2.1  人脐带间充质干细胞抑制植物血凝素刺激的外周血单个核细胞增殖  为检测人脐带间充质干细胞对外周血淋巴细胞增殖的调节作用，将CFSE标记的外周血单个核细胞与人脐带间充质干细胞按不同比例共培养3 d，流式细胞术检测外周血单个核细胞增殖情况。结果显示，与植物血凝素刺激的外周血单个核细胞阳性对照组相比，当人脐带间充质干细胞与外周血单个核细胞以1∶5，1∶10，1∶20的比例共培养时，分别有45%、71%和83%的外周血单个核细胞发生了增殖，见图1。以上结果提示，人脐带间充质干细胞能够显著抑制植物血凝素刺激外周血单个核细胞的增殖(P < 0.05或P < 0.001)；且呈剂量依赖性。



2.2  人脐带间充质干细胞对外周血单个核细胞增殖的抑制作用依赖于细胞间接触  采用Transwell系统对人脐带间充质干细胞与外周血单个核细胞进行非接触共培养，并与直接接触的共培养比较，以确定细胞间直接接触是否为人脐带间充质干细胞抑制淋巴细胞增殖的必要条件。结果显示，与植物血凝素刺激的外周血单个核细胞阳性对照组相比，人脐带间充质干细胞对直接接触共培养组外周血单个核细胞增殖有非常显著性抑制作用(P < 0.001)，而对Transwell非接触共培养组外周血单个核细胞的增殖则无显著性抑制作用(P > 0.05)，见图2。这一结果提示人脐带间充质干细胞对外周血单个核细胞增殖的抑制作用依赖于细胞间接触。



2.3  人脐带间充质干细胞抑制Th1、Th17淋巴细胞亚群的分化  将人脐带间充质干细胞和外周血单个核细胞以1∶10的比例共培养2 d，流式细胞术检测CD4⁺辅助性T淋巴细胞中Th1(CD4⁺IFN-γ⁺)和Th17(CD4⁺IL-17A⁺)的比例。与外周血单个核细胞单独培养对照组相比，人脐带间充质干细胞共培养组Th1和Th17细胞比例均显著降低(P < 0.01或 P < 0.05)，见图3。结果提示人脐带间充质干细胞抑制T淋巴细胞亚群Th1和Th17的比例。

2.4  人脐带间充质干细胞促进Treg细胞的分化  Treg细胞亚群是具有免疫抑制功能的调节性T细胞。白细胞介素2条件下，人脐带间充质干细胞和外周血单个核细胞以1∶10的比例共培养5 d后，流式细胞术检测Treg细胞比例。与外周血单个核细胞单独培养组比较，共培养组Treg细胞比例显著上升(P < 0.05)，见图4。结果提示，人脐带间充质干细胞能提高免疫抑制性T淋巴细胞亚群Treg的比例。



2.5  人脐带间充质干细胞抑制外周血单个核细胞的炎症因子分泌  人脐带间充质干细胞和外周血单个核细胞以1∶10的比例共培养5 d后，ELISA检测细胞上清中炎症因子水平。与外周血单个核细胞单独培养组相比，外周血单个核细胞与人脐带间充质干细胞共培养组上清液中的肿瘤坏死因子α及干扰素γ水平显著性降低(P < 0.01)，见图5。结果提示，人脐带间充质干细胞能够抑制炎性细胞因子肿瘤坏死因子α及干扰素γ分泌。

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间充质干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，是目前临床应用研究较多的一类干细   胞^[1-2]。间充质干细胞通过多向分化与旁分泌作用发挥组织再生与损伤保护作用，而间充质干细胞独特的免疫调节功能也是其临床应用的基础之一。既往的研究显示，间充质干细胞对自然杀伤细胞、树突状细胞以及B、T淋巴细胞等多种免疫细胞的活化、增殖与分化均有调节作用，并能提高调节性T(T regulatory，Treg)细胞的比例，维持体内免疫环境的稳定^[3-4]。间充质干细胞的免疫调节特性已被应用于急性移植物抗宿主病^[5-6]、系统性红斑狼疮^[7-8]、1型糖尿病^[9-10]、类风湿性关节炎^[11-12]、炎症性肠病等免疫异常和炎症相关疾病的临床研究^[13-14]，初步结果显示了一定的有效性，但其最终治疗效果尚待进一步的研究确定。此外，间充质干细胞通过何种途径发挥免疫调节作用尚存在不同的研究结果与解释，倾向性意见是通过细胞接触和/或分泌多种调节因子，如转化生长因子β、肝细胞生长因子、前列腺素E2、白细胞介素10、一氧化氮、吲哚胺2，3双加氧酶发挥调节作用^[15]。

与其他组织(如骨髓、脂肪)来源的间充质干细胞相比较，人脐带间充质干细胞的免疫原性更低、扩增速率更快、分化潜能更强；尤其是人脐带间充质干细胞取材容易，无道德伦理争议，能够大量产业化扩增存储而被广泛关注^[16]。该研究中，作者采用自主技术分离培养人脐带间充质干细胞，在完成全面的质量检测与生物学特性研究的基础上，通过与免疫细胞体外共培养，探讨其免疫调节功能及其可能的作用途径，为其临床应用奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  体外细胞学实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年6月至2019年2月在武汉汉密顿生物科技股份有限公司研发中心实验室完成。

1.3  材料  在武汉大学人民医院采集足月健康剖腹产新生儿脐带组织，由产妇自愿捐赠并签署知情同意书。采集健康成人志愿者外周静脉血，已签署知情同意书。

实验试剂与仪器：无血清间充质干细胞培养液(瑞士Lonza公司)；RPMI1640培养液、胎牛血清、PBS(美国Gibco公司)；Ficoll(美国GE Healthcare公司)；CFSE、Th1/Th17检测试剂盒、Treg细胞检测试剂盒、Leukocyte Activation Cocktail(美国BD公司)；植物血凝素、丝裂霉素C、12孔及24孔细胞培养板、Transwell小室(0.3 μm) (美国Corning公司)；人肿瘤坏死因子α和干扰素γELISA检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；流式细胞仪(BD公司)。

1.4  方法

1.4.1  人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定  人脐带间充质干细胞按照武汉汉密顿生物科技股份有限公司专利技术(ZL201110261543.5)分离培养。简述如下，分离脐带华通氏胶，剪碎后收集于T175培养瓶，加入无血清间充质干细胞培养基，置37 ℃，体积分数为5%CO₂，饱和湿度培养至组织块周围爬出细胞。收集分离的脐带间充质干细胞，反复传代培养至第5代建立各种细胞库。脐带间充质干细胞的分离培养、表型及分化能力鉴定结果参见已发表的文献^[17]。

1.4.2  外周血单个核细胞的分离及CFSE标记  取健康成人外周血50 mL，采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，重悬于含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养基中待用。细胞计数后，以1×10¹⁰ L^-1的细胞浓度重悬于PBS中，并加入CFSE染液(终浓度为     0.2 μmol/L)，37 ℃避光孵育2.0-3.0 min标记细胞；用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液洗涤2次，除去多余的染料。

1.4.3  人脐带间充质干细胞对植物血凝素刺激外周血单个核细胞增殖的影响  实验分为外周血单个核细胞单独培养组、植物血凝素刺激外周血单个核细胞增殖组、外周血单个核细胞+人脐带间充质干细胞共培养组。共培养组设置3个浓度梯度，人脐带间充质干细胞和外周血单个核细胞的比值为1∶5，1∶10，1∶20。将相应数量的人脐带间充质干细胞均匀接种于12孔或24孔板，培养过夜，待细胞完全贴壁后加入丝裂霉素C(终质量浓度为10 mg/L)，37 ℃，体积分数为5%CO₂条件下孵育20 min，弃上清，PBS清洗2次，每孔加入CFSE标记的外周血单个核细胞悬液1 mL(含1×10⁶个细胞)，增殖组和共培养组加入植物血凝素(终质量浓度为10 mg/L)和白细胞介素2(终浓度为200 IU/mL)，每组设置3个复孔；置37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度培养16-20 h，离心弃上清，更换新鲜培养液，继续培养2 d。收集外周血单个核细胞，流式细胞仪FITC通道检测分析各组外周血单个核细胞的增殖率。外周血单个核细胞单独培养组仅加入1×10⁶个CFSE标记的外周血单个核细胞于12孔板，培养3 d后流式细胞仪检测。

为研究人脐带间充质干细胞对植物血凝素刺激的外周血单个核细胞增殖的抑制作用是否依赖于细胞间直接接触，实验将人脐带间充质干细胞(2×10⁵/孔)接种于24孔板内，将外周血单个核细胞(1×10⁶/孔)接种于孔径为0.3 μm的Transwell小室内。按上述同样条件处理3 d后，流式细胞术检测外周血单个核细胞的增殖情况。

1.4.4  人脐带间充质干细胞对淋巴细胞亚群的调节  按前述方法将人脐带间充质干细胞均匀接种于24孔板培养过夜贴壁及丝裂霉素C处理，以1∶10的比例加入外周血单个核细胞(数量1×10⁶)共培养，以外周血单个核细胞单独培养组为对照，每组设置3个复孔。培养48 h后，每孔添加2 μL的Leukocyte Activation Cocktail With BD GolgiPlug，继续培养5 h。收集外周血单个核细胞，按照Th1/Th17检测试剂盒操作步骤处理细胞后进行流式检测。

按前述方法将人脐带间充质干细胞均匀接种于24孔板培养过夜贴壁及丝裂霉素C处理，以1∶10的比例加入外周血单个核细胞(数量1×10⁶)共培养，以外周血单个核细胞单独培养组为对照，每组设置3个复孔。培养48 h后，每添加白细胞介素2(终浓度200 IU/mL)后培养5 d。收集外周血单个核细胞，按照Treg细胞检测试剂盒操作步骤处理细胞后进行流式检测。

1.4.5  外周血单个核细胞分泌的炎症因子水平  实验分为外周血单个核细胞单独培养组和共培养组(人脐带间充质干细胞∶外周血单个核细胞=1∶10)，每组设置3个复孔。将1×10⁶个人脐带间充质干细胞均匀接种于24孔板培养过夜贴壁及丝裂霉素C处理后，每孔加入1 mL外周血单个核细胞悬液(数量1×10⁶)、植物血凝素(终质量浓度为   5 mg/L)及白细胞介素2(终浓度200 IU/mL)，共培养5 d。收集上清，按照ELISA试剂盒说明书检测肿瘤坏死因子α及干扰素γ水平。

1.5  主要观察指标  ①外周血单个核细胞的增殖情况；②Th1/Th17/Treg细胞的比例；③肿瘤坏死因子α及干扰素γ水平。

1.6  统计学分析  采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，独立样本间比较采用t 检验，组间比较采用单因素方差分析，计量数据用x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

实验通过人脐带间充质干细胞和外周血单个核细胞体外共培养，系统地研究了人脐带间充质干细胞对淋巴细胞增殖、T淋巴细胞特殊亚群及炎症因子分泌的免疫调节作用，并对其可能的作用途径进行了初步探讨。结果显示，人脐带间充质干细胞能够显著性抑制植物血凝素刺激的人外周血淋巴细胞的增殖，下调T淋巴细胞Th1、Th17亚群而上调免疫抑制性Treg细胞的比例，抑制炎症因子肿瘤坏死因子α及干扰素γ的分泌。人脐带间充质干细胞对淋巴细胞增殖抑制可能依赖于细胞间直接接触。

既往研究表明，间充质干细胞对外周血单个核细胞增殖的抑制效应与淋巴细胞激活的方式无关，在混合淋巴细胞培养体系^[15]，或植物血凝素或CD3/CD28抗体等不同的刺激条件下^[18-19]，人脐带间充质干细胞均可抑制外周血单个核细胞的增殖。该研究结果也证实，人脐带间充质干细胞对植物血凝素刺激的外周血单个核细胞增殖具有显著抑制作用，且人脐带间充质干细胞比例越高，对淋巴细胞增殖的抑制越明显，呈剂量依赖性。文献报道，脐血间充质干细胞对植物血凝素刺激的淋巴细胞增殖的抑制作用达80%^[20]，而骨髓间充质干细胞对植物血凝素刺激的淋巴细胞增殖的抑制作用为60%^[21]。该研究中人脐带间充质干细胞对植物血凝素刺激的淋巴细胞的增殖的抑制率为55%，抑制效果的不同可能与间充质干细胞的来源与分离方法、淋巴细胞刺激剂的类型、浓度和时间有关。

有关间充质干细胞的免疫调节作用途径与机制至今尚未完全阐明，现在大多数研究更倾向于间充质干细胞分泌的细胞因子对免疫细胞激活、增殖和分化的调节作用。然而，间充质干细胞和T细胞的直接接触对T细胞增殖的抑制作用是否有关，仍然存在争议^[19，22]。这些分歧可能与间充质干细胞的来源、淋巴效应细胞的种类、刺激方式及培养条件的差异有关。该研究采用Transwell系统对人脐带间充质干细胞和外周血单个核细胞进行非接触共培养，与直接接触培养相比，人脐带间充质干细胞未能显著抑制植物血凝素刺激的外周血单个核细胞增殖，初步推测细胞与细胞的直接接触是人脐带间充质干细胞抑制外周血单个核细胞增殖的必要条件之一。有研究认为，激活淋巴细胞分泌的促炎因子干扰素γ可诱导间充质干细胞表面分子PD-L1的表达，与淋巴细胞表面分子PD-1相互作用，介导间充质干细胞对淋巴细胞的增殖抑制作用^[23]。

T淋巴细胞占人外周血单个核细胞的55%-84%，在免疫相关疾病的发病与进展中发挥重要作用。根据T细胞所处的微环境不同，初始CD4⁺T细胞接受抗原刺激后可以分化为不同的效应Th细胞，如Th1、Th2、Th17及Treg细胞。有研究报道间充质干细胞调节Th1、Th17及Treg细胞比例平衡，促进抗炎性免疫应答是其治疗异常免疫疾病的重要机制^[24-26]。该研究显示，人脐带间充质干细胞能够显著性降低CD4⁺细胞中促炎性免疫细胞Th1、Th17亚群的比例，升高免疫抑制性Treg细胞亚群的比例，并降低免疫细胞促炎因子肿瘤坏死因子α及干扰素γ的产生，这与GHANNAM等^[27]的研究结论一致。给予系统性红斑狼疮模型鼠骨髓来源间充质干细胞治疗，能显著降低异常活性的Th17细胞的比例而升高免疫抑制性Treg细胞的比例，减轻肾功能损伤，改善免疫紊乱^[28]。给予免疫肠炎模型鼠人脐带间充质干细胞治疗能够升高脾和淋巴结Treg/Th17比例^[29]。下一步，在动物模型上验证人脐带间充质干细胞的免疫调节功能。

综上所述，人脐带间充质干细胞具有抑制淋巴细胞增殖，抑制促炎性T细胞亚群并提升免疫抑制性T细胞亚群，以及降低免疫细胞炎症因子分泌的免疫调节作用，这一作用依赖于与免疫细胞的直接接触。该研究为临床应用人脐带间充质干细胞治疗免疫炎症性疾病的有效性提供了依据。对于人脐带间充质干细胞免疫调节的作用机制有待后续细胞与相关动物实验进一步深入研究。

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文题释义：

植物血凝素：是一种有丝分裂原，能激活小淋巴细胞转化为淋巴母细胞，继而分裂增殖，释放淋巴因子，并能提高巨噬细胞的吞噬功能。作为干扰素诱导剂可以刺激机体产生白细胞介素2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。由于其较难提纯，且成本极高，所以一直以来仅在实验室中作为刺激淋巴细胞增殖的试剂。

免疫调节：是人脐带间充质干细胞主要生物学特性之一，体现在抑制免疫细胞的增殖，调节淋巴细胞亚群的分化及相关细胞因子的产生，维持免疫平衡。

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文章从淋巴细胞增殖、特殊T淋巴细胞亚群调节、炎性因子分泌等方面阐明了脐带间充质干细胞的免疫调节特性，其免疫调节作用依赖细胞与细胞间接触。还有观点认为旁分泌作用，如分泌的免疫抑制因子、生长因子、外泌体、趋化因子等是免疫调节的重要机制。目前有学者提出，人脐带间充质干细胞的免疫调节功能具有较强的可塑性，炎症环境下脐带间充质干细胞从静息态转变为激活态，机体的炎症刺激强度和复杂性影响其免疫调节功能。因此需要进一步探索人脐带间充质干细胞在体内通过何种方式参与炎症反应及免疫系统的调节。人脐带间充质干细胞在炎症及免疫失衡相关疾病的临床应用上，除了治疗途径、剂量、频率，其作用机制及机体的炎症免疫微环境的不同也需要进一步探讨。

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