γ干扰素联合脂多糖诱导人脐带间充质干细胞向MSC2极化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2050

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (13): 2020-2027.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2050

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γ干扰素联合脂多糖诱导人脐带间充质干细胞向MSC2极化

黄恬^1，2，黄欣²，赖沛龙²，耿素霞²，陈晓梅²，王玉连²，郭礼妍²，曾高淳²，韩凤珍³，李晓红⁴，杜欣^1，2，翁建宇^1，2

¹华南理工大学医学院，广东省广州市 510006；²广东省人民医院血液科，广东省医学科学院，广东省广州市 510080；³广东省人民医院产科，广东省医学科学院，广东省广州市 510080；⁴广东省人民医院医学研究中心，广东省医学科学院，广东省广州市 510080

收稿日期:2019-08-05 修回日期:2019-08-08 接受日期:2019-10-14 出版日期:2020-05-08 发布日期:2020-03-08
通讯作者: 翁建宇，博士，主任医师，华南理工大学医学院，广东省广州市 510006；广东省人民医院血液科，广东省医学科学院，广东省广州市 510080
作者简介:黄恬，女，1994年生，广东省云浮市人，汉族，华南理工大学医学院在读硕士，主要从事间充质干细胞免疫功能调控及移植物抗宿主病防治的实验研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81671585，81370665)

Interferon-gamma combined with lipopolysaccharide polarizes human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells to a MSC2 phenotype

Huang Tian^{1, 2}, Huang Xin², Lai Peilong², Geng Suxia², Chen Xiaomei², Wang Yulian², Guo Liyan², Zeng Gaochun², Han Fengzhen³, Li Xiaohong⁴, Du Xin^{1, 2}, Weng Jianyu^{1, 2}

¹School of Medicine, South China University of Technology; ²Department of Hematology, Guangdong Provincial People’s Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences; ³Department of Obstetrics, Guangdong Provincial People’s Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences; ⁴Medical Research Center of Guangdong Provincial People’s Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

Received:2019-08-05 Revised:2019-08-08 Accepted:2019-10-14 Online:2020-05-08 Published:2020-03-08
Contact: Weng Jianyu, MD, Chief physician, School of Medicine, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; Department of Hematology, Guangdong Provincial People’s Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Huang Tian, Master candidate, School of Medicine, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; Department of Hematology, Guangdong Provincial People’s Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 81671585 and 81370665

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

γ干扰素联合脂多糖模拟炎症微环境：间充质干细胞的免疫抑制能力不是内在的，而是由促炎细胞因子诱导的。间充质干细胞暴露于炎症信号可显著增强其对T细胞、单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞的免疫抑制作用。γ干扰素由活化T细胞和NK细胞产生，激活抗原提呈细胞，上调转录因子T-bet 而促进Th1细胞分化；脂多糖是革兰阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，是免疫反应的强烈刺激剂，具有通过信号转导途径促进各种炎性细胞因子分泌的作用。

间充质干细胞可极化为MSC1和MSC2两种类型：间充质干细胞既可以抑制免疫应答，也可以促进免疫应答，不同的炎症递质会诱导间充质干细胞极化分型并表现出截然相反的免疫调节作用，这一特性称为间充质干细胞免疫调节的可塑性。间充质干细胞可以通过下游Toll样受体信号极化成2种类型：MSC1和MSC2。文献报道Toll样受体4引发的MSC1主要发挥促炎功能，而Toll样受体3引发的MSC2主要发挥免疫抑制功能。

背景：间充质干细胞的免疫调节特性已被临床广泛应用于自身免疫性疾病和移植物抗宿主病，但是其免疫调节的可塑性导致间充质干细胞临床治疗效果出现异质性和不稳定性。

目的：探索γ干扰素联合脂多糖模拟炎症微环境诱导人脐带间充质干细胞向MSC2极化的作用。

方法：体外分离培养人脐带间充质干细胞，进行形态学、表面标志物、成脂及成骨诱导分化能力鉴定。分别用γ干扰素(10 μg/L)、脂多糖(100 μg/L)及二者联合刺激人脐带间充质干细胞24 h，与植物凝集素刺激的外周血单个核细胞直接共培养或Transwell间接共培养5 d。流式细胞术检测共培养不同时间点调节性T细胞和Th1细胞比例，荧光定量PCR检测人脐带间充质干细胞的Toll样受体2，3，4 mRNA表达水平。

结果与结论：①人脐带间充质干细胞呈梭形或成纤维形，高表达CD73、CD90、CD105，低表达CD34、CD45、HLA-DR；②在直接与间接共培养条件下，γ干扰素联合脂多糖刺激人脐带间充质干细胞均可增加调节性T细胞的比例，优于γ干扰素或脂多糖单独刺激组、未刺激组及外周血单个核细胞对照组(P < 0.05)；③Th1细胞比例随共培养时间的延长呈逐渐下降的趋势；④在间接共培养的条件下，γ干扰素联合脂多糖刺激人脐带间充质干细胞更早向免疫抑制型MSC2极化，Toll样受体3表达显著增高(P < 0.05)；⑤以上结果表明间接共培养体系下γ干扰素(10 μg/L)联合脂多糖(100 μg/L)是诱导人脐带间充质干细胞向MSC2极化的高效组合，并且MSC2的免疫抑制作用不依赖于细胞间的直接接触，为MSC2来源外泌体将来应用于临床研究奠定实验基础。

ORCID: 0000-0001-7335-2558(黄恬)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 人脐带间充质干细胞, γ干扰素, 脂多糖, 调节性T细胞, Toll样受体

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells have been widely applied in autoimmune diseases and graft-versus-host diseases because of their immunomodulatory capabilities. However, mesenchymal stem cells have plasticity in immunomodulation, which leads to heterogeneity and instability when used in vivo.

OBJECTIVE: To investigate the polarization of human umbilical cord derived mesenchymal stem cells to an immunosuppressive phenotype (MSC2) in the inflammatory microenvironment induced by interferon-γ and lipopolysaccharide.

METHODS: Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were isolated and cultured in vitro, and then were identified by morphological characteristics, surface markers, adipogenesis and osteoinduction activity. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were treated with interferon-γ (10 μg/L), lipopolysaccharide (100 μg/L), or their combination for 24 hours, respectively, and were then co-cultured with phytohemagglutinin pre-treated peripheral blood mononuclear cells for 5 days under direct or Transwell indirect contact. The percentages of regulatory T cells and T helper 1 cells were analyzed by flow cytometry at different times. The mRNA expression levels of Toll-like receptors 2, 3 and 4 were detected by real-time fluorescence quantitative PCR.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Human umbilical cord derived mesenchymal stem cells exhibited spindle-shaped or fibroblast-like morphology, highly expressed CD73, CD90 and CD105, and lacked expression of CD34, CD45 and HLA-DR. (2) Under direct or indirect co-culture, human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells pre-treated with interferon-γ and lipopolysaccharide could promote the generation of regulatory T cells, which was superior to the interferon-γ, lipopolysaccharid, un-treated and control groups (P < 0.05). (3) The percentage of T helper 1 cells gradually decreased over time. (4) Under indirect co-culture, human umbilical cord derived mesenchymal stem cells pre-treated with interferon-γ and lipopolysaccharide were polarized into immunosuppressive MSC2 phenotype at an earlier period and highly expressed Toll-like receptor 3 (P < 0.05). (5) In conclusion, the combination of interferon-γ (10 μg/L) and lipopolysaccharide (100 μg/L) results in the high-efficient polarization of mesenchymal stem cells toward the MSC2 phenotype under indirect co-culture, and the immunosuppressive capability of MSC2 is independent of intercellular contact, which provides clinical evidence for the MSC2-derived exosome therapy in the future.

Key words: human umbilical cord derived mesenchymal stem cells, interferon-γ, lipopolysaccharide, regulatory T cells, Toll-like receptors

中图分类号:

黄恬, 黄欣, 赖沛龙, 耿素霞, 陈晓梅, 王玉连, 郭礼妍, 曾高淳, 韩凤珍, 李晓红, 杜欣, 翁建宇. γ干扰素联合脂多糖诱导人脐带间充质干细胞向MSC2极化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(13): 2020-2027.

Huang Tian, Huang Xin, Lai Peilong, Geng Suxia, Chen Xiaomei, Wang Yulian, Guo Liyan, Zeng Gaochun, Han Fengzhen, Li Xiaohong, Du Xin, Weng Jianyu. Interferon-gamma combined with lipopolysaccharide polarizes human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells to a MSC2 phenotype[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(13): 2020-2027.

图/表（结果） 4

2.1 人脐带间充质干细胞的鉴定结果镜下观察到人脐带间充质干细胞贴壁生长，呈成纤维样或梭形，折光性好。成脂诱导分化后，脂滴经油红O染色呈红色；成骨诱导分化后，钙结节经茜素红染色后呈红色。流式细胞术结果显示第3代人脐带间充质干细胞高表达CD73、CD90、CD105，低表达CD34、CD45、HLA-DR，见图1。这些结果表明，实验分离培养的人脐带间充质干细胞纯度高，符合国际细胞治疗协会关于间充质干细胞的标准^[9]。

2.2 人脐带间充质干细胞对调节性T细胞、Th1细胞的影响

2.2.1 直接共培养

(1)γ干扰素、脂多糖刺激人脐带间充质干细胞对调节性T细胞比例的影响：共培养第3天，刺激组与无刺激组间的调节性T细胞比例未见明显变化(P > 0.05)。共培养第4天和第5天，与单纯外周血单个核细胞组相比，刺激与无刺激人脐带间充质干细胞各组均发现调节性T细胞比例明显增加(P < 0.05)。共培养第4天时，与γ干扰素刺激组(10.11±0.7)%、脂多糖刺激组(9.55±0.4)%相比，γ干扰素联合脂多糖刺激组的调节性T细胞比例增加，为(11.6± 0.8)%，差异有显著性意义(P < 0.05)；共培养第5天时，γ干扰素联合脂多糖刺激组的调节性T细胞比例亦增加，为(12.8±0.8)%，与γ干扰素刺激组(11.5±0.7)%、脂多糖刺激组(8.7±0.8)%和无刺激组(10.7±1.2)%比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。连续观察结果显示：γ干扰素联合脂多糖刺激组共培养第5天的调节性T细胞比例未见明显高于第4天(P > 0.05)。

直接共培养条件下，人脐带间充质干细胞需要与外周血单个核细胞直接接触相互作用至少4 d的时间，调节性T细胞比例才发生显著性的差异，γ干扰素和脂多糖联合刺激提高调节性T细胞比例的作用最佳，见图2A、B。

(2)γ干扰素、脂多糖刺激人脐带间充质干细胞对Th1细胞比例的影响：共培养第3天，与单纯外周血单个核细胞组相比，刺激与无刺激人脐带间充质干细胞各组的Th1细胞比例均明显升高(P < 0.05)。共培养第4天，与单纯外周血单个核细胞组及无刺激人脐带间充质干细胞组相比，经γ干扰素、脂多糖或γ干扰素+脂多糖刺激人脐带间充质干细胞组Th1细胞比例均出现下降趋势(P > 0.05)。共培养第5天，与单纯外周血单个核细胞组相比，刺激人脐带间充质干细胞各组Th1细胞比例均明显下降，单纯外周血单个核细胞组为(19.8±3.4)%、γ干扰素刺激组为(13.7±1.1)%、脂多糖刺激组为(13±4)%、γ干扰素联合脂多糖刺激组为(12.3±4.0)%，差异有显著性意义(P < 0.05)。结果表明：随着培养时间延长，单纯外周血单个核细胞组的Th1细胞比例逐步上升，人脐带间充质干细胞共培养各组的Th1细胞比例逐步下降；在共培养第5天时，刺激人脐带间充质干细胞各组抑制Th1分化的作用优于无刺激人脐带间充质干细胞组，见图2C。γ干扰素和/或脂多糖刺激后可以降低Th1细胞比例，同时也表明其发挥免疫调节作用需要四五天的时间。

2.2.2 间接共培养

(1)γ干扰素、脂多糖刺激人脐带间充质干细胞对调节性T细胞比例的影响：共培养第3天，γ干扰素联合脂多糖刺激组调节性T细胞比例为(15.9±1.6)%，明显高于单纯外周血单个核细胞组(9.7±0.5)%、γ干扰素刺激组(12.6± 1.2)%、脂多糖刺激组(11.8±1.3)%和无刺激组 (10.4± 0.8)%，差异均有显著性意义(P < 0.05)；γ干扰素联合脂多糖刺激组和γ干扰素刺激组优于无刺激组(P < 0.05)，见图3A、B。共培养第4天和第5天，与单纯外周血单个核细胞组相比，刺激与无刺激的人脐带间充质干细胞各组调节性T细胞比例均明显增加(P < 0.05)。结果表明:间接共培养下，刺激后的人脐带间充质干细胞在早期(第3天)即可促进调节性T细胞比例增加，同时γ干扰素单独或联合脂多糖刺激人脐带间充质干细胞均可显著增强调节性T细胞比例。

(2)γ干扰素、脂多糖刺激人脐带间充质干细胞对Th1细胞比例的影响：随着培养的时间延长，单纯外周血单个核细胞组的Th1细胞比例逐步上升。共培养第4天，与外周血单个核细胞组相比，刺激与无刺激的人脐带间充质干细胞各组Th1细胞比例均开始下降，但持续时间较短；共培养第5天，仅脂多糖刺激组的Th1细胞比例仍明显下降 (P < 0.05)，其余各组均有回升趋势，见图3C。结果表明：在间接共培养体系下，人脐带间充质干细胞各组对Th1细胞的作用持续时间较短。

2.3 间接共培养体系下人脐带间充质干细胞Toll样受体2，3，4 mRNA的表达间接共培养第3天，γ干扰素联合脂多糖刺激人脐带间充质干细胞显著上调调节性T细胞比例，检测该状态下人脐带间充质干细胞Toll样受体2，3，4 mRNA的表达。与无刺激组比较，γ干扰素刺激组和γ干扰素联合脂多糖刺激组的Toll样受体3 mRNA表达水平明显增加(P < 0.05)；刺激各组之间相比，γ干扰素联合脂多糖刺激组Toll样受体3 mRNA的表达增加最显著，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4；100 μg/L 脂多糖联合γ干扰素有协同促进Toll样受体3表达的作用。刺激各组与无刺激组比较，Toll样受体2，4 mRNA的表达无明显差异。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验。

1.2 时间及地点 2019年4至7月在广东省人民医院医学研究中心完成。

1.3 材料

1.3.1 脐带和外周血标本足月剖宫产新生儿脐带来源于广东省人民医院产科，签署捐赠同意书。外周血来自健康志愿者，签署捐赠同意书。

1.3.2 实验试剂及实验仪器人脐带间充质干细胞完全培养基、人脐带间充质干细胞成骨诱导分化完全培养基、人脐带间充质干细胞成脂诱导分化完全培养基(Cyagen公司)；Ⅱ型胶原酶、PBS、间充质干细胞无血清培养基、RPMI1640基础培养基、青链霉素、澳洲胎牛血清、胰酶(Gibco公司)；Ficoll分离液(天津灏洋公司)；相关流式抗体、固定破膜剂(Ebioscience公司)；脂多糖、植物凝集素(Sigma公司)；人γ干扰素重组细胞因子(Peprotech公司)；RT-PCR及qPCR相关试剂(Takara公司)；流式细胞仪(BD公司)；细胞培养箱、离心机(Thermo Scientific公司)；PCR仪器(Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1 人脐带间充质干细胞分离培养取足月剖宫产新生儿脐带10-15 cm，在超净工作台中用含10%青链霉素的PBS冲洗脐带表面的血渍，去除外膜和动静脉，取华通氏胶，剪碎，加入Ⅱ型胶原酶(100-200 U/mL)，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中消化5-8 h，收集上清并经70目细胞筛过滤，离心后弃上清，用人脐带间充质干细胞完全培养基重悬后接种在10 cm培养皿中培养，24 h后换液，以后每3 d换液。采用倒置相差显微镜镜下观察人脐带间充质干细胞的形态，当达80%-90%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取第3代细胞进行实验。

1.4.2 人脐带间充质干细胞的鉴定取第3代人脐带间充质干细胞接种于6孔板中(2×10⁴/cm²)，成脂、成骨诱导分化按照Cyagen公司成骨成脂诱导分化完全培养基说明书进行诱导及染色，于镜下观察染色结果。取第3代人脐带间充质干细胞，分别加入CD73-PE、CD90-FITC、CD105-APC、CD34-PE、CD45-APC、HLA-DR-FITC流式抗体，避光室温孵育25 min，离心后用PBS重悬，上机检测。

1.4.3 外周血单个核细胞分离取健康志愿者外周血 10 mL，用等量的PBS稀释，充分混匀后，沿管壁缓慢加到装有10 mL Ficoll分离液的离心管中，600×g离心20 min，取第2层白膜层，重悬后即可得到人外周血单个核细胞。

1.4.4 人脐带间充质干细胞与外周血单个核细胞共培养

间接共培养：在24孔Transwell板中，取第3代人脐带间充质干细胞接种于下室(5×10⁴/孔)，加入脂多糖 (100 μg/L)或/和γ干扰素(10 μg/L)刺激24 h，然后在上室加入植物凝集素(2.5 mg/L)刺激后的外周血单个核细胞(5×10⁵/孔)。

直接共培养：将第3代人脐带间充质干细胞接种于24孔板中(5×10⁴/孔)，加入脂多糖(100 μg/L)或/和γ干扰素(10 μg/L)刺激24 h，然后再加入植物凝集素(2.5 mg/L)刺激后的外周血单个核细胞(5×10⁵/孔)。

实验分组：①外周血单个核细胞组；②外周血单个核细胞+人脐带间充质干细胞组；③外周血单个核细胞+γ干扰素刺激的人脐带间充质干细胞组；④外周血单个核细胞+脂多糖刺激的人脐带间充质干细胞组；⑤外周血单个核细胞+γ干扰素联合脂多糖刺激的人脐带间充质干细胞组。每组设置3孔，复测3次。

1.4.5 流式细胞仪检测调节性T细胞和Th1细胞比例

调节性T细胞比例检测：在共培养第3，4，5天收集各组人脐带间充质干细胞，标记表面抗体CD4-FITC和CD25-PE，固定、破膜后加入核内抗体Foxp3-APC和IgG2-APC同型对照抗体，流式细胞术检测CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞的比例。

Th1细胞比例检测：在共培养第3，4，5天收集各组人脐带间充质干细胞，加入胞内刺激因子刺激5 h，标记表面抗体CD3-FITC和CD8-PE，固定、破膜后加入胞内抗体IFN-γ-APC和IgG1-APC同型对照抗体，流式细胞术检测CD3⁺CD8^-IFN-γ⁺细胞的比例。

1.4.6 RT-qPCR检测人脐带间充质干细胞中Toll样受体2，3，4的mRNA表达水平用Trizol试剂提取间接共培养各组人脐带间充质干细胞的总RNA。按照反转录试剂盒说明书，取5.5 μL总RNA，加入2 μL 5×的PrimeScript Buffer，2 μL Random 6 mers和0.5 μL PrimeScript RT Enzyme Mix，反转录出cDNA用于检测Toll样受体2，3，4 mRNA的表达水平。按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书，以GAPDH为内参照，反应体系为(20 μL体系)上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 μL、TB Green Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL、灭菌水 6 μL、cDNA 2 μL。应用Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System仪器进行PCR反应及结果分析。以2^-^ΔΔCt来计算Toll样受体2，3，4的相对表达水平。引物序列见表1^[8]。

1.5 主要观察指标 ①人脐带间充质干细胞形态、表面标志物表达以及成骨成脂分化潜能；②γ干扰素和脂多糖刺激后人脐带间充质干细胞对调节性T细胞、Th1比例的影响；③与外周血单个核细胞共培养后，人脐带间充质干细胞中Toll样受体2，3，4 mRNA的表达。

1.6 统计学分析应用SPSS 25.0统计软件分析数据，计量数据用x(_)±s表示，多组间均数比较用单因素方差分析，进一步两两组间比较采用LSD检验，连续观察的变量采用重复测量的方差分析。统计结果均采用GraphPad Prism5作图。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

一直以来，间充质干细胞的免疫调节功能备受关注。近几年的研究表明，在炎症环境中间充质干细胞可通过释放各种递质，包括生长因子、趋化因子、补体成分和各种代谢物等，协调局部和系统的先天性和适应性免疫应答^[10-14]；其免疫调节作用主要表现为抑制T细胞增殖和向Th1、Th17细胞分化，促进调节性T细胞分化、CD5⁺调节性B细胞增殖及巨噬细胞向M2极化等。调节性T细胞可分为天然调节性T细胞和诱导转化的调节性T细胞，是维持自身免疫耐受和平衡的关键因素^[15-17]，表现为维持T细胞的体内平衡^[18]，促进移植后的免疫耐受^[19-20]，防治移植物抗宿主病^[21-24]。

越来越多的证据显示，间充质干细胞的免疫调节具有双向性，在不同的炎症微环境下可以表现为促炎(MSC1)和抑炎(MSC2)两种模式。在低炎症环境下如低水平的肿瘤坏死因子α和γ干扰素，间充质干细胞会释放一些趋化因子如CXCL9、CXCL10、RANTES等，募集T细胞，增强T细胞反应，发挥促炎作用，即极化为MSC1^[25]。另外，低质量浓度短时间脂多糖(10 μg/L，1 h)刺激可使间充质干细胞的Toll样受体4激活，也可极化为MSC1^[7^，^26]。在高质量浓度脂多糖(5 mg/L，24 h)刺激下，间充质干细胞则极化为MSC2，表现出免疫抑制作用^[27]。在促炎环境下如存在着高水平的γ干扰素、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α，间充质干细胞会释放较多的吲哚胺-2，3-双加氧酶、血红素加氧酶、转化生长因子β等，发挥抗炎的作用，即极化为MSC2^[28-29]。另外，通过dsRNA(Toll样受体3特异性配体)使间充质干细胞的Toll样受体3激活，也可极化为MSC2^[7^，²⁶^，^30]。Toll样受体在间充质干细胞中的活化差异引起促炎和抗炎不同的后果，因此间充质干细胞中Toll样受体的激活充当了双刃剑。如何获得功能稳定的MSC2，以达到最佳的临床应用效果？目前尚未见相关报道。

该研究以体外获得稳定的MSC2为目的，探讨不同培养方式、炎症环境对间充质干细胞免疫调节功能的影响。在间接共培养下，刺激后的人脐带间充质干细胞发挥免疫抑制作用更快更强，表现为调节性T细胞比例在培养早期较对照组明显增加。研究报道，间充质干细胞与外周血单个核细胞直接共培养四五天，活化T细胞的增殖受抑制，调节性T细胞的增殖也受抑制^[31-33]；而间充质干细胞的浓缩培养上清液对活化T细胞的增殖无明显影响，并且可增加调节性T细胞的比例^[34-35]。作者认为，在直接培养条件下，细胞间的直接接触可诱导间充质干细胞抑制调节性T细胞增殖；而在间接共培养的条件下，间充质干细胞不对调节性T细胞增殖产生抑制作用，从而更好地发挥免疫抑制功能。另外，间充质干细胞需要在炎症因子激活下才能获得免疫调节功能^[36-37]。γ干扰素激活后的间充质干细胞可促进CXCL9、CXCL10、诱导型一氧化氮合酶等物质分泌，抑制促炎因子的产生^[28]，从而发挥间充质干细胞的免疫抑制作用。该研究采用γ干扰素和中质量浓度脂多糖组合预刺激人脐带间充质干细胞，能更快地发挥上调调节性T细胞比例的作用，同时明显优于γ干扰素或脂多糖单独刺激组。该研究首次证实：γ干扰素和中质量浓度脂多糖对于促进人脐带间充质干细胞上调调节性T细胞的功能具有协同作用。该研究还发现γ干扰素和中质量浓度脂多糖联合刺激人脐带间充质干细胞高表达Toll样受体3，与文献报道MSC2表型一致^[38]。这些结果表明，γ干扰素联合脂多糖刺激人脐带间充质干细胞可能通过活化Toll样受体3、促进MSC2极化，上调调节性T细胞比例、降低Th1比例，发挥免疫抑制作用。

该研究首次报道了γ干扰素(10 μg/L)联合脂多糖 (100 μg/L)是诱导人脐带间充质干细胞向MSC2极化的高效组合，并且其免疫抑制作用不依赖于细胞间接触，可通过其分泌的物质实现免疫调节作用。间充质干细胞主要是通过分泌哪些物质来发挥免疫调节功能呢？具体机制又是如何？既往文献报道，间充质干细胞可分泌多种生长因子、趋化因子、炎症因子等来发挥作用^[39-42]，然而没有任何一个足以解释间充质干细胞的效应。有学者认为，间充质干细胞的功能是其分泌物质的协同效应^[42]，而间充质干细胞来源的细胞外囊泡(MSC-EVs)由于包含间充质干细胞的多种分泌物质，成为解释这种效应的理想物质。近年来越来越多研究发现，间充质干细胞分泌的细胞外囊泡具有与母细胞相似的免疫调节功能^[43-46]，且体积小、无致瘤性、性质稳定，具有巨大的临床应用前景^[47-48]，使之成为研究热点。因此，进一步深入探讨间充质干细胞分泌的细胞外囊泡的免疫调节功能及其相关机制，可更好地阐明间充质干细胞的作用机制，也可为将来临床应用MSC2来源外泌体进行无细胞治疗移植物抗宿主病奠定实验基础。

γ干扰素联合脂多糖诱导人脐带间充质干细胞向MSC2极化

Interferon-gamma combined with lipopolysaccharide polarizes human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells to a MSC2 phenotype

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