2.1  流式细胞术检测Lovo细胞来源外泌体的特异性蛋白表达  经流式细胞术检测均高表达外泌体特异性蛋白CD9和CD63，CD9表达率为(70.2±10.2)%，CD63表达率为(79.8±12.6)%，见图1。

2.2  CD8⁺T细胞增殖情况  CFSE是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色剂，在细胞分裂增殖过程中，CFSE标记荧光可平均分配至2个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。流式细胞术分析CD8⁺T细胞CFSE荧光发生递减即增殖的百分比。在CD3/CD28抗体刺激下，与Lovo细胞来源外泌体共培养后CD8⁺T细胞均发生增殖，见图2，实验组CD8⁺T细胞增殖比例低于对照组(P < 0.05)。

2.3  CD8⁺T细胞表面活化标志的表达  CD3/CD28抗体刺激后，流式细胞术检测Lovo细胞来源外泌体与人外周血淋巴细胞共培养后CD8⁺T细胞表面活化标志CD38和HLA-DR的表达。与对照组相比，实验组CD8⁺CD38⁺和CD8⁺HLA-DR⁺在CD3⁺细胞中所占百分比下降(P < 0.05)，见图3。

2.4  CD8⁺T细胞因子的分泌水平  经佛波酯刺激后，流式细胞术检测细胞因子分泌情况。与对照组相比，Lovo细胞来源外泌体与人外周血淋巴细胞共培养后CD8⁺T细胞分泌细胞因子γ-干扰素明显下降(P < 0.05)，白细胞介素2阳性细胞百分比在两组间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

结直肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一，其发病率及病死率均居全球前5位^[1-2]。中国结直肠癌发病率近年逐渐上升，高居恶性肿瘤的第3位，是主要的致死癌症之一。随着医学研究的发展，结直肠癌的治疗方法有了一定提高，但由于其确诊时常常已经是晚期，大多数患者仍预后不良^[3-4]。因此探索新的治疗靶点和诊疗方法对于提高结直肠癌患者的生存率非常必要。

外泌体是直径为30-100 nm的双层膜结构囊泡，由细胞内多囊泡体与胞膜通过“内吞-融合-外排”等过程向胞外分泌的生物活性物质，携带有蛋白成分、细胞因子、脂质和核酸等物质，能够介导细胞之间的信息交流，进而影响细胞功能^[5-7]。研究表明肿瘤微环境中存在压力及低氧因素，这些因素会促使肿瘤细胞分泌大量外泌体^[8-10]。肿瘤外泌体对于免疫细胞的影响是目前的研究热点，一方面认为肿瘤细胞来源外泌体携带有肿瘤抗原，可以被抗原提呈细胞所识别，促进肿瘤免疫应答^[11-13]；另一方面认为肿瘤细胞来源外泌体可促进肿瘤细胞的生长，抑制免疫应答，并帮助癌细胞逃离免疫监视^[14-17]。因此，肿瘤细胞来源外泌体与肿瘤的发生发展、免疫逃逸和微环境建立等方面存在着密切关系。

CD8⁺T细胞是抗病毒感染、移植排斥以及抗肿瘤方面的主要效应细胞。CD8⁺T细胞被活化后可以通过释放细胞因子、穿孔素等毒性物质溶解靶细胞，也可以直接识别病毒感染细胞和肿瘤细胞而发挥杀伤作用，从而承担免疫防御和免疫监视的功能^[18-20]。肿瘤细胞免疫逃逸机制常常使CD8⁺T细胞变得“无能”。该研究旨在初步探讨人结直肠癌细胞系Lovo细胞来源外泌体对人CD8⁺T细胞的免疫调节作用，为结直肠癌的临床治疗研究提供新的思路。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  体外细胞学实验。

1.2  时间及地点  2017年9月至2019年6月在新乡医学院第三附属医院干细胞与脑研究所进行。

1.3  材料 

1.3.1  细胞  人结直肠癌细胞系Lovo购自中国科学院上海细胞库，细胞规格：1×10⁸ L^-1-1×10⁹ L^-1。

1.3.2  实验主要试剂  DMEM培养基、1640培养基、胎牛血清(Gibco公司)；0.22 μm滤过膜(Sigma公司)；醛/硫酸乳胶颗粒(Invitrogen公司)；抗人CD9-FITC、CD63-APC、CD8-BV510、CD38-PE、HLR-DR-APC抗体(Ebioscience公司)；BCA试剂盒(普利莱生物科技有限公司)；人淋巴细胞分离液(天津灏洋)；羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)(Sigma公司)；Dynabeads Human CD3/CD28 (Thermo Fisher公司)；抗人IFN-γ-PE、IL-2-APC抗体(Biolegend公司)；佛波酯(Sigma公司)；蛋白转运抑制剂Brefeldin A(Biolegend公司)；细胞破膜剂、细胞固定剂(Biolegend公司)。

1.3.3  实验主要仪器  离心机(5810R，Eppendorf公司)；倒置显微镜(CKX41，Olympus公司)；CO₂培养箱(Shellab公司)；流式细胞仪(Verse，碧迪公司)。

1.4  方法

1.4.1  细胞培养  使用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基将Lovo细胞重悬，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养，待细胞融合至90%时1∶2传代。

1.4.2  Lovo细胞来源外泌体的分离、鉴定  收集传代培养24 h的细胞培养上清，4 ℃ 300×g离心10 min，去除细胞碎片，上清转移至新的离心管中，4 ℃ 2 000×g离心    20 min，0.22 μm滤器过滤，再将上清转移至新的50 mL离心管中，4 ℃ 10 000×g离心30 min，将上清移至高速离心管中，4 ℃ 100 000×g离心2 h，弃除上清，PBS重悬，采用BCA蛋白质定量试剂盒对外泌体中的蛋白质进行定量，-80 ℃冰箱保存备用。将外泌体结合到醛/硫酸乳胶颗粒以扩增通道信号，然后分别孵育抗体CD9-FITC、CD63-APC，上流式细胞仪检测。

1.4.3  Lovo细胞来源外泌体与人外周血单个核细胞共培养  无菌抽取健康人外周血20 mL，按1∶1比例加入PBS稀释，轻轻加至等体积淋巴细胞分离液面上，2 500 r/min离心25 min，吸取中间白雾层为外周血单个核细胞，PBS洗2遍，用含体积分数为10%胎牛血清的1640培养基重悬，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱过夜，收集悬浮细胞为人外周血淋巴细胞，然后进行CFSE染色，取1×10⁷淋巴细胞，PBS洗2遍以除去培养液中的血清，加入CFSE使其工作浓度为5 mmol/L，轻轻混匀，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中避光孵育8 min，加入等体积血清终止反应，PBS洗去残存的CFSE。将染CFSE的人外周血淋巴细胞以1×10⁵/孔的密度接种于24孔板中，实验组立即加入10 mg/L Lovo细胞来源外泌体，对照组立即加入等量PBS，然后2组加入相同数量的Dynabeads Human CD3/CD28以刺激T细胞的活化、增殖，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养，96 h后取人外周血淋巴细胞检测。

1.4.4  Lovo细胞来源外泌体对CD8⁺T细胞增殖的影响  取实验组和对照组人外周血淋巴细胞，加入PBS        (1 000 r/min离心10 min)洗去细胞碎片，加入抗人CD8以及相应同型对照抗体避光孵育30 min，PBS洗去未结合的抗体，流式细胞术检测CD8⁺T细胞CFSE荧光递减情况。

1.4.5  Lovo细胞来源外泌体对CD8⁺T细胞活化标志表达的影响  取实验组与对照组人外周血淋巴细胞，PBS洗去细胞碎片，加入抗人CD8、CD38和HLA-DR抗体避光孵育30 min，PBS洗去未结合的抗体，流式细胞术检测CD8⁺T细胞表面活化标志的表达。

1.4.6  Lovo细胞来源外泌体对CD8⁺T细胞分泌细胞因子的影响  取实验组与对照组人外周血淋巴细胞，PBS洗2次，以1×10⁵的细胞密度接种于96孔板中，加入佛波酯   0.2 mol/L，1 h后加入蛋白转运抑制剂，置于CO₂培养箱中继续培养3.5 h，收取细胞，PBS洗1次，加入表面抗体CD8避光孵育30 min，加入2 mL固定破膜剂作用20 min，洗去破膜剂，加入胞内抗体γ-干扰素、白细胞介素2避光孵育  40 min，洗涤，流式细胞术检测CD8⁺T细胞因子的分泌情况。

1.5  主要观察指标  人CD8⁺T细胞增殖、活化以及分泌细胞因子的能力。

1.6  统计学分析  采用SPSS 22.0软件进行数据分析，以x(_)±s表示，组间比较采用独立样本t 检验，多组间均数比较采用方差分析。检验水准α=0.05，双侧检验，P < 0.05为差异有显著性意义。流式结果用Flowjo 10.0分析，统计结果均采用GraphPad Prism 7作图。

结直肠癌严重威胁了人类健康，目前关于其分泌外泌体对于免疫细胞影响的研究报道较少。该研究发现与Lovo细胞来源外泌体共培养后CD8⁺T细胞增殖明显减弱，活化中期标志性蛋白CD38、HLA-DR的表达明显下调，T细胞活化、增殖是其发挥免疫应答的前提，因此Lovo细胞来源外泌体能够抑制T细胞应答进而促进机体免疫耐受，这与其他恶性肿瘤外泌体的研究报道相一致^[16-17，21]。CD8⁺T细胞的活化离不开CD4⁺T细胞的辅助，提示该研究中CD4⁺T细胞功能也受到抑制。有效的T细胞免疫应答对于肿瘤免疫至关重要。研究表明肿瘤外泌体结构中含有多种对免疫细胞有抑制功能的生物分子如miRNA、DNA和mRNA等组分，接触免疫细胞后可以诱导相应免疫细胞发生重编程，从而影响免疫细胞活化，将效应性T细胞诱导为调节性T细胞，并促进具有负性调节效应的T细胞大量增殖，发挥免疫抑制作用^[22-23]。

许多肿瘤细胞来源外泌体可以使CD4⁺和CD8⁺T细胞分泌白细胞介素1β、白细胞介素6和白细胞介素10增多，而分泌干扰素γ、白细胞介素2和白细胞介素17减少，促进肿瘤发展^[24-26]。该研究发现Lovo细胞来源外泌体可抑制CD8⁺T细胞分泌细胞因子干扰素γ，但对于白细胞介素2分泌无明显影响。肿瘤来源外泌体抑制免疫应答的具体机制尚不够清楚，除了上述的重编程机制外，有些肿瘤细胞外泌体表面表达凋亡配体如FasL分子、PD1-L和TRAIL等膜表面分子等，可以使CD4⁺T和CD8⁺T细胞发生凋亡，使肿瘤细胞得以免疫逃逸^[27-28]。该实验也观察到在共培养过程中淋巴细胞有死亡的现象，推测Lovo细胞来源外泌体在抑制CD8⁺T细胞免疫应答的同时，也诱导免疫细胞发生凋亡，由于该实验共培养时间较短，未进一步检测。

虽然免疫治疗已经成为肿瘤综合治疗的一部分，但是其临床效果对于大多数的肿瘤患者而言不够理想。肿瘤患者自身的免疫缺陷是主要原因，患者体内存在免疫抑制即肿瘤调节，由肿瘤细胞合成分泌的活性物质分别在细胞、分子和基因水平抑制免疫系统发挥有效的抗肿瘤效应。目前已发现肿瘤来源的多种活性物质具有调节免疫系统功能，使用相应的拮抗剂并不能完全改变其免疫抑制作用，提示在肿瘤患者体内还存在未知的具有免疫调节作用的活性物质。对于这些活性物质的进一步研究为肿瘤免疫逃逸机制提供新的实验基础，为发现肿瘤免疫治疗的新靶点以及探讨新的生物治疗策略提供思路。该研究正是从研究新的免疫逃逸机制这个角度进行的，主要关注CD8⁺T细胞，观察到Lovo细胞来源外泌体对其增殖、活化以及分泌细胞因子都有一定的抑制作用，但是具体的机制仍需进一步研究。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

外泌体：是直径在30-100 nm之间的双层脂质膜囊泡，可由不同类型的细胞分泌，存在于多种体液中，包括血液、尿液、支气管肺泡灌洗液，甚至在唾液和乳汁中也可发现外泌体。

外周血淋巴细胞：外周血单个核细胞是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。外周血淋巴细胞主要包括T细胞和B细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

肿瘤来源外泌体成为近年来研究的热点，肿瘤来源外泌体是肿瘤微环境的一个重要组成部分，其主要通过以下几种方式发挥生物学活性：抗原递呈和受体-配体的相互作用，激活特定的信号转导通路；肿瘤来源外泌体自身携带的膜蛋白与靶细胞的胞膜直接融合，进入靶细胞；通过靶细胞的胞饮等内化机制来实现细胞间的物质运输。在肿瘤免疫中肿瘤来源外泌体被认为具有双重的作用，有学者认为肿瘤来源外泌体表达有肿瘤特异性抗原，这些特异性抗原通过树突状细胞等抗原递呈细胞可以激活T细胞进而介导抗肿瘤免疫反应。还有研究表明肿瘤来源外泌体携带一些小分子物质如miRNA，可以下调T细胞的增殖活化，甚至将CD8⁺T重编程为调节性T细胞，在肿瘤免疫中发挥负性调节作用。该研究结果表明结直肠癌外泌体对于CD8⁺T细胞具有明显的免疫抑制作用，对于今后肿瘤来源外泌体的研究提供一定的实验依据。然而该研究并未同时观察其对于抗原提呈细胞以及CD4⁺T细胞的影响，将在今后的工作中做进一步研究。 

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程