actin比值表示目的蛋白相对表达水平。

1.4.4 CCK-8法检测AECII增殖 CCK-8是广泛应用于检测细胞增殖的快速高灵敏度方法^[14-16]，该研究采用CCK-8评估细胞增殖状态，实验步骤严格按照CCK-8试剂盒说明书执行。将各组细胞分别接种于96孔板内，每孔加入 100 μL培养液，约含5 000个细胞。每组设4个复孔，分别加入CCK-8试剂10 μL/孔，在细胞培养箱内孵育2 h，用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度值，可反映活细胞数量。

1.4.5 流式细胞标记法检测AECII分化 AECII可分化为AECI，AQP5是AECI的特异性表面标志蛋白，其表达强弱直接反映AECI数量和(或)功能^[17]。流式细胞术标记法检测AQP5，以标记AQP5的阳性细胞代表AECI。收集各组细胞，离心洗涤后，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1。加入鼠抗人AQP5多克隆抗体(1︰100)，混匀，37 ℃孵育30 min，洗涤后，加入PE-抗鼠IgG(1︰100)，避光孵育15 min，上机(FACS Canto^TMII，BD，美国)检测。利用Flow Jo软件作图，将细胞分为2个亚群：AQP5⁺，AQP5^-，结果以阳性细胞百分率表示(n=5)。

1.5 主要观察指标 Notch1、Hes1、C/EBPα mRNA和蛋白水平及AECII增殖分化能力。

1.6 统计学分析实验数据制图采用Graphpad prism5.0软件处理，运用SPSS 19.0进行统计学分析，实验结果以 x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

正常细胞更新及损伤修复过程中，AECII既可分化为AECI，也可通过有丝分裂产生子代AECII以维持自身细胞群。因此，AECII常居于肺发育受阻及损伤修复中心位置，是高氧肺损伤主要靶细胞之一^[18-21]。高氧可刺激新生大鼠AECII细胞转分化并抑制其增殖^[22-23]。Notch信号传导是正常肺生长及发育的必要条件，在肺发育过程中，Notch1/Hes1可在胎肺和AECII中动态表达，精细调节肺发育及肺上皮细胞增殖与分化过程^[24-26]。据报道炎症和高氧可改变Notch信号传导^[27-28]，高氧暴露下早产大鼠肺内和AECⅡ细胞中Notch1表达降低，并随Notch1活性减弱，肺损伤程度加重^[29-31]。Hes1作为Notch信号主要靶基因，其表达强弱与Notch通路活化程度呈正比^[32]，而Jagged1蛋白作为Notch通路激活剂已被广泛应用。与空气组比，空气激活剂组AECⅡ细胞中Notch1、Hes1 mRNA及蛋白表达水平均明显增加，表明Jagged1蛋白能成功激活Notch通路。该研究结果表明，激活Notch通路后，C/EBPα mRNA及蛋白表达水平均明显增加。

C/EBPα在肺中高度表达^[33-35]，并在各种组织细胞增殖及分化中起重要作用^[36-37]。C/EBPα 作为调节细胞增殖与分化关键转录因子，参与调控妊娠后期呼吸道上皮细胞增殖与分化过程，并参与维持肺功能所必需肺泡表面活性物质合成^[38-40]。C/EBPα是生后高氧条件下AECII增殖的重要调节因子，可调节新生儿肺泡损伤和修复^[41]，高氧暴露下，C/EBPα在维持肺表面活性物质体内平衡和肺功能方面起重要作用，并在氧化应激下维持细胞氧化还原稳态^[42]。De Obaldia等^[11]研究发现，在T细胞发育过程中，Hes1直接结合于C/EBPα启动子，调控C/EBPα转录。激活Notch信号可引起C/EBPα表达增加，骨髓祖细胞数量增加，而Notch信号被抑制后C/EBPα表达水平和骨髓祖细胞数量恢复到对照水平^[43]，提示Notch信号可调控C/EBPα表达，从而影响骨髓祖细胞增殖，Notch1/Hes1信号是否调控C/EBPα表达并影响高氧损伤AECII增殖与分化功能，目前尚不清楚。此次研究结果显示，与空气组比，高氧损伤的AECⅡ中Notch1、Hes1及C/EBPα mRNA及蛋白表达水平均明显降低，CCK-8吸光度值降低，AECII增殖减弱，这与前人报道的结果一致^[44-46]。汪鸿等^[31]发现，高氧损伤的AECⅡ细胞中Notch1活化入核受阻，Notch信号通路转导受抑，结合此次实验研究结果，Notch1、Hes1及C/EBPα 表达减少，AECⅡ细胞增殖减弱，推测高氧损伤的AECⅡ细胞中Notch1、Hes1及C/EBPα mRNA及蛋白表达水平均明显降低，AECII增殖减弱可能与高氧损伤时AECⅡ细胞中Notch1活化入核受阻，Notch信号通路转导受抑有关。为进一步论证Notch1/Hes1信号可调控C/EBPα表达从而影响AECⅡ增殖功能，利用Notch通路激活剂，结果发现常氧下，空气激活剂组C/EBPα表达增加，CCK-8吸光度值增加，AECII增殖增强，AECII增殖与C/EBPα表达增加趋势一致，说明激活Notch1/Hes1信号可增加C/EBPα表达并促进AECII增殖；与高氧组比，高氧激活剂组CCK-8吸光度值增加，AECII增殖增强，表明高氧下激活Notch1/Hes1信号也可调控C/EBPα表达并促进AECII增殖。

研究发现，Notch信号通路可调控C/EBPα表达促进骨髓祖细胞向肥大细胞分化，淫羊藿甙可通过Notch信号通路抑制C/EBPα表达，从而抑制间充质干细胞分化为脂肪细胞^[47-48]。在脂肪组织中，Notch信号通路激活后，C/EBPα表达上调，从而调节前脂肪细胞分化^[49]，提示Notch信号可调控C/EBPα表达从而影响细胞分化功能。利用流式细胞术标记AECI表面标志AQP5反映AECI数量间接反映AECII分化过程，研究发现在常氧下，空气激活剂组AQP5阳性细胞百分比明显减少，AECII分化降低，而C/EBPα表达增加，提示AECII分化抑制可能与Notch1/Hes1信号激活导致C/EBPα增加有关。与高氧组比，高氧激活剂组AQP5阳性细胞百分比明显减少，AECII分化降低，推测高氧下激活Notch1/Hes1信号可抑制AECII分化，高氧下激活此通路可影响AECII分化功能。

综上所述，Notch1/Hes1信号可调控C/EBPα表达影响高氧损伤AECII细胞的增殖与分化功能，这为高氧肺损伤靶点治疗选择提供一种可能，但具体靶点治疗有待进一步深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Notch1/Hes1信号调控CCAAT/增强子结合蛋白α表达对高氧损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖与分化的影响

Effect of Notch1/Hes1 signal regulating the expression of CCAAT/enhancer-binding protein alpha on the proliferation and differentiation of type II alveolar epithelial cells induced by hyperoxia

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