人胎盘间充质干细胞CD200+亚群细胞对同种异基因移植排斥的调节效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2061

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (13): 2068-2073.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2061

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

人胎盘间充质干细胞CD200⁺亚群细胞对同种异基因移植排斥的调节效应

刘婷，杨婷婷，马晓娜，马海滨，金毅然，梁雪云

宁夏医科大学总医院宁夏人类干细胞研究所，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2019-09-03 修回日期:2019-09-05 接受日期:2019-10-21 出版日期:2020-05-08 发布日期:2020-03-10
通讯作者: 梁雪云，副研究员，硕士生导师，宁夏医科大学总医院宁夏人类干细胞研究所，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:刘婷，女，1982年生，宁夏回族自治区银川市人，回族，2007年兰州大学毕业，硕士，助理研究员，主要从事干细胞基础及临床应用研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81460186)

Immunoregulation of allograft rejection: a role played by human CD200⁺ sub-population from human placenta-derived mesenchymal stem cells

Liu Ting, Yang Tingting, Ma Xiaona, Ma Haibin, Jin Yiran, Liang Xueyun

Ningxia Human Stem Cell Institute, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2019-09-03 Revised:2019-09-05 Accepted:2019-10-21 Online:2020-05-08 Published:2020-03-10
Contact: Liang Xueyun, Associate researcher, Master’s supervisor, Ningxia Human Stem Cell Institute, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Liu Ting, Master, Assistant researcher, Ningxia Human Stem Cell Institute, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81460186

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

CD200⁺亚群细胞：从人胎盘间充质干细胞中分选获得的高表达CD200抗原的一群细胞。属于免疫球蛋白超级家族的膜糖蛋白CD200在调节免疫反应方面很重要，在维持免疫稳态方面起着关键作用。

移植排斥：在同种异基因组织、器官移植中，受者的免疫系统会对移植物产生排斥反应，这是一个涉及多种免疫反应的免疫学现象。排斥反应的轻重取决于供者与受者之间人类主要组织相容抗原的差异程度。

背景：免疫排斥反应仍是皮肤异体移植面临的重要难题，实验室前期研究发现高表达CD200的人胎盘间充质干细胞亚群细胞具备较强的免疫调节能力。

目的：进一步研究人胎盘间充质干细胞CD200⁺亚群细胞对同种异基因移植排斥的调节作用。

方法：构建同种异基因小鼠皮肤移植模型，经尾静脉分别将PBS(对照组)、人胎盘间充质干细胞(PMSCs组)、人胎盘间充质干细胞CD200⁺亚群细胞(CD200⁺-PMSCs组)输注C57BL/6小鼠体内。观察移植物的开始坏死时间、存活时间、皮片状态；细胞治疗7 d，采集小鼠外周血进行白细胞计数，采用Q-PCR、ELISA方法检测小鼠脾脏与外周血中白细胞介素10、干扰素γ及肿瘤坏死因子α的表达。

结果与结论：①与对照组相比，PMSCs组与CD200⁺-PMSCs组移植物状态良好，存活时间明显延长(P < 0.001)；CD200⁺-PMSCs组移植物状态及存活时间均优于PMSCs组(P < 0.01)；②细胞治疗7 d，PMSCs组与CD200⁺-PMSCs组白细胞数量明显少于对照组(P < 0.01)；③与对照组相比，CD200⁺-PMSCs组脾脏中白细胞介素10 mRNA表达明显升高(P < 0.05)，PMSCs组、CD200⁺-PMSCs组干扰素γ及肿瘤坏死因子α mRNA表达量则明显下调(P < 0.05，P < 0.01)，同时CD200⁺-PMSCs组干扰素γ及肿瘤坏死因子α mRNA表达量明显低于PMSCs组(P < 0.01，P < 0.05)；④与对照组相比，PMSCs组、CD200⁺-PMSCs组血液中白细胞介素10水平明显升高(P < 0.05，P < 0.01)，而干扰素γ及肿瘤坏死因子α水平则明显下调(P < 0.05，P < 0.001；P < 0.01，P < 0.001)，同时CD200⁺-PMSCs组干扰素γ及肿瘤坏死因子α水平明显低于PMSCs组(P < 0.05)；⑤结果表明，人胎盘间充质干细胞对同种异基因皮肤移植排斥具有调节作用；CD200⁺亚群细胞抑制免疫排斥反应能力更强，其机制可能是CD200通过调节白细胞介素10、干扰素γ及肿瘤坏死因子α等免疫相关因子参与免疫反应。

ORCID: 0000-0002-9945-9094(刘婷)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 间充质干细胞, 胎盘, CD200, 细胞亚群, 皮肤移植, 移植排斥, 免疫抑制, 免疫调节功能, 细胞因子

Abstract:

BACKGROUND: Immune rejection of skin allograft is a clinical problem to be solved. Our previous study has shown that human placenta-derived CD200⁺ mesenchymal stem cells may have a strong capability of immunoregulation.

OBJECTIVE: To investigate the effects of human placenta-derived CD200⁺ mesenchymal stem cells on rejection of skin allograft.

METHODS: Skin allograft models of c57/BL6 mice were established and divided into three groups as control group, human placenta-derived mesenchymal stem cells group (PMSCs group), and CD200⁺ mesenchymal stem cells group (CD200⁺-PMSCs group). PBS (control group), normal PMSCs and CD200⁺-PMSCs were injected into the mice through the tail vein, respectively. The necrotic time, survival time and situation of grafted skin were observed. The number of peripheral white blood cells was counted after 7 days of treatment. The expression levels of interleukin-10, interferon-γ and tumor necrosis factor-α were detected by Q-PCR and ELISA.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, in the PMSCs and CD200⁺-PMSCs groups, the condition of skin allograft was better, and the survival time was significantly prolonged (P < 0.001). The condition and survival time of skin allograft in the CD200⁺-PMSCs group were significantly superior to those in the PMSCs group (P < 0.01). (2) After 7 days of treatment, the number of peripheral white blood cells in the PMSCs and CD200⁺-PMSCs groups was significantly less than that in the control group (P < 0.01). (3) Compared with the control group, the mRNA expression level of interleukin-10 in the spleen was significantly increased in the CD200⁺-PMSCs group (P < 0.05), and the mRNA expression levels of interferon-γ and tumor necrosis factor-α in the spleen were significantly down-regulated in the PMSCs and CD200⁺-PMSCs groups (P < 0.05, P < 0.01). The mRNA expression levels of interferon-γ and tumor necrosis factor-α in the spleen in the CD200⁺-PMSCs group were significantly lower than those in the PMSCs group (P < 0.01, P < 0.05). (4) Compared with the control group, the expression level of interleukin-10 in the blood was significantly increased (P < 0.05, P < 0.001), and the expression levels of interferon-γ and tumor necrosis factor-α in the blood were significantly down-regulated in the CD200⁺-PMSCs and PMSCs groups (P < 0.05, P < 0.001; P < 0.01, P < 0.001). The expression levels of interferon-γ and tumor necrosis factor-α in the blood in the CD200⁺-PMSCs group were significantly lower than those in the PMSCs group (P < 0.05). These results indicate that human placenta-derived mesenchymal stem cells have immunosuppressive effect on the rejection of skin allograft, and CD200⁺ cells may have better immunoregulatory effects by regulating the expressions of interleukin-10, interferon-γ and tumor necrosis factor-α．

Key words: mesenchymal stem cells, placenta, CD200, cell sub-population, skin allograft, allograft rejection, immunosuppression, immunoregulation, cytokines

中图分类号:

刘婷, 杨婷婷, 马晓娜, 马海滨, 金毅然, 梁雪云. 人胎盘间充质干细胞CD200⁺亚群细胞对同种异基因移植排斥的调节效应[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(13): 2068-2073.

Liu Ting, Yang Tingting, Ma Xiaona, Ma Haibin, Jin Yiran, Liang Xueyun. Immunoregulation of allograft rejection: a role played by human CD200⁺ sub-population from human placenta-derived mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(13): 2068-2073.

图/表（结果） 6

2.1 CD200⁺-PMSCs的形态及鉴定分选后的CD200⁺- PMSCs亚群细胞具有典型间充质干细胞的形态，细胞均一呈梭形涡漩状生长，见图1A。经流式细胞方法鉴定，CD200⁺-PMSCs的CD200表达水平在95%以上，见图1B。

2.2 实验动物数量分析 18只实验受体小鼠，全部进入结果分析，中途无脱落。

2.3 移植物形态学观察结果细胞治疗后观察各组小鼠的神态、饮食、运动均良好。对照组小鼠术后浑身出汗发抖，三四天即出现移植物发黑变硬，逐步大面积坏死；PMSCs组小鼠5 d左右移植物开始变色发黑，弹性变差，边缘变硬翘起，局部皮片翘起脱落并有较多黄色瘢痕；CD200⁺-PMSCs组小鼠6 d左右移植物变色发硬，边缘发硬，有部分黄色瘢痕，见图2。根据表2统计分析，PMSCs组、CD200⁺-PMSCs组小鼠比对照组小鼠移植物的存活时间明显增长(P < 0.001)，而CD200⁺-PMSCs组的增长效果强于PMSCs组(P < 0.01)。

2.4 细胞治疗后受体小鼠血液白细胞计数细胞治疗后第7天，取受体小鼠外周血白细胞计数，PMSCs组、CD200⁺- PMSCs组小鼠比对照组小鼠白细胞数量明显减少(P < 0.01)，而CD200⁺-PMSCs组与PMSCs组相比减少程度更大(P < 0.05)，见表3。

2.5 细胞治疗后受体小鼠脾脏中白细胞介素10、干扰素γ、肿瘤坏死因子α mRNA的表达细胞治疗7 d，对照组白细胞介素10 mRNA表达水平与PMSCs组无显著差异(P > 0.05)，而CD200⁺-PMSCs组白细胞介素10 mRNA表达水平明显高于对照组(P < 0.05)；与对照组比较，PMSCs组、CD200⁺-PMSCs组干扰素γ与肿瘤坏死因子α的mRNA表达水平显著下降(P < 0.05，P < 0.01)，同时CD200⁺-PMSCs组的下降幅度明显强于PMSCs组(P < 0.01，P < 0.05)，见图3。

2.6 细胞治疗后受体小鼠血液中白细胞介素10、干扰素γ、肿瘤坏死因子α水平细胞治疗7 d，与对照组相比，PMSCs组、CD200⁺-PMSCs组的白细胞介素10分泌量明显增加(P < 0.05，P < 0.01)，PMSCs组与CD200⁺-PMSCs组之间没有显著差异。与对照组相比，PMSCs组、CD200⁺-PMSCs组的干扰素γ(P < 0.05，P < 0.001)和肿瘤坏死因子α(P < 0.01，P < 0.001)分泌量显著下降，并且CD200⁺-PMSCs组的分泌量均显著高于PMSCs组(P < 0.05)，见图4。

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引言

临床上由于创伤、烧伤等原因造成的大面积皮肤缺损患者由于自体可移植皮肤不足，异体皮肤就成为了移植主要来源^[1-2]。异体移植面临的重要挑战就是免疫排斥反应，目前临床主要处理措施是使用免疫抑制药物，存在作用有限、不良反应大、难以耐受，并且患者容易发生慢性感染等缺点^[3-6]。寻找新的免疫抑制途径来尽量降低同种异体器官移植免疫排斥反应成为了新的研究目标。

间充质干细胞是参与机体组织修复的多能干细胞，具备相当强的免疫调节能力，已经在多种动物模型及临床研究中被证明其能够促进同种异体移植物的存活，但是作用程度在各项研究中差异较大^[7-12]。如何寻找到最优的种子细胞，确定其作用机制，优化细胞治疗模式，均有待进一步研究。

已有研究发现，CD200通过与CD200R结合来抑制髓性细胞(包括巨噬细胞和粒细胞)和部分T细胞的免疫反应活性^[13]，而CD200R只发现在白细胞(巨噬细胞、肥大细胞、粒细胞、B细胞、T细胞和朗格汉斯细胞)内表达^[14-15]。动物实验证实，在进行皮肤移植的小鼠体内过表达CD200可以延长移植物的存活，而用抗体中和CD200之后移植物的存活时间明显缩短^[16]，说明CD200的表达可以影响皮肤移植免疫排斥反应。

作者所在实验室前期研究从人胎盘间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells，PMSCs)中分选获得了高表达CD200抗原的亚群细胞(CD200⁺-PMSCs)，并发现该亚群细胞具有较强的免疫调节功能^[17]，为了进一步验证其对同种异基因移植排斥的调节作用，特设计此实验。

材料方法

1.1 设计细胞移植，同种异基因小鼠皮肤移植，随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 2015年10月至2018年12月在宁夏医科大学总医院干细胞实验室完成。

1.3 材料人胎盘组织取自宁夏医科大学总医院产科，产妇本人及配偶已签署知情同意书。

1.3.1 引物用Primer Premier 5.0设计引物，见表1。

1.3.2 实验试剂 L-DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司)；A型胶原酶(Roche公司)；CD200流式细胞抗体(BD公司)；SYBR Green qPCR Master Mix、反转录试剂盒(Fermentas公司)；Trizol(Invitrogen公司)；RNA提取试剂盒(Qiagen公司)；ELISA试剂盒(武汉博士德公司)。

1.3.3 实验动物 ①ICR小鼠6只，SPF级，雌雄各半，4-6周龄，体质量40-50 g；②C57BL/6小鼠18只，SPF级，雌雄不限，4-6周龄，体质量40-50 g。以上动物均由宁夏医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(宁) 2015-0001。

1.4 实验方法

1.4.1 CD200⁺-PMSCs的分选与鉴定参照前期实验方法从PMSCs中分离培养CD200⁺-PMSCs亚群细胞^[17]，流式细胞方法对CD200表面抗原进行鉴定。

1.4.2 同种异基因皮肤移植模型小鼠制备按实验计划提前将ICR小鼠合笼受孕，待乳鼠出生后备用。取出生一两天的ICR乳鼠，无菌条件下取约1.5 cm直径大小的圆形皮片作为供体皮肤，再将C57BL/6小鼠背部剪出约1.5 cm直径的创口作为受体，将供体皮片移植到受体小鼠创口处进行打包固定，定期观察移植物情况。

1.4.3 实验分组及细胞移植治疗将18只C57BL/6小鼠模型随机分为3组，每组6只：对照组，造模成功后24 h尾静脉注射PBS；PMSCs组，造模成功后24 h尾静脉注射1×10⁵个PMSCs；CD200⁺-PMSCs组，造模成功后24 h尾静脉注射1×10⁵个CD200⁺亚群细胞。

1.5 主要观察指标

1.5.1 移植物形态学观察术后观察小鼠精神、饮食等表现。术后2 d开始定期打开包扎，观察移植物情况并予以记录。将移植物出现坏死或者翘起脱落面积大于50%作为移植物存活时间。

1.5.2 移植后白细胞计数细胞移植治疗后7 d每组取3只小鼠进行眼底取血，常规方法对白细胞计数。

1.5.3 Q-PCR方法检测脾脏中细胞因子的表达上述小鼠取血后处死，分离脾脏，Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA，用SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒进行Q-PCR，引物序列见表1，使用Bio-rad Iqtm5 Optical System Software分析实验数据。

1.5.4 ELISA方法检测细胞因子水平细胞移植治疗后 7 d所有小鼠进行眼底取血，分离血清，按照试剂盒说明书检测细胞因子白细胞介素10、干扰素γ、肿瘤坏死因子α水平。

1.6 统计学分析应用SPSS 20.0软件处理，实验数据以x(_)±s表示，采用ANOVA法进行统计分析，组间比较采用t 检验Bonferroni校正，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

意外事故造成的大面积烧烫伤患者由于自体可用皮肤有限，所以来源较广的异体皮肤移植治疗方案在临床上就具有重要意义，但是需要面对的就是如何减轻移植排斥反应。迄今为止，没有免疫抑制剂能够完全抑制免疫排斥反应，相反长期使用免疫抑制剂还容易引起慢性感染和肿瘤。如何减少甚至不用免疫抑制剂而能够延长移植皮片的存活时间及降低移植排斥反应的新疗法是亟需解决的重要课题。

干细胞由于具有多向分化潜能和组织修复功能，作为一种新兴的生物治疗手段成为国内外研究焦点。间充质干细胞是一群来源于中胚层的多能干细胞，具有低免疫原性和免疫调节作用等优势^[18-22]。大量体内外研究表明，间充质干细胞能够上调Treg细胞比例^[23-25]、抑制CD4⁺T淋巴细胞增殖^[26-27]；抑制B淋巴细胞的增殖及趋化^[28]；抑制NK细胞增殖、细胞因子的分泌水平及细胞毒作用^[29]；抑制树突状细胞的成熟和功能^[30-31]，从而降低移植排斥反应。每个非克隆获得的间充质干细胞都是由不同的亚群细胞组成，这也许是不同报道中间充质干细胞表现出不同的甚至相反的免疫特性的缘由。因此尽可能的纯化间充质干细胞，获得具有稳定特性的间充质干细胞具有重要意义。

研究发现，属于免疫球蛋白超级家族的膜糖蛋白CD200在调节免疫反应方面很重要，在维持免疫稳态方面起着关键作用。CD200通过与CD200受体结合，调节Treg细胞，上调免疫耐受的细胞因子，下调免疫应答的细胞因子，从而介导免疫排斥反应^[32-36]。研究发现，过表达CD200的细胞浸润到皮肤移植部位可延长移植皮肤的存活时间，并证明这一作用是通过抑制肥大细胞的激活和促进Treg细胞的增加得以实现^[37]。新近研究报道，缺氧环境下PMSCs通过高表达CD200来调节炎症因子水平而提高了缺氧缺血脑损伤后的治疗潜力^[38]。

为了进一步验证实验室前期分离出的CD200⁺-PMSCs是否能够调节异基因移植免疫排斥反应，特设计此实验。与对照组相比，输注PMSCs和CD200⁺-PMSCs的小鼠移植皮片存活时间明显延长，白细胞数量得到抑制，而且CD200⁺-PMSCs组的作用明显强于PMSCs组，差异有显著性意义。Q-PCR与ELISA结果显示，脾脏与静脉血中干扰素γ、肿瘤坏死因子α水平在PMSCs组和CD200⁺-PMSCs组均得到了显著的抑制，CD200⁺-PMSCs组的抑制水平强于PMSCs组；与对照组相比，PMSCs组脾脏中白细胞介素10 mRNA表达水平没有差异，而CD200⁺-PMSCs组白细胞介素10 mRNA表达明显升高，PMSCs组与CD200⁺-PMSCs组血液中白细胞介素10的分泌量明显增加，但是两者之间没有明显差异。

白细胞介素10是一种非常重要的抗炎因子，可以由多种免疫细胞产生^[39]，如单核细胞、Treg细胞、巨噬细胞、调节性B细胞以及树突状细胞。研究发现，在异体骨髓造血干细胞移植中，Treg细胞和其分泌的白细胞介素10具有保护异体移植物不被排斥的作用^[40]。通常干扰素γ和肿瘤坏死因子α被认为是由Th1细胞产生，干扰素γ还能够激活巨噬细胞、促进B细胞分化，从而介导排斥反应^[41]。肿瘤坏死因子α能够促进T细胞和B细胞的增殖，并能损伤内皮细胞而导致移植皮片缺血坏死^[42-43]。因此，免疫排斥反应的强弱与白细胞介素10负相关，与干扰素γ和肿瘤坏死因子α正相关。

综合以上结果发现，尾静脉输注CD200⁺-PMSCs亚群细胞能够显著抑制异基因小鼠皮肤移植免疫排斥反应，该作用可能与其调节白细胞介素10、干扰素γ及肿瘤坏死因子α水平相关，但具体机制还需进一步研究。

人胎盘间充质干细胞CD200⁺亚群细胞对同种异基因移植排斥的调节效应

Immunoregulation of allograft rejection: a role played by human CD200⁺ sub-population from human placenta-derived mesenchymal stem cells

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人胎盘间充质干细胞CD200+亚群细胞对同种异基因移植排斥的调节效应

Immunoregulation of allograft rejection: a role played by human CD200+ sub-population from human placenta-derived mesenchymal stem cells

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Immunoregulation of allograft rejection: a role played by human CD200⁺ sub-population from human placenta-derived mesenchymal stem cells