人脐带间充质干细胞对大鼠创伤性脑损伤后血脑屏障的保护

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2109

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (25): 3947-3952.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2109

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人脐带间充质干细胞对大鼠创伤性脑损伤后血脑屏障的保护

陈江龙^1，2，史新宇²，程军³，叶益超^1，2，张震文²，李晓红²，孙洪涛²

¹武警后勤学院，天津市 300162；²脑创伤与神经疾病研究所，武警特色医学中心，天津市 300162；³绍兴市人民医院，浙江省绍兴市 312000

收稿日期:2019-12-03 修回日期:2020-01-07 接受日期:2020-02-19 出版日期:2020-09-08 发布日期:2020-08-20
通讯作者: 孙洪涛，博士，主任医师，脑创伤与神经疾病研究所，武警特色医学中心，天津市 300162
作者简介:陈江龙，男，1988年生，在读硕士，医师，主要从事颅脑创伤研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81671222)；天津市救援医学临床医学研究中心课题任务(15ZXLCSY00040-10)

Protective effect of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells on the rat’s blood-brain barrier after traumatic brain injury

Chen Jianglong^{1, 2}, Shi Xinyu², Cheng Jun³, Ye Yichao^{1, 2}, Zhang Zhenwen², Li Xiaohong², Sun Hongtao²

¹Logistics University of People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China; ²Institute of TBI and Neuroscience, Characteristic Medical Center of Chinese People’s Armed Police Force (PAP), Tianjin 300162, China; ³Shaoxing People’s Hospital, Shaoxing 312000, Zhejiang Province, China

Received:2019-12-03 Revised:2020-01-07 Accepted:2020-02-19 Online:2020-09-08 Published:2020-08-20
Contact: Sun Hongtao, MD, Chief physician, Institute of TBI and Neuroscience, Characteristic Medical Center of Chinese People’s Armed Police Force (PAP), Tianjin 300162, China
About author:Chen Jianglong, Master candidate, Physician, Logistics University of People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China; Institute of TBI and Neuroscience, Characteristic Medical Center of Chinese People’s Armed Police Force (PAP), Tianjin 300162, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81671222; Project of Tianjin Emergency Medicine Research Center, No. 15ZXLCSY00040-10

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

人脐带间充质干细胞：指存在于脐带组织中的一种多功能干细胞，具有自我更新能力和多分化潜能，能释放

各种营养因子和细胞修复因子，改善神经功能，减少细胞凋亡，促进血管生成。

血脑屏障：是由星形胶质细胞、内皮细胞、周细胞及紧密连接构成的屏障系统，是血浆和脑脊液之间的屏障，

能够阻止有害物质由血液进入中枢神经系统。

背景：人脐带间充质干细胞在创伤性脑损伤后血脑屏障修复过程中发挥着至关重要的作用。

目的：探讨人脐带间充质干细胞移植对创伤性脑损伤大鼠血脑屏障的保护作用及可能机制。

方法：①将60只SD大鼠随机分为假手术组、脑损伤模型组、人脐带间充质干细胞组及抑制剂Sunitinib组，每组15只。除假手术组外，其他3组采用大鼠可控性皮质撞击仪制作创伤性脑损伤模型；②造模后0.5，24，48 h，假手术组、脑损伤模型组大鼠经尾静脉注射1 mL生理盐水，人脐带间充质干细胞组、抑制剂Sunitinib组大鼠经尾静脉注射2×10⁹ L^-1人脐带间充质干细胞1 mL，抑制剂Sunitinib组大鼠从造模前1 d开始至处死每天按80 mg/kg的剂量口服PDGFR-β通路抑制剂Sunitinib；③造模后3 d，利用干湿比重法计算各组大鼠脑组织含水量，伊文思蓝法检测血脑屏障的通透性，免疫荧光染色观察GFAP和vWF的表达，Western blot检测血脑屏障相关蛋白及PDGFR-β蛋白的表达。

结果与结论：①与假手术组比较，脑损伤模型组的脑含水量、伊文思蓝含量、vWF和GFAP表达明显升高 (P < 0.05)，ZO-1、Oclaudin-5、PDGFR-β蛋白表达明显降低(P < 0.05)；②与脑损伤模型组比较，人脐带间充质干细胞组的脑含水量、伊文思蓝含量、vWF和GFAP表达明显降低(P < 0.05)，ZO-1、Oclaudin-5、PDGFR-β蛋白表达明显升高(P < 0.05)；使用PDGFR-β抑制剂后人脐带间充质干细胞的治疗作用被明显抑制；③结果表明人脐带间充质干细胞可以降低创伤性脑损伤大鼠血脑屏障的通透性，发挥神经保护作用，其作用机制可能是其提高了损伤区PDGFR-β蛋白的表达。

ORCID: 0000-0002-3744-0152(陈江龙)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词:

人脐带间充质干细胞, 创伤性脑损伤, 血脑屏障, 脑含水量, PDGFR-β通路

Abstract:

BACKGROUND: Human umbilical cord mesenchymal stem cells play a vital role in the repair of the blood-brain barrier after traumatic brain injury.

OBJECTIVE: To investigate the protective effect of human umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation on the blood-brain barrier after traumatic brain injury in rats and its possible mechanism.

METHODS: Sixty Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group, injury control group (model group), cell transplantation group and Sunitinib group, with 15 rats in each group. Traumatic brain injury model was established by improved hydraulic impact method in all the groups except for the sham operation group. Rats in the sham operation group and model group were injected with 1 mL of normal saline, and those in the cell transplantation group were injected with 1 mL of 2×109 /L human umbilical cord blood mesenchymal stem cells. The injection was done via the tail vein at 0.5, 24, and 48 hours after modeling. In the Sunitinib inhibitor group, the rats were given oral PDGFR-β pathway inhibitor, Sunitinib (80 mg/kg), from 1 day before modeling until being executed. Three days after modeling, the water content in brain tissue was measured by dry-wet specific gravity method, the permeability of the blood-brain barrier was measured by Evans blue method, expression of GFAP and vWF was observed by immunofluorescence staining and the expression of blood-brain barrier related proteins and PDGFR-β pathway proteins was detected by western blot method.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the sham operation group, the brain water content of the model group increased significantly (P < 0.05), while that of the cell transplantation group was significantly lower than that of the model group (P < 0.05). The Evans blue content in the model group was significantly higher than that in the sham operation group (P < 0.05), while the Evans blue content in the cell transplantation group was significantly lower than that in the model group (P < 0.05). Compared with the sham operation group, the expression of vWF and GFAP increased significantly in the model group (P < 0.05), while compared with the model group, the expression was significantly reduced in the cell transplantation group (P < 0.05). Western blot showed that ZO-1, Oclaudin-5, and PDGFR-β protein expressions in the model group were significantly lower than those in the sham operation group (P < 0.05), while these expressions were significantly increased in the cell transplantation group as compared with the model group (P < 0.05). To conclude, intravenous injection of human umbilical cord mesenchymal stem cells through the tail ein can reduce the permeability of blood-brain barrier and play a neuroprotective role in rats with traumatic brain injury. Its possible mechanism is related to the promotion of PDGFR-β expression in the injured area.

Key words:

human umbilical cord mesenchymal stem cells, traumatic brain injury, blood-brain barrier, brain water content, PDGFR-β

pathway

中图分类号:

陈江龙, 史新宇, 程军, 叶益超, 张震文, 李晓红, 孙洪涛. 人脐带间充质干细胞对大鼠创伤性脑损伤后血脑屏障的保护[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(25): 3947-3952.

Chen Jianglong, Shi Xinyu, Cheng Jun, Ye Yichao, Zhang Zhenwen, Li Xiaohong, Sun Hongtao. Protective effect of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells on the rat’s blood-brain barrier after traumatic brain injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(25): 3947-3952.

图/表（结果） 7

2.1 人脐带间充质干细胞的鉴定结果光镜下人脐带间充质干细胞呈梭形，细胞间联系紧密，呈螺旋状排列，流式细胞术检测该细胞高表达CD90、CD105、CD73，低表达阴性分子CD19、CD116、CD45、HLA-DR，见图1。

2.2 实验动物数量分析大鼠造模术后感染死亡4只，其中脑损伤模型组2只，人脐带间充质干细胞组1只，抑制剂Sunitinib组1只，均补充SD大鼠完成实验。

2.3 各组大鼠脑组织含水量各组大鼠左侧大脑半球的脑含水量差异不大，脑损伤模型组右侧大脑半球的脑含水量较假手术组明显升高(P < 0.05)，人脐带间充质干细胞治疗后脑水含量较脑损伤模型组明显下降(P < 0.05)，而使用抑制剂Sunitinib之后脑水含量升高，证明人脐带间充质干细胞可以改善脑损伤后脑水肿，但PDGFR-β通路抑制剂则抑制了该作用，见表1。

2.4 各组大鼠脑组织伊文思蓝水平与假手术组相比，脑损伤模型组右侧大脑半球伊文思蓝水平明显上升(P < 0.01)，人脐带间充质干细胞组右侧大脑半球伊文思蓝水平较脑损伤模型组明显下降(P < 0.01)，抑制剂Sunitinib组较人脐带间充质干细胞组明显升高(P < 0.01)，见表2。

2.5 各组大鼠脑组织血脑屏障相关蛋白表达与假手术组相比，脑损伤模型组ZO-1和Occludin表达明显下降(P < 0.01)，人脐带间充质干细胞组ZO-1和Occludin表达较脑损伤模型组明显增加(P < 0.05)，抑制剂Sunitinib组ZO-1和Occludin表达较人脐带间充质干细胞组下降(P < 0.05)，见表3和图2。

2.6 各组大鼠脑组织vWF、GFAP的表达脑损伤后vWF、GFAP表达迅速升高，给予人脐带间充质干细胞尾静脉注射后vWF、GFAP表达下降，而PDGFR-β通路抑制剂Sunitinib则抑制了vWF、GFAP表达的下调，见图3。

2.7 各组大鼠脑组织PDGFR-β蛋白表达假手术组PDGFR-β的表达为0.994±0.070，脑损伤模型组PDGFR-β的表达(0.250±0.060)明显下调，差异有显著性意义(P < 0.01)；与脑损伤模型组比较，人脐带间充质干细胞组PDGFR-β蛋白的表达(0.950±0.130)明显升高，差异有显著性意义(P < 0.01)；与人脐带间充质干细胞组比较，PDGFR-β通路抑制剂Sunitinib组PDGFR-β蛋白的表达(0.640±0.060)降低，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2019年3至10月在武警特色医学中心神经创伤重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物雄性SD大鼠60只，8周龄，体质量250-280 g，由中国人民解放军医学科学院军事科学院提供，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0006。

1.3.2 实验试剂和仪器 DMEM/F12、胎牛血清(Gibco公司)；双抗(索莱宝公司)；羊抗兔ZO-1、Occludin抗体、间充质干细胞专用流式细胞检测试剂盒(BD Stemflow公司)；PDGFR-β通路抑制剂Sunitinib(Selleck公司)；BCA试剂盒(北京雷根生物有限公司)；甲酰胺、伊文思蓝(Sigma公司)；倒置荧光显微镜(CTR 4000，德国Leica公司)；大鼠可控性皮质撞击仪(Model6.3，Custom Design & Fabrication，美国)；水合氯醛(索莱宝公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人脐带间充质干细胞提取培养新生儿脐带由武警后勤学院附属医院妇产科提供，已取得产妇及家属同意，通过武警特色医学中心伦理委员会批准。将人脐带组织剪碎，剪成约1 mm³大小组织块，放入1 g/L胶原酶Ⅳ溶液中，37 ℃条件下搅拌消化20 min，随后转移至1 g/L胰酶溶液继续搅拌消化25 min；用200目细胞筛过滤，将过滤的细胞悬液1 000 r/min离心5 min，去除上清，用DMEM/F12培养基重悬细胞，以1.0×10⁶/cm²的细胞密度接种于含DMEM/F12培养基(含体积分数20%胎牛血清、25 mmol/L谷胺酰胺、1%双抗)的培养瓶中，培养3 d更换培养基，之后两三天换液1次，取第3代细胞进行实验。

1.4.2 流式细胞术鉴定收集第3代人脐带间充质干细胞悬液，2 000 r/min离心5 min，弃上清，加入DMEM培养液制备成细胞浓度为1×10⁹ L^-1的细胞悬液，分别加入CD73、CD90、CD105、CD19、CD116、CD45、HLA-DR抗体，4 ℃避光孵育30 min，PBS冲洗后离心去上清，加入500 μL PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测^[8]。

1.4.3 实验动物分组选用雄性SD大鼠60只，按照随机数字法随机分成4组：假手术组、脑损伤模型组、人脐带间充质干细胞组、抑制剂Sunitinib组，每组15只大鼠。

1.4.4 创伤性脑损伤模型的建立及干预假手术组仅开骨窗暴露硬膜后直接缝合，其余3组采用电子脑皮质损伤撞击仪建立创伤性脑损伤模型。大鼠于术前12 h禁食，腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，深度麻醉后固定于立体定位仪上，术区备皮消毒，切开头皮，暴露右侧矢状缝，在矢状缝右侧旁开1.5 mm，冠状缝向后2.0 mm处磨开一直径约5 mm的圆形骨窗，此过程中要保持脑膜的完整性。大鼠可控性皮质撞击仪制造创伤性脑损伤模型，打击参数：打击深度1.6 mm，速度5 m/s，持续时间120 ms，打击完成后无菌缝合切口。造模后0.5，24，48 h假手术组、脑损伤模型组大鼠经尾静脉注射1 mL生理盐水，共3次，相同时间人脐带间充质干细胞组、抑制剂Sunitinib组大鼠经尾静脉注射2×10⁹ L^-1人脐带间充质干细胞悬液1 mL (以1 mL生理盐水溶解)^[9]，抑制剂Sunitinib组大鼠从造模前1 d开始至处死每天按80 mg/kg的剂量口服Sunitinib。

1.4.5 脑组织含水量测定各组大鼠于造模后3 d处死，快速取脑，分别测量左右两侧湿质量，然后放置于100 ℃烘箱中烘烤24 h，迅速测量干质量，脑组织含水量计算公式：脑含水量(%)=(湿质量-干质量)/湿质量×100%^[10]。

1.4.6 伊文思蓝评估血脑屏障通透性造模后3 d，麻醉后经大鼠尾静脉注射2%伊文思蓝溶液(2 mL/kg)^[11]，注射2 h后用生理盐水灌流，迅速取脑，生理盐水冲洗，滤纸吸取剩余的水分，称取100 mg损伤侧脑组织，放置于3 mL甲酰胺溶液中，充分匀浆后置于60 ℃水浴箱孵育48 h，将匀浆液12 000 r/min离心20 min，取200 μL上清液加入96孔板中，于630 nm处测量吸光度值，制作伊文思蓝标准曲线，利用标准曲线计算伊文思蓝含量。脑组织伊文思蓝含量(μg/g)=伊文思蓝浓度(mg/L)×甲酰胺体积(mL)/脑组织湿质量(g)，从而计算出各组大鼠脑组织中伊文思蓝含量^[12]。

1.4.7 Western blot检测血脑屏障相关蛋白的表达造模后3 d，麻醉大鼠后用生理盐水灌流后取脑，取损伤侧大脑皮质提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量，8%SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1 h，PBST洗3次× 10 min，加入稀释的一抗ZO-1、occludin(稀释度1∶1 000)、PDGFR-β(1∶2 000)于4 ℃孵育过夜，PBST洗3次，加入二抗(1∶5 000)孵育1 h，PBST洗3次，进行凝胶成像系统显影扫描，用Image J软件分析，计算各组目的蛋白和内参的平均灰度值，以GAPDH为内参蛋白。

1.4.8 免疫荧光染色观察vWF、GFAP的表达造模后 3 d，麻醉大鼠后取脑组织，OCT包埋后应用冰冻切片机切片，40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBST洗5次，每次5 min，0.5%Triton X-100破膜20 min，5%BSA封闭30 min，加入vWF、GFAP一抗(1∶100)4 ℃过夜，复温后PBST清洗，加入二抗(1∶200)室温避光孵育1 h，PBST清洗，滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBST洗去多余的DAPI，吸水纸吸干，用含抗荧光淬灭剂的封固液封固^[13]，荧光倒置显微镜观察。

1.5 主要观察指标 ①人脐带间充质细胞光镜下形态及流式细胞术鉴定结果；②各组大鼠脑含水量；③各组大鼠血脑屏障通透性指标伊文思蓝含量及相关蛋白表达；④各组大鼠脑组织vWF、GFAP的表达；⑤各组大鼠脑组织PDGFR-β蛋白表达。

1.6 统计学分析采用GraphPad 7.0软件进行统计分析，计量资料用x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

脑损伤后血脑屏障的破坏导致了血管源性脑水肿^[14]，进而导致脑细胞凋亡坏死^[15]，引起神经功能的破坏，因此在脑损伤后尽早修复血脑屏障至关重要。近期研究表明，间充质干细胞移植可减轻实验动物继发性神经退行性变和神经炎症，促进神经发生和血管生成，改善功能预后^[16]。

ZO-1、Occludin与肌动蛋白相连接构成相对封闭的血脑屏障结构来保护中枢神经系统^[17]，脑损伤后ZO-1、Occludin表达下调，内皮细胞之间的紧密连接被破坏，血脑屏障通透性增加，引起血管源性脑水肿，导致脑组织含水量增加^[18]。伊文思蓝在正常情况下与血清蛋白结合不能通过血脑屏障^[19]，在脑损伤后血脑屏障通透性提高，导致伊文思蓝进入脑组织，因此伊文思蓝染色被认为是评估血脑屏障通透性和血管源性水肿的一种简单可靠的方法^[20]，该实验利用静脉移植人脐带间充质干细胞降低了脑损伤后脑水肿及伊文思蓝水平，就证明人脐带间充质干细胞对血脑屏障有保护作用。血脑屏障主要由内皮细胞、星形胶质细胞及周细胞构成，GFAP和vWF分别为星形胶质细胞和内皮细胞的标记物，ZHU等^[21]研究发现脑出血小鼠血浆中vWF水平增加，并在出血周围区域积聚。与对照组相比，脑室注射vWF组小鼠周细胞覆盖率显著降低，血脑屏障损伤和水肿形成更严重，神经元损伤增加；而阻断抗vWF抗体可减少血脑屏障损伤和水肿形成，改善神经功能。脊髓损伤后GFAP表达升高，给予治疗后则可以降低GFAP的表达^[22]，该实验表明人脐带间充质干细胞静脉注射可以降低脑损伤周围脑组织vWF和GFAP的表达，而PDGRF-β通路抑制剂Sunitinib则可以抑制这种降低，证明了PDGFR-β通路对血脑屏障具有保护作用。

PDGFR-β是一种以同二聚体或异二聚体形式出现的细胞表面酪氨酸激酶受体^[23]。研究表明，PDGFR-β位于外周细胞中，其配体PDGF-β位于内皮细胞中，因PDGFR-β/PDGF-β的相互作用可能是血管化过程中外周-内皮细胞通讯和血脑屏障形成的关键分子途径^[24]。在缺血性脑卒中发生后PDGFR-β的条件性缺失导致梗死范围更大和星形胶质细胞瘢痕形成，提示PDGFR-β和星形胶质细胞之间也存在相互作用^[25]。PDGFR-β途径的基因突变导致小鼠周细胞耗竭，由于跨细胞转运增加，包括IgG和白蛋白在内的高分子物质大量外渗^[26-27]，证明了PDGFR-β信号通路在血脑屏障中起着至关重要的作用。研究表明血小板衍生生长因子对犬肾细胞紧密连接蛋白分布和通透性存在一定的影响，脑损伤后引起PDGF-β/PDGFR-β信号传导障碍，导致内皮细胞紧密连接丧失^[^28-^29]，引起血脑屏障破坏，从而导致ZO-1、Occludin的下调。PDGFR-β主要存在于内皮细胞及星形胶质细胞中，起调控紧密连接蛋白分布的作用，实验证实了脑损伤后PDGFR-β的表达明显下调，当静脉移植人脐带间充质干细胞后PDGFR-β表达上调，通过作用于PDGFR-β保护了血脑屏障相关细胞及其紧密连接，从而增加了ZO-1和Occludin的表达，而使用PDGFR-β抑制剂后治疗作用明显被抑制，这证明了人脐带间充质干细胞通过激活PDGFR-β从而调控血脑屏障的通透性。

总之，人脐带间充质干细胞静脉移植可以显著降低脑损伤大鼠脑组织含水量和伊文思蓝含量，增加紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，减轻血脑屏障的破坏，这与人脐带间充质干细胞激活PDGFR-β信号通路有关。

人脐带间充质干细胞对大鼠创伤性脑损伤后血脑屏障的保护

Protective effect of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells on the rat’s blood-brain barrier after traumatic brain injury

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