甲氨蝶呤联合双氯芬酸钠治疗关节炎模型大鼠的微环境变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0368

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (32): 5163-5168.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0368

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甲氨蝶呤联合双氯芬酸钠治疗关节炎模型大鼠的微环境变化

牛梓晗1，冉新建2，麦伍拉尼•马木提1，潘传鹏1，何东航3，任聪改3，徐琦4

新疆医科大学，1临床医学院，2基础医学院机能中心， 3基础医学院，4基础医学院免疫学教研室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011

收稿日期:2018-04-19 出版日期:2018-11-18 发布日期:2018-11-18
通讯作者: 徐琦，博士，教授，研究生导师，新疆医科大学基础医学院免疫学教研室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
作者简介:牛梓晗，女，1996年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，新疆医科大学临床医学在读本科。
基金资助:
国家级大学生创新性实验计划重点项目(CX 201610760022)

Changes of microenvironment in a rat model of arthritis treated by the combination of methotrexate and diclofenac sodium

Niu Zi-han1, Ran Xin-jian2, Mawlan•Mamut1, Pan Chuan-peng1, He Dong-hang3, Ren Cong-gai3, Xu Qi4

1School of Clinical Medicine, 2Laboratory Center of Mechanism, 3School of Basic Medicine, 4Department of Immunolgy, School of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2018-04-19 Online:2018-11-18 Published:2018-11-18
Contact: Xu Qi, MD, Professor, Master’s supervisor, Department of Immunolgy, School of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Niu Zi-han, School of Clinical Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Key Project of College Student Innovative Research Program, No. CX 201610760022

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
胶原诱导性关节炎：研究类风湿关节炎较为常用和理想的动物模型，通过皮内注射用佐剂乳化的Ⅱ型胶原诱导激发一种攻击自身关节的免疫炎症反应，其中T细胞激活、细胞因子的分泌和Ⅱ型胶原抗体等产生是胶原诱导性关节炎发病的重要环节，主要的临床表现为多发性的末端关节炎。
Th17/Treg细胞平衡：新近发现Th17/Treg细胞平衡对类风湿关节炎的发病机制起重要作用。以此建立胶原诱导性关节炎模型，从炎性细胞因子、T淋巴细胞亚群平衡与细胞特异性转录因子角度，认识甲氨蝶呤联合双氯芬酸钠治疗类风湿关节炎的作用机制。

摘要
背景：类风湿关节炎是以小关节疼痛肿胀及晨僵为主要临床表现的自身免疫性疾病，目前药物治疗主要通过非类固醇抗炎药联合使用改善病情抗风湿药物，但其药物对T细胞亚群平衡的影响及其机制目前尚不清楚。
目的：探讨甲氨蝶呤联合双氯芬酸钠治疗胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠对Th17/Treg细胞平衡的影响及其作用机制。
方法：建立雄性Wistar大鼠胶原诱导性关节炎模型，随机分为空白组、模型组、甲氨蝶呤组、双氯芬酸钠组、甲氨蝶呤联合双氯芬酸钠组(联合用药组)、阳性对照组。通过每周评定关节炎指数、测量足趾肿胀程度判断造模成功。药物治疗4周后取材，酶联免疫吸附实验检测外周血中白细胞介素10、转化生长因子β等细胞因子表达情况；流式细胞术检测脾脏Th17及Treg细胞的比例变化情况；RT-PCR法分别检测脾脏中Th17、Treg细胞的转录因子ROR-γt及Foxp3的mRNA表达。
结果与结论：①药物治疗后，甲氨蝶呤组、双氯芬酸钠组、联合用药组与模型组比较，各治疗组均可改善大鼠一般状况及足趾肿胀程度、降低关节炎指数评分、减少炎症细胞浸润、抑制转录因子ROR-γt调控Th17细胞分化、调控转录因子Foxp3诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg高分化，从而恢复Treg/Th17比例平衡，改善胶原诱导性关节炎大鼠关节炎症状，各组间平均灰度值差异有显著性意义(P < 0.05)；②联合组关节炎指数下降趋势更明显，且关节炎症状轻于其他造模组；双氯芬酸钠组能上调模型组大鼠外周血白细胞介素10、白细胞介素6表达，甲氨蝶呤组下调转化生长因子β水平占优势，联合用药组能显著上调模型组血清白细胞介素6、白细胞介素10水平，下调转化生长因子β表达；联合用药组能有效上调模型组Treg/Th17比例，显著抑制转录因子Foxp3及ROR-γt表达；③结果提示甲氨蝶呤联合双氯芬酸钠治疗具有协同效应，为治疗类风湿关节炎提供理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-2361-1421(牛梓晗)

关键词: 胶原诱导性关节炎, 甲氨蝶呤, 双氯芬酸钠, 调节性T细胞, Th17细胞, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Rheumatoid arthritis is an autoimmune disorder that typically results in swollen and painful facet joints and morning stiffness. Its drug therapy is mainly the combination of non-steroidal anti-inflammatory drugs and anti-rheumatic drugs, however, the drug effects on the T-lymphocyte subset balance and the underlying mechanism remain unclear.
OBJECTIVE: To explore the effect of the combination of methotrexate and diclofenac sodium on the balance of Th17/Treg cells in a rat model of collagen-induced arthritis.
METHODS: After the male Wistar rat model of collagen-induced arthritis model was established, they were randomly divided into blank control, model, methotrexate, diclofenac sodium, methotrexate + diclofenac sodium, and positive control groups. They were assessed by measuring the arthritis index and toe swelling degree. After 4-week treatment, the expression levels of interleukin 10 and transforming growth factor β in the peripheral blood was detected by ELISA, and the change in Th17/Treg cells in the spleen was tested by flow cytometry; the mRNA expression levels of Foxp3 and ROR-γt in the spleen were examined by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, methotrexate, diclofenac sodium, and their combination could improve the general condition, reduce toes swelling degree, lower arthritis index (especially the methotrexate + diclofenac sodium group), reduce inflammation cell infiltration, and inhibit ROR-γt regulating Th17 cell differentiation and regulating the Foxp3-induced high differentiation of CD4+CD25+Foxp3+Tre, thereby restoring Treg/Th17 cell balance and improving the arthritis symptoms. The average gray value was significantly different among groups (P < 0.05). Except the down-regulation of interleukin 10 and interleukin 6 levels like diclofenac sodium, the combined therapy could down-regulate the expression level of transforming growth factor β, increase the Treg/Th17 cell proportion, and inhibit the expression of Foxp3 and ROR-γt. Additionally, methotrexate significantly reduced the expression level of transforming growth factor β. In summary, the combination of methotrexate and diclofenac sodium possesses a synergistic effect, which provides the theoretical foundation for the treatment of rheumatoid arthritis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Arthritis, Methotrexate, Th17 Cells, T-Lymphocytes, Cytokines, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

牛梓晗，冉新建，麦伍拉尼•马木提，潘传鹏，何东航，任聪改，徐琦. 甲氨蝶呤联合双氯芬酸钠治疗关节炎模型大鼠的微环境变化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(32): 5163-5168.

Niu Zi-han1, Ran Xin-jian2, Mawlan•Mamut1, Pan Chuan-peng1, He Dong-hang3, Ren Cong-gai3, Xu Qi4. Changes of microenvironment in a rat model of arthritis treated by the combination of methotrexate and diclofenac sodium[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(32): 5163-5168.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 60只大鼠中空白对照组10只，剩余50只均进行胶原诱导性关节炎造模，成模大鼠43只，成模率约为86%。将造模成功后的43只大鼠进行后续实验，纳入实验中的5组大鼠实验过程中死亡3只，最终共57只Wistar大鼠纳入结果分析。建模流程图见图1。

2.2 大鼠关节炎指数评分造模成功后模型组大鼠在第2次免疫1周后出现明显关节炎症状：后足及足趾部位肿胀、红肿，然后逐渐加重，第2次免疫4周后出现炎症高峰，严重者不能负重，关节功能障碍，随后炎症逐渐消退。药物灌胃治疗后甲氨蝶呤组、联合用药组、阳性对照组评分均有不同程度下降，联合组下降趋势更明显，且关节炎症状轻于其他造模组(见图2)。对照组10只大鼠则在整个实验过程中均未出现关节红肿( =0)。

2.3 各组大鼠分泌细胞因子的变化经ELISA检测，结果显示与空白组相比，模型组外周血中白细胞介素6明显升高，转化生长因子β、白细胞介素10均有降低；双氯芬酸钠组能上调模型组大鼠外周血白细胞介素10、白细胞介素6表达，甲氨蝶呤组下调转化生长因子β水平占优势，联合用药组协同两者能显著上调模型组血清白细胞介素6、白细胞介素10水平，下调转化生长因子β表达；阳性对照组能显著上调模型组外周血中转化生长因子β及白细胞介素10，其对模型组白细胞介素6水平的调节无统计学差异。见表1。

2.4 脾脏组织中Treg及Th17的变化流式细胞术检测结果见表2，图3。与空白组相比，模型组脾脏中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg数量减少，CD4⁺IL-17⁺Th17数量明显增加，Treg/Th17比例显著降低。各治疗组对比模型组脾细胞中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg表达均有所升高，甲氨蝶呤组含量显著升高，而CD4⁺IL-17⁺Th17细胞含量均比模型组减少，其中阳性对照组减少更为显著；联合用药组能有效上调模型组Treg/Th17比例。

2.5 脾脏中转录因子Foxp3及ROR-γt的表达经RT-PCR检测，与空白组相比，模型组均能上调大鼠脾脏中转录因子Foxp3、ROR-γt表达，其中ROR-γt显著表达；各治疗组均能不同程度地抑制模型组脾细胞中Foxp3及ROR-γt表达，甲氨蝶呤组抑制转录因子Foxp3作用最为显著，双氯芬酸钠组抑制转录因子ROR-γt作用最为显著；联合用药组能显著抑制转录因子Foxp3及ROR-γt表达，且调控两者含量基本相等。见表3。

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引言

类风湿关节炎是一种以慢性、进行性关节病变为主的全身性自身免疫病，其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，导致关节畸形及功能丧失^[1]。治疗类风湿关节炎的常用药物分为五大类，即非类固醇抗炎药、改变病情抗风湿药、糖皮质激素、植物药、生物制剂等^[2]。其中，甲氨蝶呤作为治疗类风湿关节炎的首选，其疗程较长且常与非类固醇抗炎药联合用药改善类风湿关节炎症状。双氯芬酸钠属于非类固醇抗炎药，主要抑制环氧合酶从而减少致炎因子的生成，其作用强，临床联合甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎疗效确切^[3-7]。

新近研究表明，Th17和Treg细胞比例平衡能影响类风湿关节炎的发生和转归。初始CD4⁺T细胞只在转化生长因子β的诱导下，可分化成Treg细胞。当同时存在白细胞介素6时，即分化成Th17细胞。Th17主要在ROR-γt调控下分泌白细胞介素17、白细胞介素6等促炎症因子，过分激活中性粒细胞，导致关节滑膜炎症、骨折破坏、血管翳形成。Treg细胞在Foxp3调控下分泌的转化生长因子β和白细胞介素10抑制炎性反应和维持自身免疫耐受。因此Th17/Treg细胞平衡失调，将引起自身免疫疾病的发生^[8]。甲氨蝶呤联合双氯芬酸钠是临床治疗类风湿关节炎的有效药，但其对Th17细胞、Treg细胞作用机制尚不明确。因此，检测胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠中Th17细胞、Treg细胞含量及细胞因子白细胞介素6、转化生长因子β和白细胞介素10的表达、重要转录因子ROR-γt、Foxp3的变化对探讨联合药物治疗类风湿关节炎的发生、发展中Th17/Treg细胞平衡失调机制尤为重要。

该研究拟通过构建胶原诱导性关节炎大鼠模型，检测甲氨蝶呤联合双氯芬酸钠治疗类风湿关节炎的过程中对Th17、Treg细胞数量、表型，功能及转录因子的影响，从Th17/Treg细胞平衡角度研究其作用机制，进而为临床联合用药治疗类风湿关节炎提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物模型实验。

1.2 时间及地点于2016年5月至2017年5月在新疆医科大学实验动物中心完成。

1.3 材料

实验动物：SPF级Wistar雄性大鼠60只，6周龄，体质量(200±20) g，购于新疆医科大学实验动物中心，动物质量合格证号：SCXK(新)2016-0002。

药物：甲氨喋呤片，上海信谊药厂；双氯芬酸钠缓释胶囊，江苏先声药业；布洛芬缓释胶囊，中美天津史克制药。

实验主要试剂及仪器：牛Ⅱ型胶原、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自美国Sigma公司；白细胞介素6、白细胞介素10、转化生长因子βELISA检测试剂盒均购自eBioscience公司；FITC anti-rat CD4和PE anti-rat CD25、PE-cy7 anti-rat白细胞介素17抗体、Percp anti-rat Foxp3抗体购自eBioscience公司；PCR引物合成于上海生工生物有限公司；多功能酶标仪购于Biotek synergy2公司；流式细胞仪LSR-Ⅱ购于BD公司；实时定量PCR仪和荧光定量PCR检测系统(MyiQTM2 Two color Real-Time PCR Detection)购自Bio-Rad公司。

1.4 实验方法

1.4.1 胶原诱导性关节炎动物模型制备及分组将60只Wistar大鼠随机分成6组：空白组、模型组、甲氨蝶呤组、双氯芬酸钠组、联合用药组、阳性对照组，每组10只。除空白组外各组大鼠按照文献方法建立胶原诱导性关节炎模型^[9-12]。将牛Ⅱ型胶原溶于0.1 mol/L的醋酸溶液中，配制成2 g/L的胶原溶液，使之充分混匀。与等体积CFA充分乳化，配制成1 g/L的胶原乳剂。于大鼠背部、尾根部皮下多点注射胶原乳剂0.3 mL。初次免疫7 d后，进行2次免疫，按0.3 mL/只胶原乳剂注射于大鼠足跖部、尾根部。空白组在实验过程中不做任何处理。

1.4.2 药物治疗第1次免疫28 d后，各治疗组均采用灌胃给药法给予药物治疗：甲氨蝶呤组(1 mg/kg)、双氯芬酸钠组(5 mg/kg)、联合用药组(0.5 mg/kg甲氨蝶呤+ 2.5 mg/kg双氯芬酸钠)、阳性对照组(50 mg/kg布洛芬)，其中甲氨蝶呤组1周1次，双氯芬酸钠组1次/d，阳性对照组 2次/d，连续给药28 d。

1.4.3 大鼠一般情况及关节炎指数评分记录大鼠每日食物摄入量、每周体质量变化及每日观察其行为和注射部位局部情况。第1次免疫后观察各组大鼠关节红肿程度并进行关节炎指数(arthritis index，AI)的评定，采用4分制评分标准，标准如下^[13-14]：0分：无关节炎症；1分：小趾关节足趾肿胀；2分：大部分足趾和足底肿胀；3分：踝关节及以下全部肿胀；4分：踝关节以内全部足趾肿胀，不能负重。关节炎指数=四肢关节评分之和。每只大鼠的最高分为16分，分别计算各组大鼠造模前及第2次免疫后7，14，21，28 d时的关节炎指数并观察足趾肿胀情况。关节炎指数评分≥6分提示造模成功。

1.4.4 酶联免疫吸附实验检测药物治疗4周后取材。心脏取血后以3 000 r/min离心5 min，取上层大鼠血清5 μL分别加入各待检测96孔板。将白细胞介素6、白细胞介素10、转化生长因子βAssay Diluent B按有关试剂盒说明进行梯度稀释后各板加入100 μL，室温孵育1 h，用Wash Buffer共洗板5次后，加入100 μL稀释的Assay Diluent B，室温孵育30 min，充分洗板，各板加入90 μL底物室温避光孵育20 min，最后各板加入50 μL终止液后，酶标仪检测450 nm处的吸光度(A)值，其浓度与A₄₅₀值成正比。

1.4.5 流式细胞术检测药物治疗4周后取材。取脾脏充分研磨制成淋巴细胞悬液，分别加入阳性管FITC anti-rat CD4和PE anti-rat CD25单克隆抗体进行表面染色，阴性管加入相应的同型抗体进行对照，室温避光孵育20 min；加入600 μL PBS洗涤，3 000 r/min离心5 min弃上清液；加入90μLPBS重悬、200 μL固定液，室温避光孵育20 min；加入600 μL稀释后的破膜剂，离心5 min，弃上清；加入 200 μL稀释后的破膜剂重悬，分别加入PE-cy7标记的白细胞介素17和Percp标记的Foxp3抗体及其同型对照抗体 20 μL室温避光孵育20min；加入500 μL PBS洗涤后离心弃上清液，加入600 μL PBS重悬后移入流式管后检测；以CD4⁺细胞设门，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg代表调节性T细胞，以CD4⁺IL-17⁺Th17代表Th17细胞，分析Foxp3、白细胞介素17的表达以及Th17及Treg细胞的比例变化情况。

1.4.6 RT-PCR检测 Foxp3、ROR-γt mRNA的表达按照试剂盒说明，从脾脏中提取小片段RNA，检测转录因子Foxp3、ROR-γt的mRNA水平，并用反转录酶反转录后得到cDNA。Foxp3上游引物：5′-ACC GTA TCT CCT GAG TTC CAT-3′下游引物：5′-GTC CAG CTT GAC CAC AGT TTAT-3′ROR-γt上游引物：5′-TCT GGA AGC TGT GGG ATA GA-3′下游引物：5'-GAG GAG CCT GTG GAG AAA TAC-3′，引物均委托上海生工生物有限公司合成。扩增条件：预变性94 ℃ 2 min(变性94 ℃ 30 s；退火60 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 1 min)共进行35个循环，最后72 ℃ 10 min充分延伸，扩增产物382 bp。用凝胶成像系统行吸光度扫描半定量，与内参GAPDH密度扫描值之比，作为评价mRNA相对表达量的指标。

1.5 主要观察指标 ①各组大鼠足趾关节肿胀程度；②组织病理学观察脾脏炎细胞浸润情况；③白细胞介素10、白细胞介素6、转化生长因子β炎症细胞因子表达情况；④Th17及Treg细胞的比例变化情况；⑤Th17、Treg细胞的转录因子ROR-γt及Foxp3的mRNA表达。

1.6 统计学分析数据处理采用SPSS 13.0软件，结果均以x(_)±s表示，组间数据比较采用两样本t 检验，P ≤ 0.05认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

类风湿关节炎呈全球性分布，在中国患病率高达0.4%，是造成人类劳动力丧失的主要原因之一^[15]，基本病理改变为滑膜炎、形成血管翳并逐渐形成软骨和骨破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。类风湿关节炎的发病机制尚不明确，目前研究认为该病是环境因素、遗传易感性、免疫紊乱等因素综合作用的结果^[16-21]。临床上治疗类风湿关节炎的药物主要有非类固醇抗炎药、改变病情抗风湿药、糖皮质激素、植物药、生物制剂等，其中甲氨蝶呤属于抗风湿药且作为类风湿关节炎的首选药，主要抑制二氢叶酸还原酶从而使二氢叶酸不能转化成四氢叶酸，导致嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成中一碳单位的转移作用受阻，抑制DNA的生物合成。甲氨蝶呤发挥作用较慢，常将它作为联合治疗的基本药物，为改善活动性关节炎的症状常与非类固醇抗炎药同服^[22-24]。

双氯芬酸钠抑制抑环氧化酶，该酶能导致白三烯的生成，特别对白三烯B4的抑制作用更加明显，同时抑制花生四烯酸环氧酶系统，导致前列腺素E2和血小板生成的减少，前列腺素E2参与骨质和软骨的破坏并且在关节局部高水平前列腺素E2是类风湿关节炎关节肿疼的重要因素，从而起到较强的镇痛抗炎作用。虽然其血浆半衰期短，但能迅速渗入滑液中且存留长达12 h，因此此药能有效缓解关节肿胀和疼痛^[25-26]。类风湿关节炎患者服用后不良反应小，镇痛抗炎效果明显，有利于患者长期服用。

最近研究表明，Treg和Th17细胞在介导类风湿关节炎炎症反应，关节软骨和骨质破坏及骨侵蚀中发挥重要作用^[27-30]。Treg是一种具有免疫抑制效应的CD4⁺T细胞亚群，其抑制活性有赖于重要转录因子Foxp3的持续表达调控，Treg细胞释放白细胞介素10、转化生长因子β细胞因子发挥抑制抗原提呈细胞和T细胞功能，减少炎性细胞因子的产生而发挥免疫抑制效应^[31-34]。只在转化生长因子β的诱导下，初始CD4⁺T细胞可分化成Treg细胞。当同时存在白细胞介素6时，可诱导表达ROR-γt抑制产生Treg细胞，从而促进初始CD4⁺T细胞可分化成Th17细胞^[35-36]。Th17细胞是一种在核转录因子ROR-γt调控下主要分泌白细胞介素17的CD4⁺T细胞亚群白细胞介素17作为炎症反应的早启动因子能促进中性粒细胞动员激活的过程，同时释放前炎性细胞因子来放大炎症反应。Th17细胞还分泌白细胞介素6、白细胞介素22、白细胞介素21、肿瘤坏死因子α等细胞因子，参与自身免疫反应^[37-42]。Treg和Th17细胞能在特定细胞因子的微环境中相互转换，因此研究Treg/Th17平衡在类风湿关节炎发病机制具有重要意义，一旦平衡被打破，将引起类风湿关节炎的发生。

该研究发现，在胶原诱导性关节炎大鼠模型中，初次免疫后16 d除对照组外各组大鼠非致炎侧足趾均出现明显红肿、疼痛、功能障碍。给予药物治疗前，除正常组外各组大鼠体质量减少，精神状态差，非致炎侧足趾持续肿胀。药物治疗后，各组足趾肿胀程度随药物疗程的增加而有所缓解，精神状态改善。其中，治疗1周后联合用药组能有效减轻足趾肿胀程度，迅速减轻大鼠的炎症反应。模型组大鼠在受到外来抗原免疫刺激下，高表达促炎因子白细胞介素6诱导转录因子ROR-γt的表达，抑制Treg细胞产生，促进初始CD4⁺T细胞分化为Th17细胞。脾脏中CD4⁺IL-17⁺Th17细胞及ROR-γt mRNA高表达均表明Th17细胞增多则促进炎症的发生，造成致炎关节部位疼痛、红肿等炎症状态。联合药物通过抑制环氧合酶、抑制炎症因子白细胞介素6的释放和抑制嘌呤、嘧啶的合成等机制，高表达的细胞因子转化生长因子β诱导CD4⁺T细胞分化成Treg细胞，脾脏中Foxp3 mRNA表达增加利于维持Treg细胞抑制活性，同时脾脏中数量明显增多的CD4⁺CD25⁺Treg细胞能缓解炎症反应，增强免疫耐受的能力。此次研究在细胞因子、细胞与mRNA相互印证阐明了各组药物对Treg细胞和Th17细胞的影响及Th17/Treg细胞比例平衡，有效改善类风湿关节炎关节肿疼、晨僵等炎症状态和病情的发生发展。在高勇等^[43]研究类风湿关节炎动物模型中，将白细胞介素17注入正常鼠膝关节腔后导致大量炎症细胞浸润、软骨侵蚀和骨质破坏，引起滑膜炎。此次实验尚未研究大鼠关节滑膜细胞造模及药物治疗后炎症浸润情况，故各组药物如何影响关节滑膜中Th17/Treg细胞比例平衡尚不清楚。

综上所述，该研究结果表明甲氨蝶呤联合双氯酸芬钠治疗类风湿关节炎在动物模型中效果良好，不良反应小，为临床长期治疗类风湿关节炎用药提供理论依据。特别结合研究了Th17/Treg平衡在类风湿关节炎发生、发展、治疗中的作用，为类风湿关节炎的发病机制提供了新思路，据此可拓展生物制剂靶向治疗的可能性^[44-47]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

甲氨蝶呤联合双氯芬酸钠治疗关节炎模型大鼠的微环境变化

Changes of microenvironment in a rat model of arthritis treated by the combination of methotrexate and diclofenac sodium

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