依降钙素干预膝骨关节炎模型大鼠软骨下骨的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2433

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (5): 709-715.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2433

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依降钙素干预膝骨关节炎模型大鼠软骨下骨的变化

伍琦^1，2，廖瑛^1，2，孙光华^1，2，周桂娟^1，2，廖源^1，2，刘静^1，2，钟培瑞^1，2，成果^1，2，3，邓程远^1，2，3，王甜甜^1，2，3

南华大学附属第一医院，¹康复医学科，²康复医学实验室，湖南省衡阳市 421001；³南华大学，湖南省衡阳市 421001

收稿日期:2019-06-06 修回日期:2019-06-13 接受日期:2019-07-20 出版日期:2020-02-18 发布日期:2020-01-09
通讯作者: 廖瑛，教授，硕士生导师，南华大学附属第一医院，湖南省衡阳市 421001
作者简介:伍琦，女，1987年生，湖南省郴州市人，汉族，2013年南京医科大学毕业，主治医师，主要从事骨与关节损伤的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81674045)；湖南省自然科学基金青年基金项目(S2019JJ50536)

Changes of subchondral bone in rat models of knee osteoarthritis treated by elcatonin

Wu Qi^{1, 2}, Liao Ying^{1, 2}, Sun Guanghua^{1, 2}, Zhou Guijuan^{1, 2}, Liao Yuan^{1, 2}, Liu Jing^{1, 2}, Zhong Peirui^{1, 2}, Cheng Guo^{1, 2, 3}, Deng Chengyuan^{1,
2, 3}, Wang Tiantian^{1, 2, 3}

¹Department of Rehabilitation Medicine,²Rehabilitation Laboratory, the First Affiliated Hospital of University of South China, Hengyang 421001, Hunan Province, China;³University of South China, Hengyang 421001, Hunan Province, China

Received:2019-06-06 Revised:2019-06-13 Accepted:2019-07-20 Online:2020-02-18 Published:2020-01-09
Contact: Liao Ying, Professor, Master’s supervisor, 1Department of Rehabilitation Medicine, 2Rehabilitation Laboratory, the First Affiliated Hospital of University of South China, Hengyang 421001, Hunan Province, China
About author:Wu Qi, Attending physician, 1Department of Rehabilitation Medicine, 2Rehabilitation Laboratory, the First Affiliated Hospital of University of South China, Hengyang 421001, Hunan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81674045; the Youth Project of Natural Science Foundation of Hunan Province, No. S2019JJ50536

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
依降钙素：为人工合成的鳗鱼降钙素多肽衍生物，其主要作用是抑制破骨细胞活性，减少骨的吸收，防止骨钙丢失，同时可降低正常动物和高钙血症动物血清钙，对实验性骨质疏松有改善骨强度、骨皮质厚度、骨钙质含量、骨密度等作用。
p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)：p38 MAPK是MAPK亚族中的一员，它以转录因子为作用目标，通过对转录因子的磷酸化来调节许多转录因子的活性，进而介导炎症反应和细胞凋亡，参与体内细胞的应激反应。研究认为p38 MAPK是调节膝关节骨关节炎发病机制中炎症产生的关键上游信号，影响骨关节炎的发生与发展，是近年来研究的热点。

背景：骨关节炎存在软骨下骨吸收和骨形成失去平衡，课题组前期研究发现膝骨关节炎大鼠关节软骨改变前软骨下骨就已经发生改变。

目的：通过观察膝骨关节炎大鼠膝关节软骨下骨的变化，探讨依降钙素对软骨下骨p38 MAPK表达及软骨下骨吸收的影响。

方法：雌性3月龄SD大鼠随机分为3组：假手术组(n=6)不切除卵巢，切除同卵巢等体积大小的脂肪组织，切开双侧膝关节，但不损伤交叉韧带；模型组(n=6)切除双侧卵巢后，再切断双侧膝关节前交叉韧带，建立卵巢切除+前交叉韧带切断模型，不进行药物干预；依降钙素组(n=6)建立卵巢切除+前交叉韧带切断模型后，依降钙素5 IU/kg，每周2次肌肉注射。12周后分析软骨下骨的骨密度、软骨下骨p38蛋白表达水平以及血清Ⅰ型胶原交联C-末端肽、Ⅱ型胶原交联C-末端肽、白细胞介素1、白细胞介素6、骨特异性碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶5b水平。实验方案经南华大学动物实验伦理委员会批准。

结果与结论：①依降钙素组软骨下骨的骨体积分数、骨小梁数量显著高于模型组(P < 0.05)，骨小梁分离度显著低于模型组(P < 0.05)；②模型组的骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度显著低于假手术组(P < 0.01或< 0.05)、骨小梁分离度显著高于假手术组(P < 0.01)；③依降钙素组血清Ⅰ型胶原交联C-末端肽、白细胞介素1、白细胞介素6、抗酒石酸酸性磷酸酶5b显著低于模型组(P < 0.05)，模型组Ⅰ型胶原交联C-末端肽、Ⅱ型胶原交联C-末端肽、白细胞介素1、白细胞介素6、抗酒石酸酸性磷酸酶5b明显高于假手术组(P < 0.05)；④软骨下骨p38蛋白表达水平依降钙素组显著低于模型组(P < 0.01)、模型组显著高于假手术组(P < 0.01)；⑤结果说明，依降钙素可能通过下调p38 MAPK表达，抑制骨关节炎促炎因子分泌及软骨下骨吸收。

ORCID: 0000-0002-2108-9820(伍琦)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨关节炎, 依降钙素, 软骨下骨, 骨吸收, p38 MAPK, 骨组织定量, 促炎症因子, 抗酒石酸酸性磷酸酶5b, 骨特异性碱性磷酸酶, Ⅰ型胶原交联C-末端肽, Ⅱ型胶原交联C-末端肽

Abstract:

BACKGROUND: Imbalance between subchondral bone resorption and bone formation occurs in osteoarthritis. Our preliminary study has found that the subchondral bone changes precede the articular cartilage changes in knee osteoarthritis rats.

OBJECTIVE: To observe the changes of subchondral bone in knee osteoarthritis rats, and to explore the effect of elcatonin on the expression of p38 MAPK and absorption of subchondral bone.

METHODS: Female Sprague-Dawley rats, 3 months of age, were randomly divided into three groups: sham operation group (n=6, the adipose tissue of the same size as the ovary was removed without ovariectomy, the bilateral knee joints were opened, but without cruciate ligament injury); model group (n=6, bilateral ovariectomy plus bilateral cruciate ligament injury, no treatment); elcatonin group (n=6, ovariectomy plus cruciate ligament injury, intramuscular injection of 5 IU/kg elcatonin, twice weekly). The bone mineral density and p38 protein expression levels in subchondral bone were detected at 12 weeks. The serum levels of C-terminal crosslinking telopeptides of type I collagen, C-terminal crosslinking telopeptides of type II collagen, interleukin-1, interleukin- 6 and bone-specific alkaline phosphatase, tartrate resistant acid phosphatase 5b were detected.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The bone volume fraction and trabecular bone number in the elcatonin group were significantly higher than those in the model group (P < 0.05), and the trabecular separation in the elcatonin group was lower than that in the model group (P < 0.05). (2) The bone volume fraction, trabecular bone number and trabecular thickness in the model group were lower than those in the sham operation group (P < 0.01 or P < 0.05), and the trabecular separation was higher than that in the sham operation group (P < 0.01). (3) The serum levels of C-terminal crosslinking telopeptides of type I collagen, C-terminal crosslinking telopeptides of type II collagen, interleukin-1, interleukin- 6 and tartrate resistant acid phosphatase 5b in the elcatonin group was significantly lower than those the model group (P < 0.05)，and the above levels in the model group were significantly higher than those in the sham operation group (P < 0.05). (4) The p38 expression level in subchondral bone in the elcatonin group was significantly lower than that in the model group (P < 0.01), and the level in the model group was significantly higher than that in the sham operation group (P < 0.01). (5) These results indicate that elcatonin may inhibit the secretion of osteoarthritis pro-inflammatory factors and subchondral bone resorption by down-regulating the expression level of p38 MAPK.

Key words: osteoarthritis, elcatonin, subchondral bone, bone resorption, p38 MAPK, bone tissue quantification, pro-inflammatory factor, tartrate resistant acid phosphatase 5b, bone-specific alkaline phosphatase, C-terminal crosslinking telopeptides of type I collagen, C-terminal crosslinking telopeptides of type II collagen

中图分类号:

伍琦, 廖瑛, 孙光华, 周桂娟, 廖源, 刘静, 钟培瑞, 成果, 邓程远, 王甜甜. 依降钙素干预膝骨关节炎模型大鼠软骨下骨的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(5): 709-715.

Wu Qi, Liao Ying, Sun Guanghua, Zhou Guijuan, Liao Yuan, Liu Jing, Zhong Peirui, Cheng Guo, Deng Chengyuan, Wang Tiantian. Changes of subchondral bone in rat models of knee osteoarthritis treated by elcatonin[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(5): 709-715.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠18只，分为3组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。

2.2 依降钙素对大鼠软骨下骨组织形态的影响通过软骨下骨Micro-CT显示，模型组大鼠软骨下骨可见囊腔化、空泡化，而依降钙素组软骨下骨囊腔及空泡现象较模型组减少，见图1。

通过Micro-CT对软骨下骨组织定量分析可见：与模型组比较，依降钙素组的骨体积分数、骨小梁数量增高(P < 0.05)，依降钙素组的骨小梁厚度增高，但差异无显著性意义(P > 0.05)，依降钙素组的骨小梁分离度降低(P < 0.05)。与假手术组比较，模型组的骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度均显著降低(分别为P < 0.01、P < 0.01、P < 0.05)，骨小梁分离度显著增高(P < 0.01)，差异均有显著性意义，见图2。

2.3 依降钙素对大鼠血清CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ的影响与模型组比较，依降钙素组大鼠血清CTX-Ⅰ水平下降(P < 0.05)，依降钙素组大鼠血清尽管CTX-Ⅱ水平下降，但差异无显著性意义(P > 0.05)；与假手术组比较，模型组大鼠CTX-Ⅰ和CTX-Ⅱ水平均增加(P < 0.01，P < 0.05)。见图3。

2.4 依降钙素对大鼠血清白细胞介素1、白细胞介素6的影响与模型组比较，依降钙素组大鼠血清白细胞介素1、白细胞介素6水平下降(P < 0.05)；与假手术组进行比较，模型组大鼠白细胞介素1、白细胞介素6水平增加(P < 0.05)，见图4。

2.5 依降钙素对大鼠血清骨特异性碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶5b的影响与模型组比较，依降钙素组大鼠血清骨特异性碱性磷酸酶水平下降，但差异无显著性意义(P > 0.05)，与模型组比较，依降钙素组大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b水平下降(P < 0.05)；与假手术组比较，模型组大鼠骨特异性碱性磷酸酶水平增加，但差异无显著性意义(P > 0.05)，模型组大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶5b水平增加(P < 0.05)。见图5。

2.6 依降钙素对大鼠软骨下骨p38 MAPK蛋白表达的影响与模型组进行比较，依降钙素组大鼠软骨下骨p38 MAPK表达下降(P < 0.01)；与假手术组进行比较，模型组大鼠软骨下骨p38 MAPK表达增加(P < 0.01)。见图6。

参考文献

[1] PEREIRA D, RAMOS E, BRANCO J.Osteoarthritis.Acta Med Port.2015;28(1):99-106.
[2] LI G, YIN J, GAO J, et al.Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes.Arthritis Res Ther.2013;15(6):223.
[3] MORITA Y, ITO H, ISHIKAWA M, et al.Subchondral bone fragility with meniscal tear accelerates and parathyroid hormone decelerates articular cartilage degeneration in rat osteoarthritis model.J Orthop Res.2018;36(7):1959-1968.
[4] SCOTECE M, CONDE J, ABELLA V, et al.Oleocanthal Inhibits Catabolic and Inflammatory Mediators in LPS-Activated Human Primary Osteoarthritis (OA) Chondrocytes Through MAPKs/NF-κB Pathways.Cell Physiol Biochem. 2018;49(6):2414-2426.
[5] HU N, GAO Y, JAYASURIYA CT, et al. Chondrogenic induction of human osteoarthritic cartilage-derived mesenchymal stem cells activates mineralization and hypertrophic and osteogenic gene expression through a mechanomiR.Arthritis Res Ther.2019;21(1):167.
[6] HALL AC.The Role of Chondrocyte Morphology and Volume in Controlling Phenotype-Implications for Osteoarthritis, Cartilage Repair, and Cartilage Engineering.Curr Rheumatol Rep.2019;21(8):38.
[7] SEIDL CI, MURPHY CL.Dual and Opposing Regulation of MMP1 and MMP13 by Both Arms of miR-675 in Human Articular Chondrocytes.Cell Physiol Biochem. 2019;53(1): 172-185.
[8] MURAOKA T, HAGINO H, OKANO T, et al.Role of subchondral bone in osteoarthritis development: a comparative study of two strains of guinea pigs with and without spontaneously occurring osteoarthritis.Arthritis Rheum. 2007;56(10):3366-3374.
[9] VAN SPIL WE, KUBASSOVA O, BOESEN M, et al. Osteoarthritis phenotypes and novel therapeutic targets. Biochem Pharmacol. 2019;165:41-48.
[10] 钟培瑞,廖瑛,廖源,等.去卵巢对大鼠膝关节软骨及软骨下骨的影响[J].风湿病与关节炎,2017,6(11):5-10,20.
[11] AHO OM, FINNILÄ M, THEVENOT J, et al. Subchondral bone histology and grading in osteoarthritis. PLoS One.2017;12(3): e0173726.
[12] IZAWA T, HUTAMI IR, TANAKA E.Potential Role of Rebamipide in Osteoclast Differentiation and Mandibular Condylar Cartilage Homeostasis.Curr Rheumatol Rev.2018; 14(1):62-69.
[13] JUNG YK, HAN MS, PARK HR, et al.Calcium-phosphate complex increased during subchondral bone remodeling affects earlystage osteoarthritis.Sci Rep.2018;8(1):487.
[14] ZHOU Y, MING J, LI Y, et al.Ligustilide attenuates nitric oxide-induced apoptosis in rat chondrocytes and cartilage degradation via inhibiting JNK and p38 MAPK pathways.J Cell Mol Med. 2019;23(5):3357-3368.
[15] LI WM, HAN CL, LIU C, et al.ANGPTL2 deletion inhibits osteoclast generation by modulating NF-κB/MAPKs/Cyclin pathways.Biochem Biophys Res Commun. 2018;503(3): 1471-1477.
[16] TSUKAMOTO M, MENUKI K, MURAI T, et al. Elcatonin prevents bone loss caused by skeletal unloading by inhibiting preosteoclast fusion through the unloading-induced high expression of calcitonin receptors in bone marrow cells.Bone. 2016;85:70-80.
[17] BLANEY DEN, VAN CAAM AP, VAN DER KRAAN PM. Osteoarthritis year in review 2016: biology. Osteoarthritis Cartilage.2017;25(2):175-180.
[18] CHENG T, ZHANG L, FU X, et al.The potential protective effects of calcitonin involved in coordinating chondrocyte response, extracellular matrix, and subchondral trabecular bone in experimental osteoarthritis.Connect Tissue Res. 2013; 54(2):139-146.
[19] KETOLA JH, KARHULA SS, FINNILÄ MAJ, et al. Iterative and discrete reconstruction in the evaluation of the rabbit model of osteoarthritis.Sci Rep.2018;8(1):12051.
[20] HØEGH-ANDERSEN P, TANKÓ LB, ANDERSEN TL, et al. Ovariectomized rats as a model of postmenopausal osteoarthritis: validation and application.Arthritis Res Ther. 2004;6(2):R169-180.
[21] KAMEKURA S, HOSHI K, SHIMOAKA T, et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability.Osteoarthritis Cartilage.2005;13(7): 632-641.
[22] KATAE Y, TANAKA S, SAKAI A, et al.Elcatonin injections suppress systemic bone resorption without affecting cortical bone regeneration after drill-hole injuries in mice.J Orthop Res. 2009;27(12):1652-1658.
[23] WALLACH S, ROUSSEAU G, MARTIN L, et al.Effects of calcitonin on animal and in vitro models of skeletal metabolism.Bone.1999;25(5):509-516.
[24] MIMPEN JY, SNELLING SJB.Chondroprotective Factors in Osteoarthritis: a Joint Affair.Curr Rheumatol Rep. 2019;21(8): 41.
[25] LI X, HE P, HOU Y, et al.Berberine inhibits the interleukin-1 beta-induced inflammatory response via MAPK downregulation in rat articular chondrocytes.Drug Dev Res. Drug Dev Res. 2019 Apr 29.
[26] WANG CJ, CHENG JH, CHOU WY, et al.Changes of articular cartilage and subchondral bone after extracorporeal shockwave therapy in osteoarthritis of the knee.Int J Med Sci. 2017;14(3):213-223.
[27] CHEN K, LV ZT, ZHOU CH, et al.Peimine suppresses interleukin‑1β‑induced inflammation via MAPK downregulation in chondrocytes.Int J Mol Med.2019;43(5): 2241-2251.
[28] PARK C, JEONG JW, LEE DS, et al.Sargassum serratifolium Extract Attenuates Interleukin-1β-Induced Oxidative Stress and Inflammatory Response in Chondrocytes by Suppressing the Activation of NF-κB,p38 MAPK,and PI3K/Akt.Int J Mol Sci.Int J Mol Sci. 2018;19(8). pii: E2308.
[29] ZHANG R, WANG CM, JIANG HJ, et al.Protective Effects of Sweroside on IL-1β-Induced Inflammation in Rat Articular Chondrocytes Through Suppression of NF-κB and mTORC1 Signaling Pathway.Inflammation. 2019;42(2):496-505.
[30] ELLIOTT SF, COON CI, HAYS E, et al.Bcl-3 is an interleukin-1-responsive gene in chondrocytes and synovial fibroblasts that activates transcription of the matrix metalloproteinase 1 gene. Arthritis Rheum. 2002;46(12): 3230-3239.
[31] VINCENT TL.IL-1 in osteoarthritis: time for a critical review of the literature.F1000Res. F1000Res. 2019;8. pii: F1000 Faculty Rev-934.
[32] HAN PF, WEI L, DUAN ZQ, et al.Contribution of IL-1β, 6 and TNF-α to the form of post-traumatic osteoarthritis induced by "idealized" anterior cruciate ligament reconstruction in a porcine model.Int Immunopharmacol.2018;65:212-220.
[33] CHE ATNA, LAU SF, MOHAMED S.Ficus deltoidea Prevented Bone Loss in Preclinical Osteoporosis/ Osteoarthritis Model by Suppressing Inflammation.Calcif Tissue Int. 2018;103(4):388-399.
[34] CHEN X, CHEN X, ZHOU Z, et al.Nirogacestat suppresses RANKL-Induced osteoclast formation in vitro and attenuates LPS-Induced bone resorption in vivo.Exp Cell Res. 2019;15: 111470.
[35] OK SM, LEE SM, PARK HR, et al.Concentrations of CTX I, CTX II, DPD, and PYD in the urine as a biomarker for the diagnosis of temporomandibular joint osteoarthritis: A preliminary study. Cranio. 2018;36(6):366-372.
[36] SHEN J, ABU-AMER Y, O'KEEFE RJ, et al.Inflammation and epigenetic regulation in osteoarthritis. Connect Tissue Res. 2017;58(1):49-63.
[37] ISHIDA M, KITAURA H, KIMURA K, et al.Muramyl dipeptide enhances lipopolysaccharide-induced osteoclast formation and bone resorption through increased RANKL expression in stromal cells.J Immunol Res.2015;2015:132765.
[38] ZHENG X, NIE Y, SUN C, et al.Long-term electroacupuncture stimulation prevents osteoporosis in ovariectomised osteopaenic rats through multiple signalling pathways. Acupunct Med. 2018;36(3):176-182.
[39] KARSDAL MA, HENRIKSEN K, ARNOLD M, et al. Calcitonin: a drug of the past or for the future? Physiologic inhibition of bone resorption while sustaining osteoclast numbers improves bone quality. BioDrugs.2008;22(3):137-144.
[40] SHIBAKAWA A, YUDOH K, MASUKO-HONGO K, et al.The role of subchondral bone resorption pits in osteoarthritis: MMP production by cells derived from bone marrow. Osteoarthritis Cartilage. 2005;13(8):679-687.
[41] ZHANG LB, MAN ZT, LI W, et al.Calcitonin protects chondrocytes from lipopolysaccharide-induced apoptosis and inflammatory response through MAPK/Wnt/NF-κB pathways. Mol Immunol.2017;87:249-257.
[42] VLOT MC, DEN HEIJER M, DE JONGH RT, et al.Clinical utility of bone markers in various diseases. Bone.2018;114: 215-225.
[43] GLENDENNING P, CHUBB SAP, VASIKARAN S.Clinical utility of bone turnover markers in the management of common metabolic bone diseases in adults.Clin Chim Acta. 2018;481:161-170.

引言

骨关节炎是一种常见的退行性关节病，受生物学和力学因素的影响，致使软骨细胞、细胞外基质及软骨下骨三者结构和功能的失衡^[1-3]。骨关节炎最典型和最直观的病变是关节软骨的退变，确切病因尚不十分明确，其病理变化涉及炎性因子促炎反应^[4]、软骨细胞肥大^[5-6]、细胞外基质的降解^[7]、软骨下骨骨重建失衡以及滑膜组织新生血管的发生等多方面^[3^，^8-9]。

骨关节炎软骨下骨的骨吸收和骨形成失去平衡^[3]，课题组前期研究发现膝骨关节炎大鼠关节软骨改变前软骨下骨就已经发生改变^[10]，软骨下骨骨量改变有可能是关节退变的始动因素^[11]。因此在骨关节炎发病机制研究软骨下骨形态及功能的改变尤为重要。MAPK家族包括JNK、p38和ERK信号通路，是调节膝关节骨关节炎发病机制中炎症产生的关键上游信号通路^[4]。p38可以通过对小邻苯二甲酸相关转录因子的调控影响颞下颌关节破骨细胞分化，抑制p38磷酸化可以抑制颞下颌关节破骨细胞早期分化，抑制软骨下骨骨吸收，改善颞下颌关节炎^[12]，破骨细胞的活化与软骨下骨骨吸收有关^[13]。体内和体外实验发现，抑制p38信号可以抑制炎症反应、抑制软骨细胞凋亡，防止膝关节骨关节炎软骨退变，保护关节^[14-15]。综上所述，p38可以通过影响炎症反应及软骨细胞功能影响膝关节骨关节炎的发生发展，并且p38与颞下颌关节炎破骨细胞早期生成及软骨下骨骨吸收有关，p38是否与膝关节骨关节炎软骨下骨有关尚不清楚。

降钙素是目前治疗骨质疏松的常用药物，主要是通过抑制破骨细胞的功能从而抑制骨吸收^[16]。研究发现降钙素亦可用于骨关节炎治疗^[17]。降钙素可以保护骨关节炎大鼠软骨细胞，这一作用主要通过抑制p38磷酸化，抑制软骨细胞外基质降解、保护软骨细胞来实现的^[18]。而降钙素亦可以通过改善软骨下骨骨密度达到保护关节软骨的目的^[19]。推测降钙素作用于软骨下骨可能与p38有关。此次实验中，观察依降钙素对膝关节骨关节炎软骨下骨p38及软骨下骨影响，为探讨依降钙素干预骨关节炎的机制，为临床应用依降钙素干预骨关节炎提供更充足的依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计动物实验对比观察。

1.2 时间及地点于2018年9至2019年3月在南华大学完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物健康3月龄雌性SD大鼠18只，体质量为250-300 g，均购自南华大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK(湘)2010-0005，于湖南省衡阳市南华大学动物实验部饲养，使用许可证号：SYXK(湘)2010-0006，饲养室温为20-24 ℃、饲养湿度50%-60%，自然光条件下自由摄食及饮水，大鼠饲料购买自南华大学动物实验部。严格按照中华人民共和国《实验动物管理条例》进行实验动物相关工作。

1.3.2 实验药物、材料、试剂血清Ⅰ型胶原交联C-末端肽(C-terminal crosslinking telopeptide of type I collagen，CTX-I)及Ⅱ型胶原交联C-末端肽(C-terminal crosslinking telopeptide of type ll collagen，CTX-Ⅱ)ELISA试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司，中国)；白细胞介素1和白细胞介素6 ELISA试剂盒(广州皓越生物科技有限公司，中国)；骨特异性碱性磷酸酶(Bone-specific Alkaline Phosphatase，BALP)及抗酒石酸酸性磷酸酶5b(Tartrate Resistant Acid Phosphatase 5b，TRACP-5b)ELISA试剂盒(广州皓越生物科技有限公司，中国)，依降钙素注射液(山东绿叶制药有限公司，中国)；磷酸化抗体p38(上海康朗生物科技有限公司，中国)。

1.3.3 实验主要仪器显微CT(Micro-CT)(广州中科恺盛医疗科技有限公司，中国)；电泳仪(上海培清，JS- Power 300)；垂直电泳槽(Tanon，VE-180)；转移电泳槽(Tanon，VE-186)；水平摇床(北京六一仪器厂，WD-9045B)；冷冻高速离心机(珠海黑马，TGL-16R)；酶标仪(Thermo，Multiskan Mk3)；电子分析天平(DENVER INSTRUMENT，TP-214)；pH计(DENVER INSTRUMENT，UB-7)；集热式恒温磁力搅拌器(YUHUA，DF-101S)；X射线摄影暗匣(Yuehua，AX-II)；单头暗室灯(龙口市双鹰，FA03)；微型离心机(BMJ，BMJ0826)；移液器(eppendorf，110659A，110903A，115064A，477768Z)。

1.4 实验方法

1.4.1 制作实验模型及分组采用前交叉韧带切断联合卵巢切除的方法建立膝骨关节炎动物模型。卵巢切除模型参照文献资料采用切除大鼠的双侧卵巢方法建立^[20]；前交叉韧带切断模型参照文献资料采用切断大鼠双侧膝关节前交叉韧带建立^[21]。

假手术组(n=6)：切开大鼠背部皮肤及肌肉进入腹腔，不切除卵巢，但是切除同卵巢等体积大小的脂肪组织，并同时切开双侧膝关节，但不损伤交叉韧带，之后缝合关节囊及皮肤；模型组(n=6)：在切除双侧卵巢后，再切断双侧膝关节前交叉韧带，建立卵巢切除+前交叉韧带切断模型，但不进行药物干预；依降钙素组(n=6)：行卵巢切除+前交叉韧带切断造模后，依降钙素5 IU/kg，每周2次肌肉注射，药物剂量选择参考药品说明书及相关文献^[22-23]。术后每组实验动物予以肌肉注射青霉素4×10⁴ U、1次/d，连续3 d预防感染，术后分笼单独饲养，不限制大鼠活动。

1.4.2 取材每组实验大鼠于术后12周取内眦静脉血 2 mL，ELISA检测血清标志物；麻醉后取双侧软骨下骨，一侧用于Western blot印迹检测软骨下骨p38 MAPK蛋白，另一侧行Micro-CT检查。

1.4.3 Western blot印迹检测软骨下骨p38 MAPK蛋白术后12周采用2%戊巴比妥钠(3 mL/kg)深麻醉处死大鼠后，取大鼠左侧胫骨近端骨组织，软骨组织研磨后，并提取细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量，检测大鼠p38蛋白的表达。分别取各组样品约20 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳后，转移到PVDF膜上，将膜取出直接放入一抗(磷酸化抗体p38，1∶1 000稀释)中，37 ℃反应1.5 h；PBST洗膜，5 min×4次；将膜转入二抗(羊抗兔抗体，1∶10 000)中，37 ℃反应1 h；PBST洗膜，5 min×5次；用化学发光法显影，于暗室内压片，显影定影。所得条带运用Image J图像分析软件分析。

1.4.4 Micro-CT扫描软骨下骨术后12周采用2%戊巴比妥钠(3 mL/kg)深麻醉处死大鼠后，取大鼠右膝关节上下各 0.5 cm处的软骨下骨，置于40 g/L多聚甲醛中固定。采用Micro-CT观察软骨下骨，将右膝关节上下软骨离体标本平放置于Micro-CT扫描系统的扫描槽中，并对完整的软骨下骨进行三维图像重建和定量分析。Micro-CT的扫描相关参数：电压10-90 kVp，最大功率80 W，微焦斑X光源13- 20 μm，空间分辨率50 μm，每层间距为15 μm，横截面视野90 mm，单次扫描长度120 mm。具体测量指标的定量分析采用Mimics V3.1.2 3D重建处理软件和ABA专用骨骼分析软件进行分析。

参数如下：骨体积分数以%表示、骨小梁厚度以像素值(μm)表示、骨小梁数量以1/像素值(mm^-1)表示、骨小梁分离度以像素值(μm)表示。软骨下骨板及骨小梁相关参数的测量均根据美国骨与矿物质研究协会指南，在CTAn软件下完成。

1.4.5 ELISA法检测血清骨代谢生化标志按照ELISA试剂盒说明书检测CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ、白细胞介素1、白细胞介素6、骨特异性碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶5b的水平。

1.5 主要观察指标 ①血清骨代谢生化标志CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ、白细胞介素1、白细胞介素6、骨特异性碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶5b；②软骨下骨Micro-CT观察下组织学变化，骨组织定量分析指标骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁分离度；③软骨下骨p38 MAPK蛋白表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，计量资料以x(_)±s表示。组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 LSD-t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

尽管软骨病变被认为是骨关节炎原发疾病^{[24- 25]}，但是软骨下骨改变正在引起越来越多的关注，它在骨关节炎的发病机制中起着至关重要的作用，关节软骨改变前软骨下骨就已经发生改变^[11]，软骨下骨病变有可能是骨关节炎关节退变的始动因素^[26]，但机制尚不十分明确。此次实验发现病程12周膝骨关节炎大鼠的软骨下骨出现骨吸收，而依降钙素可以抑制早期骨关节炎大鼠软骨下骨的骨吸收、防止软骨下骨囊腔化、空泡化(见图1，2)。实验发现模型组大鼠白细胞介素1、白细胞介素6 、抗酒石酸酸性磷酸酶5b和CTX-Ⅰ较对照组升高(P < 0.05)、但较依降钙素降低(P < 0.05)，因此依降钙素可以抑制骨关节炎大鼠炎症反应，抑制软骨下骨骨吸收。

MAPK家族与膝关节骨关节炎发病机制中炎症产生的关键上游信号通路有关^[27]，激活p38 MAPK信号可以诱发氧化应激反应及炎症反应，导致关节软骨的破坏^[28]，抑制p38信号可以下调促炎因子的白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等表达，抑制基质金属蛋白酶及蛋白聚糖酶的表达，保护关节软骨^[4]。而在骨关节炎大鼠中促炎因子白细胞介素1和白细胞介素6可以导致关节炎症细胞的浸润引起关节破坏^[4^，^29-30]。白细胞介素1^[31]、肿瘤坏死因子α^[32]、白细胞介素6水平的上调伴随着破骨细胞生成和软骨下骨吸收增加^[33]，下调肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的抗炎治疗可以抑制骨吸收标志物RANKL和CTX-I的表达^[34-35]，抑制软骨下骨骨吸收，改善软骨下骨显微结构^[36]。据报道，在腰椎及股骨中抗酒石酸酸性磷酸酶5b的表达及破骨细胞的活性可以随着p38 MAPK信号通路的上下调而发生相应变化，从而影响骨吸收^{[37- 38]}；而在颞下颌关节软骨下骨的破骨细胞早期生成可以受到p38信号活化的影响^[12-13]。因此p38有可能诱导炎症反应、促进破骨细胞生成及骨吸收影响骨关节炎。

降钙素是目前治疗骨质疏松的常用药物^[39]，是通过抑制破骨细胞的功能来起作用的^[34]。组织学研究发现，负重时软骨下骨及软骨会发生形态改变，以最大限度增加关节面的接触面积保护软骨^[8]。降钙素可以通过抑制破骨细胞的活性，从而抑制骨吸收，限制了骨重塑的启动，防止了软骨下骨的硬化，起到保护软骨的作用^[40]，而这一作用有可以通过抑制白细胞介素1、白细胞介素6等促炎因子的表达来实现^[41]。降钙素可以抑制p38信号，减轻骨关节炎大鼠软骨下骨骨小梁微观结构的破坏^[18]。

此次实验发现，与模型组进行比较，依降钙素组大鼠软骨下骨p38蛋白含量下降(P < 0.01)；与假手术组进行比较，模型组大鼠软骨下骨p38蛋白含量增加(P < 0.01)。因此依降钙素有可能是通过下调骨关节炎大鼠软骨下骨p38 表达，抑制促炎因子分泌和软骨下骨骨吸收。

此次实验发现3组大鼠骨特异性碱性磷酸酶比较差异无显著性意义(P > 0.05)。血清骨特异性碱性磷酸酶是反映成骨细胞的活性和功能状况的重要指标^[42-43]，但是骨关节炎早期软骨下骨以骨吸收为主，故此次实验各组骨特异性碱性磷酸酶比较无统计学差异。实验发现模型组血清CTX-Ⅱ较假手术组有增高(P < 0.05)，但依降钙素组与模型组CTX-Ⅱ比较无统计学意义(P > 0.05)，这可能因为CTX-Ⅱ的主要作用是促进软骨细胞的分化，考虑软骨下骨的骨质疏松早于关节软骨的退变^[10]，实验造模12周后取大鼠标本，有可能此时关节软骨变性尚不明显，反映关节软骨破骨细胞功能的CTX-Ⅱ并未达到峰值，故依降钙素组对比模型组无统计学意义。

综上所述，在骨关节炎早期软骨下骨扮演重要角色，早期主要表现为骨吸收增加，有可能是通过上调软骨下骨p38MAPK蛋白的表达，提高炎症反应、破骨细胞活性及促进骨吸收来实现的，而依降钙素可以抑制p38MAPK蛋白的表达。因此依降钙素可能通过下调p38MAPK蛋白表达，抑制骨关节炎大鼠促炎因子分泌及软骨下骨骨吸收。

研究局限：实验仅对12周大鼠膝关节软骨下骨分析，尚不明确不同时期骨关节炎大鼠关节软骨下骨发展变化状况及其与p38MAPK蛋白的关系，这些将有待于课题组后续实验研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

依降钙素干预膝骨关节炎模型大鼠软骨下骨的变化

Changes of subchondral bone in rat models of knee osteoarthritis treated by elcatonin

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[1]	彭智浩, 冯宗权, 邹勇根, 牛国庆, 吴峰. 活动平台单髁置换后下肢力线与外侧间室骨关节炎进展的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1368-1374.
[2]	黄登承, 王志科, 曹学伟. 体外冲击波疗法治疗中老年膝骨关节炎短期疗效对比的荟萃分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1471-1476.
[3]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[4]	曹旭含, 白子兴, 孙承颐, 杨艳军, 孙卫东. “乳香-没药”治疗膝骨关节炎网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 746-753.
[5]	黎永华, 冯强, 谭仁霆, 黄世福, 邱金龙, 尹恒. 杜仲活性成分抗膝骨关节炎滑膜炎病变分子机制的网络药理学阐述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 765-771.
[6]	宋珊, 胡方媛, 乔军, 王佳, 张升校, 李小峰. 基于生物信息学途径认识骨关节炎滑膜的生物学标志物[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 785-790.
[7]	邓桢翰, 黄勇, 肖璐璐, 陈昱霖, 朱伟民, 陆伟, 王大平. 骨形态发生蛋白在关节软骨再生过程中的作用与应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 798-806.
[8]	郑小龙, 何晓铭, 龚水帝, 庞凤祥, 杨帆, 何伟, 刘少军, 魏秋实. 酒精性股骨头坏死患者的骨转换特点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 657-661.
[9]	刘欣, 颜飞华, 洪坤豪. 调控水通道蛋白表达延缓膝骨关节炎模型大鼠软骨退变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 668-673.
[10]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[11]	郑力, 李大地, 胡维帆, 唐金龙, 赵凤朝. 单侧全膝关节置换后对侧膝关节置换的风险评估[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 374-379.
[12]	刘金富, 曾平, 农焦, 范思奇, 冯程钦, 黄佳兴. 整合多组微阵列芯片分析骨关节炎患者滑膜中生物标志物和治疗靶点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3690-3696.
[13]	陈锋, 章晓云, 陈跃平, 廖建钊, 李嘉骏, 宋世雷, 赖渝. 淫羊藿苷元治疗骨关节炎分子机制的网络药理学和生物信息学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3704-3710.
[14]	杨威, 陈泽华, 易志勇, 黄旭东, 韩清民, 张荣华. 关节腔内注射透明质酸与安慰剂治疗早中期膝骨关节炎的疗效差异：基于随机、双盲、对照、临床试验的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3760-3766.
[15]	罗安玉, 刘瀚霖, 谢小飞, 黄琛. 抗氧化合剂对膝骨关节炎模型大鼠结构性退变的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3625-3629.