2.1  根尖牙乳头干细胞的培养、鉴定及FasL基因的敲减  培养3 d后，细胞从组织块爬出，呈梭形，能在塑料培养皿贴壁生长；进一步增殖形成细胞集落，集落间融合呈漩涡状。流式细胞分析显示造血干细胞表面标志物CD34、CD45表达阴性，间充质干细胞表面标志物CD29、CD90、CD105、CD146表达阳性。成骨及成脂诱导培养基能诱导根尖牙乳头干细胞向成骨方向与成脂方向分化，21 d后茜红素染色见矿化结节形成，油红O染色有脂滴形成，见图1。

构建了FasL基因敲减根尖牙乳头干细胞稳转株，Western blot 分析显示，根尖牙乳头干细胞转染shRNA慢病毒后FasL蛋白表达水平显著降低，而转染空载病毒细胞与野生型根尖牙乳头干细胞相比，FasL的表达水平未见降低，见图2A-C。流式分析提示，空白组、转染空载病毒组及FasL 敲低组根尖牙乳头干细胞的上述6项表面标志物表达差异无显著性意义；3组细胞的成骨分化及成脂分化能力相似；CCK-8检测显示，3组细胞的增殖曲线差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2D。

2.2  腹腔注射根尖牙乳头干细胞能够缓解实验性肠炎的炎症程度  正常对照组小鼠活动正常，毛色光泽，大便正常颗粒状，无便血，第10天平均体质量略有增加。模型对照组小鼠呈急性肠炎表现：造模第3天，出现大便松散，活动力下降；造模第6天，小鼠饮食、饮水量减少，体质量明显降低，大便稀或不成形(腹泻)、便血、毛色凌乱并失去光泽，精神萎靡，蜷缩。第10天处死小鼠剖开腹部见结肠壁肿胀充血，部分小鼠肠与内脏黏连。根尖牙乳头干细胞治疗组的临床评分及结肠平均长度与模型对照组相比有明显改善，见图3。组织病理分析提示，根尖牙乳头干细胞治疗组结肠的炎症程度均比模型对照组轻；模型对照组小鼠结肠黏膜可见明显充血、水肿、糜烂及散在溃疡形成，大部分远端肠壁增厚，黏膜炎症细胞浸润，以中性粒细胞、淋巴细胞为主，见图4。模型对照组小鼠结肠黏膜损伤评分及反映中性粒细胞和炎症程度的细胞因子表达水平明显高于正常对照组和根尖牙乳头干细胞治疗组(P < 0.05)；对结肠组织炎症因子的ELISA分析进一步证实根尖牙乳头干细胞治疗能有效降低结肠组织白细胞介素1β、白细胞介素6及肿瘤坏死因子α水平，见图5。

2.3  FasL在根尖牙乳头干细胞缓解实验性肠炎机制中起重要作用  以往研究提示，FasL在间充质干细胞治疗一系列自身免疫性疾病和动物模型机制中起了重要作用^[10-12]。为此，实验用RNA干扰技术敲低根尖牙乳头干细胞的FasL蛋白表达。结果发现，FasL敲减根尖牙乳头干细胞对实验性肠炎小鼠的活动、饮食、大便、体质量等临床指标无改善作用。小鼠结肠长度及病理组织评分与模型对照组差异无显著性意义(P > 0.05)，也不能显著降低结肠组织炎症因子白细胞介素1β、白细胞介素6及肿瘤坏死因子α水平。流式分析显示，模型对照组肠系膜淋巴结中Tregs在CD4⁺T细胞中的比例明显低于正常对照组(P < 0.05)，根尖牙乳头干细胞移植能上调肠炎小鼠肠系膜淋巴结的Tregs水平(P < 0.05)，而FasL敲减根尖牙乳头干细胞组小鼠肠系膜淋巴结CD25⁺FoxP3⁺Tregs在CD4⁺辅助性T细胞中的百分比与模型对照组差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。

炎症性肠病包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，是一种病因学不明的肠道非特异性炎症性疾病^[1]。炎症性肠病患者在临床上可表现为反复腹痛、腹泻、黏液血便，甚至各种全身并发症；多数反复发作，迁延不愈，其中一些患者因肠瘘等并发症而需手术治疗^[2]。5-氨基水杨酸盐仍是治疗急性溃疡性结肠炎的一线药物，但对克罗恩病的效果不佳；激素治疗时，其维持治疗的疗效并不确切，并可能引起不良反应^[3-4]。免疫抑制剂主要有硫嘌呤类药物和神经钙调蛋白抑制剂；已有多种免疫调节生物制剂应用于炎症性肠病的治疗，或正处在临床前研究阶段，如抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体^[5]。间充质干细胞移植是炎症性肠病的新兴治疗方法之一，间充质干细胞的免疫抑制功能为干细胞治疗炎症引发的组织损伤提供了理论基础^[6-8]。动物实验及临床试验均表明，间充质干细胞对炎症性肠病具有一定疗效^[6，9]，但其详细的分子机制尚不完全清楚。以往有学者报道Fas/Fas配体(FasL)细胞死亡信号通路在间充质干细胞诱导免疫细胞凋亡、获得免疫耐受过程中起了重要作用^[10-11]；此外，一系列细胞因子也被发现参与其中，如转化生长因子β、白细胞介素10、前列腺素E2、一氧化氮、吲哚胺2,3-二加氧酶^[12-13]。

2006年，SONOYAMA等^[14]从人第三磨牙根尖牙乳头组织中分离得到一组具有自我更新、克隆形成和多向分化能力的干细胞群，并命名为根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla，SCAP)，它在牙根形成和发育中起重要作用；然而关于根尖牙乳头干细胞免疫调节作用方面的报道并不多见。葡聚糖硫酸钠是由蔗糖合成的一种硫酸多糖体，能诱发小鼠溃疡性结肠炎，其肠道病变与人类炎症性肠病的病理表现十分相似，是研究炎症性肠病发病机制及治疗方法的常用模型^{[1，7，15-16]}。该研究主要探讨人根尖牙乳头干细胞对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠实验性肠炎是否具有缓解作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  体外细胞观察实验及动物实验。

1.2  时间及地点  于2018年1月至2019年2月在南通大学附属吴江医院(苏州市第九人民医院)中心实验室进行。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  8周龄C57/BL6雌性小鼠24只，SPF级，体质量20-22 g，购自上海灵畅生物科技有限公司。

1.3.2  实验试剂及仪器  葡聚糖硫酸钠(M_W=36 000-  50 000，MP Biomedicals，美国)；鼠抗人CD29-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD146-PE、CD34-PE、CD45-PE及小鼠Treg流式检测试剂盒[True-Nuclear™ One Step Staining Mouse Treg Flow™ Kit(FOXP3 Alexa Fluor® 488/CD25 PE/CD4 PerCP)] (BioLegend，美国)；兔抗人FasL单克隆抗体(CST，美国)；α-MEM培养基及胎牛血清(Hyclone，美国)；人FasL基因的shRNA慢病毒干扰载体试剂套装(吉凯基因公司)；人白细胞介素1β、白细胞介素6及肿瘤坏死因子α检测ELISA试剂盒(联科生物)；CCK-8细胞增殖检测试剂盒及蛋白提取试剂盒(碧云天)；40 μm及100 μm孔径的细胞滤网(BD，美国)；倒置荧光显微镜(奥林巴斯，日本)；UVP Chem Studio Plus多功能化学发光成像系统(Analytik Jena，德国)；流式细胞分析仪(BD Calibur，美国)。

1.4  实验方法

1.4.1  根尖牙乳头干细胞的分离、培养  临床采集因正畸拔除的根尖尚未发育完成的健康前磨牙。无菌条件下分离根尖牙乳头，采用组织块培养法将根尖乳头组织碎块放入含体积分数为15%胎牛血清的α-MEM培养基中，于37 ℃，体积分数为5% CO₂条件下进行培养，每周换液2次，细胞融合达80%时用2.5 g/L胰酶消化传代，取第3代细胞用于以下实验。

1.4.2  根尖牙乳头干细胞表面标志物鉴定  用PBS将第3代根尖牙乳头干细胞重悬为2×10⁹ L^-1的细胞悬液，分装于离心管，每管100 μL。每管分别加入2 μL鼠抗人CD29-PE、CD34-PE、CD45-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD146-PE单克隆抗体，并设1管空白对照，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗3次，1 600 r/min离心6 min后重悬于含0.5% BSA的PBS溶液中，流式细胞仪检测细胞表面标志物的阳性表达率。

1.4.3  成骨、成脂诱导培养  将第3代根尖牙乳头干细胞接种于6孔培养板进行细胞培养，到50%-60%融合时，将完全培养液换为含50 mg/L抗坏血酸、0.1 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油酸钠的成骨培养液进行成骨诱导3周，茜素红染色观察矿化结节，评估根尖牙乳头干细胞的成骨能力。

将第3代根尖牙乳头干细胞接种于6孔培养板进行细胞培养，到50%-60%融合时，将完全培养液换为含       0.5 mmol/L IBMX、60 μmol/L吲哚美辛、0.5 μmol/L氢化可的松，10 mg/L胰岛素的成脂诱导液诱导培养3周，油红O染色评估根尖牙乳头干细胞的成脂能力。

1.4.4  FasL的基因敲减  第3代根尖牙乳头干细胞的FasL基因敲减稳转株的建立按照试剂盒说明书进行操作。转染后24 h倒置荧光显微镜下观察转染效率。细胞发出明亮的绿色荧光为转染阳性细胞，用1%嘌呤霉素杀死未感染细胞，从而获得FasL敲减根尖牙乳头干细胞；对照组细胞转染空载慢病毒，空白组未进行转染。

1.4.5  CCK-8检测细胞增殖  将空白组、转染空载病毒组及FasL 敲低组根尖牙乳头干细胞接种到96孔板，接种密度均为3×10³/孔，接种量为 100 μL/孔，每3 d更换培养液，分别在1，3，5，7 d各时间点加入CCK-8孵育2 h，酶标仪450 nm波长检测吸光度值，绘制增殖曲线。

1.4.6  Western blot检测各组根尖牙乳头干细胞的FasL表达水平  提取细胞蛋白，BCA法定量后，将20 μg蛋白加样到含0.1% SDS的10%聚丙烯酰胺凝胶上，电泳分离蛋白并转移到硝酸纤维素膜上；5%脱脂奶粉室温封闭1 h，用抗FasL和GAPDH蛋白抗体4 ℃孵育过夜，用过氧化物酶缀合的二抗孵育1 h。使用UVP ChemStudio Plus化学发光成像系统显示及分析蛋白条带。

1.4.7  小鼠急性肠炎模型的诱导及细胞治疗  将24只小鼠随机平均分为4组(n=6)：正常对照组正常饮水，其余3组(模型对照组、根尖牙乳头干细胞治疗组及FasL敲低根尖牙乳头干细胞组)小鼠饮水中给予3%葡聚糖硫酸钠以诱导实验性肠炎，此时记为第0天。根尖牙乳头干细胞治疗组在第3天一次性腹腔注射空载病毒转染的根尖牙乳头干细胞 2×10⁶个(200 μL PBS)；FasL敲减根尖牙乳头干细胞组则注射FasL敲低的根尖牙乳头干细胞2×10⁶个(200 μL PBS)；模型对照组注射200 μL PBS。每日记录各组小鼠的体质量、大便性状、便血及死亡情况。第10天麻醉后断颈处死小鼠，完整剖取结肠(从回盲部到肛门)并测量其长度，PBS冲洗去除结肠内容物，然后在上、中、下3个部位截取一小段结肠做苏木精-伊红染色及病理组织分析；剪取靠近肛门上方2.0-3.0 mm段结肠，用冷PBS清洗后-80 ℃冰箱冻存用于炎症相关细胞因子的ELISA分析。

1.4.8  流式细胞分析  采集肠系膜淋巴结，通过100 μm孔径的滤网研磨，40 μm孔径的滤网过滤获得淋巴细胞单细胞悬液。为了分析调节性T细胞(Tregs)在CD4⁺辅助性T细胞中的比例，取1×10⁶/管细胞先用小鼠Treg流式检测试剂盒中的试剂对细胞进行固定、打孔，然后加入20 μL鼠抗人Alexa Fluor^® 488 FOXP3/CD25 PE/CD4 PerCP抗体混合液或20 µL Alexa Fluor^® 488小鼠IgG1同型对照/CD25 PE/CD4 PerCP抗体混合液在冰上避光条件下孵育     60 min；再用流式分析清洗缓冲液(PBS加0.5% BSA配置)清洗细胞，最后用流式细胞分析仪及FlowJo 10软件进行流式分析。

1.4.9  结肠组织病理学分析  40 g/L多聚甲醛溶液固定结肠组织，常规石蜡包埋，6 μm厚度切片做苏木精-伊红染色。显微镜下观察形态特点并进行组织病理学评分(参照COOPER等^[17]的报道)：共分为5个等级，0级：少量炎细胞；1级：黏膜固有层和黏膜下层轻度炎症；2级：黏膜固有层和黏膜下层重度炎症；3级：全结肠壁轻度炎症；4级：全结肠壁重度炎症。

1.4.10  ELISA分析炎症相关细胞因子水平  取50 mg左右结肠组织，PBS冲洗后剪碎，冰上用匀浆器制成匀浆；蛋白提取试剂盒提取细胞蛋白。BCA法检测蛋白浓度，再按照ELISA试剂盒说明书检测白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α水平。

1.5  主要观察指标  ①各组小鼠的体质量变化及结肠长度；②各组小鼠结肠组织病理学评分；③各组小鼠肠系膜淋巴结Tregs比例及结肠组织炎症因子水平。

1.6  统计学分析  采用SPSS 13.0进行统计学分析。吸光度值、体质量、结肠长度、Tregs比例、炎症因子水平多组间均数比较进行单因素方差分析，Tukey检验比较两两组间差异；病理学评分采用Student-t 检验比较两组间均值的差异。P < 0.05为差异有显著性意义。

炎症性肠病确切的发病机制目前尚不清楚。遗传易感基因、固有及适应性免疫、肠上皮屏障功能、肠道菌群、病毒、非类固醇消炎药和食物抗原等都参与了其发病过  程^[18]。目前，药物治疗、手术治疗对不少患者疗效欠佳^[6]，因此探索新的更为有效的治疗方法十分迫切。以往动物实验及临床试验研究显示，骨髓间充质干细胞对炎性肠炎等一系列自身免疫性疾病具有疗效，提示间充质干细胞的免疫调控能力具有良好临床应用前景^[5-6，19]。然而骨髓取材来源有限，属于有创操作，对细胞培养要求高，并容易受到伦理学限制。根尖牙乳头干细胞是从未完全发育完成的年轻恒牙的根端组织中分离、培养出来的一种牙源性间充质干细胞，由于供者较为年轻，其具有增殖快、干性及组织再生能力强、细胞均一性好的特点；此外，根尖牙乳头干细胞容易从牙科临床取得，受伦理学限制小，因而自其被发现以来就受到学界广泛关注^[14]。该研究证实，根尖牙乳头干细胞的提取及培养较为容易，在体外培养中呈集落样生长，形态均一，增殖快；在诱导培养基诱导下，可以向成骨与成脂方向分化；流式分析表明根尖牙乳头干细胞能高表达CD29、CD90、CD105、CD146等一系列间充质干细胞标志物，不表达CD34、CD45等造血干细胞标志物。研究证实，根尖牙乳头干细胞与牙髓干细胞、牙周膜干细胞相比，具有更强的增殖能力、端粒酶活性及迁移能力，属于更早期的牙源性干细胞，在组织工程的牙根再生研究中前景广阔^[20-22]。

DING等^[23]体外细胞实验证明，根尖牙乳头干细胞呈浓度依赖的方式对T细胞增殖具有抑制作用，但目前尚未见根尖牙乳头干细胞用于治疗炎性肠炎的研究报道。葡聚糖硫酸钠是一种由蔗糖合成的硫酸多糖体，其诱导产生肠炎的机制尚不清楚；但其诱导的小鼠结肠炎模型的肠道病变与人类溃疡性结肠炎相似。因此，该模型在研究溃疡性结肠炎发病机制及临床新药开发上较为常用^[1]。该研究以葡聚糖硫酸钠诱导小鼠肠炎模型，用以评价异种来源人根尖牙乳头干细胞是否和骨髓、脂肪及牙龈来源间充质干细胞一样，具有缓解小鼠肠炎的作用。 

作者发现，葡聚糖硫酸钠诱导急性肠炎模型第3天，腹腔一次性注射根尖牙乳头干细胞2×10⁶个可以有效缓解肠炎的严重程度，肠炎小鼠的各项临床指标均有改善。根尖牙乳头干细胞治疗组体质量的下降程度明显减缓(P < 0.01)，结肠的平均长度也显著大于模型对照组(P < 0.05)；反映结肠组织炎症程度的组织病理学评分及3项炎症因子(白细胞介素1β、白细胞介素6及肿瘤坏死因子α)水平均有显著下降(P < 0.05)，提示根尖牙乳头干细胞移植能减轻肠炎的炎症程度。这与以往报道的尾静脉注射同种或异种骨髓间充质干细胞或其他类型间充质干细胞的治疗效果相 似^{[5-6，10-11，19]}。ZHANG等^[24]报道，一次性腹腔注射1×10⁶个人牙龈间充质干细胞对葡聚糖硫酸钠诱导的实验性肠炎具有治疗作用，吲哚胺2,3-二加氧酶在干细胞介导的免疫抑制中起了重要作用；吲哚胺2,3-二加氧酶是色氨酸代谢的限速酶，色氨酸水平降低，代谢产物犬尿氨酸水平升高会抑制T细胞增殖，上调Tregs，从而诱导免疫耐受。LIU等^[10]报道了通过尾静脉输注异种人脱落乳牙牙髓干细胞，XU等^[11]报道了输注同种小鼠牙龈间充质干细胞，同样能缓解葡聚糖硫酸钠诱导性肠炎；其机制可能与Fas-FasL死亡通路诱导的T细胞凋亡有关。

由于缺乏标准化，在干细胞治疗自身免疫性疾病的研究中，不同学者得出的结果往往差异较大；研究方法的不统一存在于动物模型的制作方法、干细胞的提取及培养方法，此外细胞来自同种还是异种、细胞移植的剂量、注射途径、注射时间及次数均会对结果产生影响；且各家都有治疗成功的报道^[5，25]。在移植途径上，该研究采用一次性腹腔注射的方法，比其他学者的尾静脉注射及灌肠局部注射操作更为简单；间充质干细胞进入腹腔或血液循环后，可以归巢到结肠组织的损伤处，修复肠上皮屏障损伤，同时发挥其组织再生及免疫调控作用。因此，有学者在临床试验中直接将间充质干细胞局部注射在肠瘘部位的黏膜下，并取得满意的疗效^[6，26]。

关于间充质干细胞抑制免疫的确切机制目前尚不清楚。普遍认为，间充质干细胞通过细胞间直接接触或一些可溶性因子的分泌来介导其免疫调节活性^[27]。该研究发现，Fas-FasL通路在根尖牙乳头干细胞发挥免疫调控作用中发挥了重要作用。通过构建慢病毒载体的FasL shRNA，敲减了根尖牙乳头干细胞的FasL基因表达。FasL基因被敲减后，根尖牙乳头干细胞就失去了治疗实验性肠炎的功效，而细胞的增殖、分化能力以及间充质表面标志物的表达未见明显变化。FasL敲低根尖牙乳头干细胞组小鼠的平均体质量、结肠平均长度与模型对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；组织病理学评分提示结肠炎症未见改善，白细胞介素1β、白细胞介素6及肿瘤坏死因子α水平未见明显下降(P > 0.05)。以往学者报道，溃疡性结肠炎与辅助性T细胞(Th)分泌的各种促炎因子密切相关；而Tregs是一类具有负性免疫调节作用的T细胞亚群，在炎症性肠病的病理机制中起了关键性作用^[28-29]。实验对肠系膜淋巴结的淋巴细胞做流式分析显示，模型对照组小鼠Tregs水平比正常小鼠有所下降，根尖牙乳头干细胞移植能有效上调Tregs水平，从而发挥免疫抑制作用，诱导免疫耐受；而FasL敲减的根尖牙乳头干细胞不能显著上调Tregs水平。AKIYAMA等^[30]发现，骨髓间充质干细胞同时表达Fas及FasL分子，不仅可以诱导肿瘤细胞凋亡，而且能诱导T细胞凋亡及免疫耐受，具体的机制为：间充质干细胞通过表达Fas调控单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的分泌，单核细胞趋化蛋白1趋化、招募活化T细胞后间充质干细胞表面的FasL分子与T细胞的Fas受体结合诱导T细胞凋亡，巨噬细胞吞噬凋亡的T细胞及其碎片后分泌转化生长因子β，从而上调Tregs，诱导免疫耐受^[29]。

需要指出的，葡聚糖硫酸钠诱导的实验性肠炎并不能完全反映人类炎症性肠病的病理过程。间充质干细胞对肠炎模型的治疗作用也是多重机制参与的。有必要用更多其他类型的肠炎模型(如慢性肠炎模型、其他药物及品系小鼠诱导的肠炎模型或基因敲除肠炎模型)对根尖牙乳头干细胞的免疫调控作用做进一步验证。在阐明其机制时，需要理解小鼠与人类免疫系统存在的差别，这均有待进一步研究。

综上所述，根尖牙乳头干细胞移植对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠肠炎具有缓解作用，Fas-FasL通路在根尖牙乳头干细胞发挥免疫调控机制中发挥了重要的作用。

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文题释义：

根尖牙乳头干细胞：从根尖未发育完全年轻恒牙的根尖牙乳头组织中分离得到的一组具有自我更新、克隆形成和多向分化能力的间充质干细胞群。它在牙根形成和发育中起重要作用，是构建组织工程牙齿的种子细胞。

炎性肠病：主要包括克罗恩病和溃疡性结肠炎2种类型，是以肠道炎症和组织损伤为特征的慢性疾病。炎性肠病主要流行于欧美国家，在中国发病率呈增长趋势，其发病机制尚未完全阐明。在临床上其病情常有反复、迁延不愈，且有癌变风险，仍缺乏有效的治疗手段。目前有研究表明促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子间失衡导致肠上皮损伤是炎性肠病的重要病理机制。

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炎性肠病的发病机制尚未完全阐明，目前临床上仍缺乏有效的治愈手段。近年来的动物实验及临床试验研究显示，骨髓间充质干细胞移植对炎性肠病等一系列自身免疫性疾病具有疗效。然而骨髓间充质干细胞获取供体细胞困难，细胞培养要求高，易受到伦理学限制。根尖牙乳头干细胞是从未完全发育的年轻恒牙的根端组织中分离、培养出来的一种牙源性间充质干细胞，具有增殖快、干性及组织再生能力强、细胞均一性好的特点，且容易从牙科临床取得，受伦理学限制小。该研究用葡聚糖硫酸钠诱导建立了实验性肠炎小鼠模型，并证明根尖牙乳头干细胞腹腔移植能缓解肠炎小鼠的炎症程度，而Fas-FasL通路在根尖牙乳头干细胞发挥免疫调控作用中发挥了重要作用，提示根尖牙乳头干细胞在未来炎性肠病的细胞治疗中具有良好的临床应用前景。

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