灯盏花素对创伤性脑损伤模型大鼠脑组织中蛋白激酶C-γ表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.010

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (49): 7926-7931.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.010

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灯盏花素对创伤性脑损伤模型大鼠脑组织中蛋白激酶C-γ表达的影响

尹延庆，方琦，廖壮槟，林亨，黄梓雄，梁远生，许成杰

广东医学院附属医院神经外科，广东省湛江市 524001

收稿日期:2015-09-07 出版日期:2015-11-30 发布日期:2015-11-30
通讯作者: 许成杰，主任医师，广东医学院附属医院神经外科，广东省湛江市 524001
作者简介:尹延庆，男，1982年生，江苏省射阳县人，汉族，2009年广东医学院毕业，硕士，主治医师，讲师，主要从事中枢神经系统损伤及干细胞方面的研究。并列第一作者：方琦，男，1967年生，广东省雷州市人，汉族，1992年广东医学院毕业，主任医师，主要从事中枢神经系统损伤与肿瘤的研究。并列第一作者：廖壮槟，男，1989年生，广东省汕头市人，汉族，广东医学院在读硕士，主要从事中枢神经系统损伤及干细胞方面的研究。
基金资助:
湛江市科技攻关计划项目(2013B01297/2011C3106021)

Effect of breviscapine on protein kinase C-gamma expression in brain tissue of rat models of traumatic brain injury

Yin Yan-qing, Fang Qi, Liao Zhuang-bin, Lin Heng, Huang Zi-xiong, Liang Yuan-sheng, Xu Cheng-jie

Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, Guangdong Province, China

Received:2015-09-07 Online:2015-11-30 Published:2015-11-30
Contact: Xu Cheng-jie, Chief physician, Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, Guangdong Province, China
About author:Yin Yan-qing, Master, Attending physician, Lecturer, Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, Guangdong Province, China Fang Qi, Chief physician, Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, Guangdong Province, China Liao Zhuang-bin, Studying for master’s degree, Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, Guangdong Province, China Yin Yan-qing, Fang Qi and Liao Zhuang-bin contributed equally to this study.
Supported by:
a grant from Scientific and Technology Plan Project of Zhanjiang City of China, No. 2013B01297/2011C3106021

摘要/Abstract

摘要：

背景：防止创伤性脑损伤后继发性损伤具有重要意义，也是脑保护性治疗的目标。
目的：通过观察灯盏花素对创伤性脑损伤大鼠脑组织蛋白激酶C-γ蛋白表达的影响，初步探讨灯盏花素对脑组织的保护作用。
方法：65只SD大鼠随机分为空白对照组(n=5)、假手术组(n=20)、模型组(n=20)及灯盏花素组(n=20)。模型组及灯盏花素组采用落体撞击制备脑损伤模型，假手术组切开头皮打开骨窗后即缝合。灯盏花素组伤后立即腹腔注射灯盏花素0.4 mg/(kg•d)，模型组和假手术组分别腹腔注射0.4 mL/(kg•d)生理盐水。使用免疫组织化学方法检测大鼠脑组织蛋白激酶C-γ蛋白的表达。
结果与结论：创伤性脑损伤后蛋白激酶C-γ蛋白表达明显增加(P < 0.05)，在24 h到达高峰；灯盏花素能明显减少创伤性脑损伤后蛋白激酶C-γ蛋白表达(P < 0.05)。结果说明灯盏花素对创伤性脑损伤后的脑组织具有保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物模型, 脑及脊髓损伤动物模型, 灯盏花素, 创伤性脑损伤, 继发性脑损伤, 蛋白激酶C-&gamma, 脑保护作用, 同工酶, 抑制剂, 兴奋毒性氨基酸

Abstract:

BACKGROUND: Preventing secondary injury after traumatic injury is of great importance, which is also the target of brain protective treatment.
OBJECTIVE: To preliminarily investigate the protective effect of breviscapine on brain tissue of rat models of traumatic brain injury through observing the effect of breviscapine on protein kinase C-γ expression in injured brain tissue.
METHODS: Sixty-five Sprague-Dawley rats were randomly divided into control (n=5), sham (n=20), model (n=20) and breviscapine (n=20) groups. Rat models of traumatic brain injury were established in the model and breviscapine groups by a falling heavy object. In the sham group, rat bone window was open through an incision made on the scalp, and then the incision was sutured immediately. Rats in the breviscapine group were intraperitoneally injected with 0.4 mg/kg breviscapine daily immediately after injury. Rats in the model and sham groups were intraperitoneally injected with 0.4 mL/kg normal saline. The expression of protein kinase C-γ protein in brain tissue was detected by immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: After traumatic brain injury, the protein expression of protein kinase C-γ was significantly increased (P < 0.05), and reached the peak at 24 hours. Breviscapine could significantly decrease the protein expression of protein kinase C-γ in brain tissue after traumatic brain injury (P < 0.05). These results demonstrate that breviscapine has a protective effect on brain tissue after traumatic brain injury.

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中图分类号:

R318

尹延庆，方琦，廖壮槟，林亨，黄梓雄，梁远生，许成杰. 灯盏花素对创伤性脑损伤模型大鼠脑组织中蛋白激酶C-γ表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(49): 7926-7931.

Yin Yan-qing, Fang Qi, Liao Zhuang-bin, Lin Heng, Huang Zi-xiong, Liang Yuan-sheng, Xu Cheng-jie. Effect of breviscapine on protein kinase C-gamma expression in brain tissue of rat models of traumatic brain injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(49): 7926-7931.

图/表（结果） 2

2.1 造模成功动物数量及过程实验使用SD大鼠65只，分为4组，实验过程无脱落，全部纳入结果分析。实验流程见图1。

2.2 模型方法的改进实验所使用的重型脑损伤大鼠模型是在参考Allen’s落体撞击脑损伤模型的基础上结合实验需要改进制成，预实验时将打击高度另设为6，7，8 cm，均可见打击瞬间大鼠四肢有程度不同的抽搐，程度均较 5 cm高度打击后出现抽搐严重，持续时间更长，伤后打击灶出血汹涌，并随打击高度增加而加重，止血后可见打击灶硬脑膜不同程度破损，大鼠呼吸变得浅慢微弱，较5 cm高度打击的大鼠苏醒时间延长甚至死亡，刺激苏醒后大鼠行走缓慢，并摇晃不稳，右侧前后肢无力支撑躯体而向右倾斜，以右后肢明显；取出脑组织观察可见大鼠左侧大脑半球打击灶附近出现明显的血肿压迫脑组织，剔除血肿后见打击灶出现一个凹坑，表面是絮状坏死脑组织。
2.3 模型的稳定性重型脑损伤后大鼠神经行为表现、打击灶脑组织变化与伤情轻重成正比，致伤压力越大，伤情越重，神经行为废损表现越明显，打击灶脑组织损伤越严重，表明成功建立了重型脑损伤模型，并经预实验反复证实该模型造模稳定性良好。
2.4 蛋白激酶C-γ的免疫组织化学检测结果蛋白激酶C-γ阳性细胞为细胞膜和细胞质呈棕黄色，正常脑组织呈散在弱阳性表达，假手术组内各时间点比较，蛋白激酶C-γ阳性细胞数差异无显著性意义(P > 0.05)。在模型组的患侧大鼠脑组织中大量阳性表达，主要分布在大脑皮质、海马结构附近，以打击灶周围区域明显。在打击后4 h，蛋白激酶C-γ阳性细胞数已明显增加；24 h到达高峰(P < 0.05)，72 h开始减少，且数量与4 h无明显差别(P > 0.05)，但仍高于正常水平(P < 0.05)；120 h进一步减少但仍高于正常水平(P < 0.05)，说明创伤性脑损伤会造成蛋白激酶C-γ阳性神经细胞数明显增加。灯盏花素在不同时间点均能有效抑制蛋白激酶C-γ阳性细胞数的增加(P < 0.05)，但4 h与72 h无明显差别(P > 0.05)。
不同时间点各组大鼠脑组织蛋白激酶C-γ表达变化见表1，图1-4。

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引言

创伤性脑损伤是神经外科最常见的疾病，具有高发生率、高病死率的特点，是导致创伤患者伤残及死亡的主要原因，创伤性脑损伤分为原发性脑损伤和继发性脑损伤，前者无法逆转，而后者却是可逆并对预后具有决定性作用。目前认为继发性脑损伤机制主要有钙超载、过度炎症和兴奋毒性氨基酸毒性3个方面，在继发性脑损伤的发生过程中，可诱发一系列病理生理改变(如脑组织缺血缺氧)、脑组织各种物质(如钙离子、兴奋毒性氨基酸、炎性细胞因子等)代谢紊乱及细胞凋亡等，其引起不同程度、不同范围的脑缺血、出血、水肿等，进一步加重脑损伤程度。因此，控制继发性脑损伤是治疗创伤性脑损伤的关键环节。
蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是一种Ca2+激活磷脂依赖的丝氨酸/苏氨酸激酶家族，是重要的细胞内信号转导分子，在神经递质的释放、离子通道的开放、突触的形成、神经元的兴奋性调节、钙通道的调节、细胞的凋亡过程中发挥重要作用，而蛋白激酶C-γ是中枢神经系统所独有的蛋白激酶C同工酶[1-4]。蛋白激酶C抑制剂虽能减轻缺血性脑损害，具有脑保护作用，但目前使用的蛋白激酶C抑制剂如星型孢菌素、二氢鞘氨醇、他莫昔芬均是抗肿瘤药物，毒性大，价格高，临床上未能应用于脑保护治疗。本实验所采用的灯盏花素是中国传统中药制剂，其有效成分野黄芩甙元(灯盏乙素)对蛋白激酶C具有非竞争性抑制作用[5]。实验通过研究其对创伤性脑损伤的脑保护作用，为灯盏花素的“老药新用”提供理论依据。

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材料方法

1.1 造模动物及材料
1.1.1 实验动物 8周龄SPF级SD大鼠65只，雌雄不限，体质量250-310 g，由广东医学院实验动物中心提供，随机将动物分为空白对照组(n=5)、假手术组(n=20)、模型组(n=20)及灯盏花素组(n=20)，其中后3组再分为术后4，24，72，120 h 4个不同时间点的亚组(n=5)。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
1.1.2 试剂灯盏花素注射液(批号：20130802-1)购自昆明龙津药业股份有限公司；蛋白激酶C-γ单抗购自Sigma公司；SP检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 模型制作方法模型组及灯盏花素组参考Allen’s落体撞击脑损伤模型，将使用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉好的大鼠头颅固定于自制头架上，保持大鼠呼吸通畅，于前后囟之间、中线左旁2.5 mm处钻开颅骨，用止血钳咬开至直径5 mm的圆形骨窗，保持硬脑膜结构完整，将10 g圆柱形状铜锤从探讨出的最佳打击高度(5 cm)沿玻璃管垂直自由落下，恰好穿过U形铜片中间圆孔(直径3.6 mm)撞击于骨窗处硬脑膜，造成局灶性脑损伤后止血缝合头皮。假手术组切开头皮打开骨窗后即缝合。灯盏花素组伤后立即腹腔注射灯盏花素0.4 mg/(kg•d)，模型组和假手术组分别腹腔注射0.4 mL/(kg•d)生理盐水，其中4，24 h亚组注射1 d，72 h亚组注射3 d，120 h亚组注射5 d。手术在无菌条件下进行，造模后待大鼠麻醉苏醒后在笼中自由活动与进食。各组动物分别在术后4，24，72，120 h处死大鼠取脑。
1.3 造模成功的检测标准大鼠造模后出现呼吸抑制及明显神经功能缺损症状，如行动迟缓、易激惹、拖步行走、旋转爬行等。大鼠打击瞬间均有一过性肢体抽搐表现，持续2-5 s，部分大鼠有尿失禁，可出现程度不同的瞳孔对光、角膜、翻正反射消失，持续30-180 s，伤区硬脑膜完好无破损，打击次日大鼠行动基本恢复正常。
断头取脑时大体观察可见模型组及灯盏花素组伤区脑皮质表面有不同程度的挫裂伤，有点状、小片状出血灶或血肿块，脑组织充血、膨隆、肿胀，局部可以高出骨窗。
经苏木精-伊红染色后显微镜下观察模型组及灯盏花素组伤区脑组织病理改变广泛但程度不同，打击灶处皮质形成明显的坏死塌陷

区，软脑膜结构消失，大鼠脑组织均可见到不同程度细胞排列紊乱，蛛网膜下腔出血、血管腔扩大，大脑皮质下广泛组织水肿、毛细血管充血、血管壁增厚、管腔塌陷、神经细胞变性，大脑皮质与深部白质交界区间隙增宽、组织间质水肿、出血等改变。
1.4 免疫组化检测脑组织蛋白激酶C-γ表达将不同时间点的各组大鼠分别断头取脑，40 g/L多聚甲醛溶液固定，常规乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，取出脑组织在损伤灶区域做厚5 μm冠状切片，每张切片均包含大脑皮质及海马结构。采用SP免疫组化染色法检测蛋白激酶C-γ表达。将免疫组化染色切片在200倍光学显微镜下观察，计数损伤侧免疫阳性神经元细胞数(随机选取5个视野，取其平均值)。
1.5 统计学分析采用SAS 8.0 软件完成统计处理，实验数据以x(_)±s表示，采用完全随机设计的方差分析，组间比较用SNK法作q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

蛋白激酶C是由多种不同结构、不同生物活性的同工酶组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族^[6]，蛋白激酶C同工酶的分布广泛且有其特殊性，在脑组织中已发现的同工酶至少有7种，其中，蛋白激酶C-γ为脑和脊髓所独有；蛋白激酶C-δ、蛋白激酶C-ε、蛋白激酶C-ζ在脑组织中含量非常丰富。目前已有动物实验和临床研究表明，蛋白激酶C在许多中枢神经系统疾病如脑出血、脑缺血、缺血再灌注损伤、多发性硬化、神经系统损伤再生中发挥着重要作用^[7-9]。作为中枢神经系统所独有的同工酶蛋白激酶C-γ，主要分布于大鼠的大脑皮质、海马、丘脑、杏仁复合体、小脑皮质、耳蜗腹侧核、三叉神经脊束核尾侧亚核、脊髓背角浅层、皮质脊髓束、浦肯野细胞和丘脑核束^[10-11]；神经系统缺血再灌注损伤后^[12-13]，蛋白激酶C-γ促使兴奋毒性氨基酸释放增加，加重缺血性神经元毒性损害，引起神经元坏死或凋亡^[14-15]。
蛋白激酶C-γ与N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体磷酸化有关，蛋白激酶C-γ的激活，促使兴奋毒性氨基酸释放增加，并可通过非NMDA受体机制抑制谷氨酸的摄取，使细胞外谷氨酸反馈性积聚^[16-17]，从而加重缺血性神经元毒性损害，引起神经元坏死或凋亡^[15]。蛋白激酶C-γ介导的氧化应激、凋亡及炎性反应，是再灌注损伤的重要介质，在脑缺血再灌注损伤中发挥重要的作用^[18]。如何利用一些能够封闭蛋白激酶C活性及阻断细胞因子与受体结合，或蛋白激酶C抑制剂干预蛋白激酶C的激活而缓解脑血管痉挛、改善脑微循环、减少炎性细胞黏附浸润已成为脑保护剂的研究热点^[9，19-20]，因而，蛋白激酶C抑制剂对神经元的保护作用越来越被人们重视。虽然目前已发现蛋白激酶C抑制剂对缺血性脑损伤有很好的改善作用，但是，国内外对创伤性脑损伤后蛋白激酶C变化的研究并不多，急性脑损伤后蛋白激酶C活性增加，并与损伤程度和继发性脑损伤密切相关^[21-22]。Ca2+是中枢神经系统缺血性缺氧性介体，细胞内Ca2+的积聚可引起Ca2+依赖性蛋白酶和磷脂酶的活化，破坏线粒体的功能和细胞的能量代谢，最终导致细胞死亡。蛋白激酶C在Ca2+由胞外进入胞内的过程发挥重要作用，激活的蛋白激酶C可促进神经细胞内的Ca2+积聚，而Ca2+积聚又可以引起蛋白激酶C的移位激活，形成恶性循环^[23-25]。兴奋毒性氨基酸具有神经毒性，蛋白激酶C的激活可以抑制神经元对兴奋毒性氨基酸的摄取，加重损伤后神经细胞外兴奋毒性氨基酸的堆积，兴奋毒性氨基酸受体活化引起神经细胞去极化，造成神经细胞兴奋性增高，引起Na+、K+、Ca2+、Mg2+等离子的通透性增加，使神经元传导冲动的能力减弱或丧失，并造成神经细胞代谢障碍而致神经细胞死亡^[26-27]。创伤性脑损伤后各种神经介质、递质和自由基都释放，通过细胞内信号转导机制，蛋白激酶C可使黏着斑蛋白激酶激活，作用于黏着斑蛋白和踝蛋白，使细胞骨架结构重组，细胞回缩，通透性增加，导致血脑屏障开放，加重脑水肿^[28-29]。
灯盏花素是从菊科植物灯盏细辛中提取的灯盏甲素、乙素的混合物，主要含有灯盏乙素。有学者测定了19种黄酮类化合物对蛋白激酶C活性的影响，其中灯盏花素对蛋白激酶C的抑制作用最强，当增加强有力的蛋白激酶C激活剂DAG的浓度时仍不能消除灯盏花素对蛋白激酶C的抑制作用，说明其对蛋白激酶C的抑制作用属于非竞争性抑制^[5]。目前研究发现脑缺血再灌流可以导致蛋白激酶C的转位激活、神经元凋亡的增加，灯盏花素可以部分阻滞脑缺血再灌流所致的神经元内蛋白激酶C移位激活，从而防止神经元缺血性损伤[30]，并对神经元有保护作用^[31]。灯盏花素还可促进大鼠脑源性神经元的存活、生长^[32]，改善脑出血后大鼠神经功能，控制出血灶周围炎症反应，减少神经细胞凋亡[33]。实验中观察到创伤性脑损伤后蛋白激酶C-γ蛋白表达明显增加，在24 h到达高峰，灯盏花素能明显减少创伤性脑损伤后蛋白激酶C-γ蛋白表达，因此，认为灯盏花素对创伤性脑损伤后的脑组织具有保护作用，其发挥脑保护作用可能是作为蛋白激酶C的非竞争性抑制剂，抑制神经元蛋白激酶C-γ蛋白的表达，进而抑制NMDA受体磷酸化，减少兴奋毒性氨基酸释放，并缓解脑血管痉挛、改善脑微循环、减少炎性细胞黏附浸润。
实验所使用的大鼠重型脑损伤模型是在参考Allen’s落体撞击脑损伤模型的基础上结合实验需要改进制成，将10 g重圆柱形状铜锤从探讨出的最佳打击高度(5 cm)沿玻璃管垂直自由落下，恰好穿过U形铜片中间圆孔撞击于骨窗处硬脑膜，U形铜片作为撞垫置于骨窗硬膜外限制了撞压深度，这种改进的自由落体脑创伤模型具有控制性好、受干扰因素少、可复制分级脑损伤、重复性好等优点^[34]。在现实生活中，人类颅脑损伤的发生多具有不可预见性和复杂性的特点，发生颅脑损伤瞬间的受力方式、方向、强度与颅脑损伤的结果密切相关。目前各种颅脑损伤模型都只能模拟某种病理机制，尚无一种模型可完全模拟人类创伤性脑损伤的复杂受力情况，但均与临床损伤情况部分类似。实验所用的自由落体打击损伤模型能满足损伤外力是可控制、可重复、可计量的，实验结果可用形态学、生理学或行为学等多参数表达，且结果与外力大小有关，模型损伤机制客观上与临床实际相近^[35]，是较好的颅脑损伤动物模型。实验参考神经系统检查、神经功能缺失评定和组织形态学评价对动物模型进行评价^[36-38]。实验大鼠在造模后出现呼吸抑制及明显神经功能缺损症状，如行动迟缓、易激惹、拖步行走、旋转爬行等；大鼠打击瞬间均有一过性肢体抽搐表现，持续2-5 s，部分大鼠有尿失禁，并可出现程度不同的瞳孔对光、角膜、翻正反射消失，持续30-180 s，伤区硬脑膜完好无破损，打击次日大鼠行动基本恢复正常。打击后脑组织经苏木精-伊红染色后显微镜下观察模型组及灯盏花素组伤区脑组织病理改变广泛但程度不同，打击灶处皮质形成明显的坏死塌陷区，软脑膜结构消失，各损伤组大鼠脑组织均可见到不同程度细胞排列紊乱，蛛网膜下腔出血、血管腔扩大，大脑皮质下广泛组织水肿、毛细血管充血、血管壁增厚、管腔塌陷、神经细胞变性，大脑皮质与深部白质交界区间隙增宽、组织间质水肿、出血等改变。苏木精-伊红染色观察各组病变程度形态学改变与免疫组化结果相符，均说明达到重型颅脑损伤模型标准。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

灯盏花素对创伤性脑损伤模型大鼠脑组织中蛋白激酶C-γ表达的影响

Effect of breviscapine on protein kinase C-gamma expression in brain tissue of rat models of traumatic brain injury

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