腱止点过度使用性损伤形成过程中细胞外基质的调节机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2696

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (20): 3174-3179.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2696

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

腱止点过度使用性损伤形成过程中细胞外基质的调节机制

陈晓蓝¹，梁孝天^1，2，张宁¹，刘海涛^1，3，曲艺¹，王博¹，王琳¹

1北京体育大学，北京市 100084；2浙江警察学院，浙江省杭州市 310051；3河南大学，河南省开封市 475000

收稿日期:2019-11-05 修回日期:2019-11-14 接受日期:2019-12-19 出版日期:2020-07-18 发布日期:2020-04-13
通讯作者: 王琳，博士，博士生导师，教授，北京体育大学，北京市 100084
作者简介:陈晓蓝，女，1990年生，安徽省无为县人，汉族，北京体育大学在读博士，主要从事运动医学方面的研究。
基金资助:
国家留学基金(国家建设高水平大学公派研究生项目，留金发[2018]3101)；中央高校基本科研基金(2015ZD003)

Regulatory mechanism of the extracellular matrix during the development of bone-tendon junction overuse injury

Chen Xiaolan¹, Liang Xiaotian^{1, 2}, Zhang Ning¹, Liu Haitao^{1, 3}, Qu Yi¹, Wang Bo¹, Wang Lin¹

1Beijing Sport University, Beijing 100084, China; 2Zhejiang Police College, Hangzhou 310051, Zhejiang Province, China; 3Henan University, Kaifeng 475000, Henan Province, China

Received:2019-11-05 Revised:2019-11-14 Accepted:2019-12-19 Online:2020-07-18 Published:2020-04-13
Contact: Wang Lin, PhD, Doctoral supervisor, Professor, Beijing Sport University, Beijing 100084, China
About author:Chen Xiaolan, PhD candidate, Beijing Sport University, Beijing 100084, China
Supported by:
the National Construction of High-Level University Public Graduate Project, No. [2018]3101; the Fundamental Research Funds for the Central Universities, No. 2015ZD003

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

腱止点：指肌腱附着于骨的附丽部位，又称骨腱结合部。

过度使用性损伤：用次最大负荷反复刺激骨骼肌肉系统，且休息时间不足以使骨骼肌肉系统的结构产生适应，则会发生过度使用性损伤。

背景：过度使用性腱病多发，但目前还没有理想的治疗手段，这是由于腱病的发生机制尚不清楚。

目的：拟通过髌骨髌腱结合部过度使用性损伤模型，探讨负荷积累过程中，影响胶原合成的酶对胶原Ⅰ、胶原Ⅲ代谢的影响。

方法：32只雌性成年新西兰大白兔随机分为跳跃组(n=16)和对照组(n=16)。跳跃组分别进行2，4，6，8周跳跃训练、150次/d，5 d/周，建立兔髌骨髌腱结合部过度使用性损伤模型；对照组为空白对照。2组兔分别在跳跃组训练2，4，6，8周的最后一次训练结束后24 h，进行双侧髌骨髌腱复合体取样。通过免疫组织化学测定基质金属蛋白酶1、组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP1)、胶原Ⅰ、Ⅲ的时序性变化。实验方案经北京体育大学动物实验伦理委员会批准(批准号BSU2015022)。

结果与结论：①基质金属蛋白酶1的活性在训练前6周均显著低于对照组，TIMP1的活性在训练4-8周均显著高于对照组，TIMP1/MMP1在4-8周的训练中均显著高于对照组；②训练的前6周胶原Ⅰ的表达均显著高于对照组；训练8周后胶原Ⅲ的表达显著低于对照组；③结果说明，髌骨髌腱结合部在跳跃负荷积累过程中主要通过增加胶原Ⅰ的表达应对负荷刺激。在负荷积累前2周主要通过抑制基质金属蛋白酶1的活性，增加胶原Ⅰ的表达；负荷积累4-6周主要通过上调TIMP1的活性，抑制基质金属蛋白酶1的活性，增加胶原Ⅰ的表达；负荷积累8周后，TIMP1促进胶原合成的作用不足以拮抗基质金属蛋白酶1降解胶原Ⅰ、Ⅲ的作用，胶原Ⅰ的表达从训练6周后的峰值水平下降到对照组水平，胶原Ⅲ降到低于对照组水平。

ORCID: 0000-0001-6541-558X(陈晓蓝)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 腱病, 过度使用性损伤, 细胞外基质, 基质金属蛋白酶, 组织金属蛋白酶抑制剂

Abstract:

BACKGROUND: Overuse tendinopathy is a common disease with no ideal treatment because the pathogenesis of tendinopathy is still unclear.

OBJECTIVE: To explore the effects of enzymes affecting collagen synthesis on the metabolism of collagen I and collagen III during load accumulation in a model of patella-patellar tendon junction overuse injury.

METHODS: Thirty-two adult female New Zealand white rabbits were randomly divided into a jumping group (n=16) and a control group (n=16). In the jump group, rabbits were subjected to jump training for 2, 4, 6, and 8 weeks, 150 jumps per day, 5 days per week. No intervention was performed in the control group. Bilateral patella-patellar tendon junction samples were taken at 24 hours after 2-, 4-, 6-, and 8- week training. The time-series changes of matrix metalloproteinase 1 (MMP1), tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP1), collagen I, and collagen III were measured by immunohistochemistry. The study was performed with an ethic approval from the Animal Ethical Committee of Beijing Sport University, China (approval No. BSU2015022).

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the MMP1 activity was significantly lower within the first 6 weeks of training, TIMP1 activity was significantly higher at 4-8 weeks of training, and TIMP1/MMP1 was significantly higher at 4-8 weeks of training. Compared with the control group, the expression of collagen I was significantly increased in the first 6 weeks of training, but the expression of collagen III was significantly lowered after 8 weeks of training. TIMP1 activity was significantly positively correlated with collagen I expression, and MMP1 activity was significantly negatively correlated with collagen I expression. To conclude, the patella-patellar tendon junction, during jumping load accumulation, mainly responded to load stimulation by increasing collagen I expression. In the first 2 weeks of load accumulation, the expression of collagen I was mainly increased by inhibiting MMP1 activity; in the period of 4 to 6 weeks of load accumulation, the expression of collagen I was mainly increased by increasing the activity of TIMP1 and inhibiting the activity of MMP1; and after 8 weeks of load accumulation, TIMP1 could promote collagen synthesis but with inability to antagonize the degradation of collagen I and III by MMP1. Then the expression of collagen I decreased from the peak level after 6 weeks of training to the control group level, and the level of collagen III decreased to be less than the level of the control group.

Key words: tendinopathy, overuse injury, extracellular matrix, matrix metalloproteinase, tissue inhibitor of metalloproteinase

中图分类号:

陈晓蓝, 梁孝天, 张宁, 刘海涛, 曲艺, 王博, 王琳. 腱止点过度使用性损伤形成过程中细胞外基质的调节机制[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(20): 3174-3179.

Chen Xiaolan, Liang Xiaotian, Zhang Ning, Liu Haitao, Qu Yi, Wang Bo, Wang Lin. Regulatory mechanism of the extracellular matrix during the development of bone-tendon junction overuse injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(20): 3174-3179.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析实验选用新西兰大白兔36只，分为2组，实验过程中剔除并更换不能形成正常跳跃模式或不能耐受常规训练量的兔子，36只兔进入结果分析。

2.2 免疫组织化学染色结果见图1。

2.2.1 髌骨髌腱结合部过度使用性损伤形成过程中MMP1及TIMP1活性的变化组间比较结果显示，2，4，6周跳跃组MMP1的表达量分别为相应对照组的80%，66%，73%(均为P < 0.01)(图2A)；4，6，8周跳跃组TIMP1的表达量分别为对应对照组的199%，269%和246%(均为P < 0.01)(图2B)；4，6，8周跳跃组TIMP1/MMP1的比值分别为对应对照组的298%，368%和256%(均为P < 0.01)(图2C)。组内比较结果显示，4周跳跃组MMP1表达最低，4，6，8周跳跃组MMP1的表达呈逐渐增加趋势(图2A)；4周跳跃组TIMP1的表达和TIMP1/MMP1的比值最高，4，6，8周跳跃组TIMP1的表达和TIMP1/MMP1的比值呈逐渐减小趋势(图2B，C)。

2.2.2 髌骨髌腱结合部过度使用性损伤形成过程中胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达的变化组间比较结果显示，2，4，6周跳跃组胶原Ⅰ的表达量分别为对应对照组的183%(P < 0.01)，155%(P < 0.05)，302%(P < 0.01)(图3A)；8周跳跃组胶原Ⅲ的表达显著低于相应对照组(P < 0.05)(图3B)；6周跳跃组和8周跳跃组胶原Ⅰ/胶原Ⅲ的比值显著高于相应对照组(分别为P < 0.01和P < 0.05，图3C)。组内比较结果显示，6周跳跃组胶原Ⅰ的表达最高(图3 A)；8周跳跃组胶原Ⅲ的表达显著低于2周跳跃组和4周跳跃组(分别为P < 0.01和P < 0.05，图3B)；6周跳跃组胶原Ⅰ/胶原Ⅲ的比值显著大于2周跳跃组，4周跳跃组(均为P < 0.05)(图3 C)。

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引言

髌腱病，又称“跳跃者膝”，常发生于重复跳跃、变向启动的项目，被认为是由于过度使用导致的退行性改变^[1-3]。髌腱病不仅影响运动员的职业发展，在运动爱好者中也有较高的发病率，其中职业篮、排球运动员髌腱病的发病率高达32%-45%，业余爱好者的发病率为12%- 14%^[4-5]。但是由于过度使用性腱病的发病机制尚不清楚，目前尚无理想的治疗手段^[6]，了解其发病机制将有助于过度使用性腱病的防治。

腱止点中的钙化和未钙化纤维软骨带是损伤发生的重要部位，其主要成分是细胞外基质，细胞外基质在损伤部位力的传递和组织再生中起重要作用，细胞外基质重建失衡可导致腱病的形成^[7-8]。胶原蛋白是肌腱细胞外基质的主要成分，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)可影响胶原蛋白的合成和降解，其中MMPs可促进细胞外基质中胶原蛋白的降解，而TIMPs会抑制MMPs的活性并促进胶原蛋白的合成^[9-10]。MMPs和TIMPs的表达失衡可能导致腱纤维化或变性^[11]。腱病多发于肌腱和骨腱结合部^[12]，骨腱结合部由于结构复杂，一旦损伤很难修复。目前对骨腱结合部过度使用性损伤的研究多集中于损伤后的治疗，骨腱结合部过度使用性损伤的形成与细胞外基质代谢相关的细胞因子及酶类的关系有待研究^[13]，了解骨腱结合部过度使用性损伤形成过程中细胞外基质代谢的调节机制将有助于该部位过度使用性损伤的防治。

此次研究采用宋晓君、梁孝天等^[14-17]建立的电刺激跳跃造成的新西兰大白兔髌骨髌腱结合部过度使用性损伤模型，观测胶原及影响胶原合成的酶活性的时序性变化，探讨髌骨髌腱结合部在负荷积累过程中，影响胶原合成的酶TIMP1和MMP1的活性对胶原Ⅰ、胶原Ⅲ代谢的影响。研究假设髌骨髌腱结合部在负荷积累过程中，TIMP1和MMP1表达失衡，胶原Ⅰ、Ⅲ被过度合成或降解。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 2015年12月至2016年6月在北京体育大学完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 32只雌性成年新西兰大白兔，18周龄，体质量(2.46±0.11)kg，由北京兴隆实验动物中心购入，许可证号：SCXK京，2011-0006。将兔子饲养在20-22 ℃，55%-65%相对湿度环境下，维持在12 h光照- 12 h黑暗周期中，并在实验前适应性饲养7 d。兔子在笼内自由活动和进食。所有实验步骤均在获得北京体育大学动物实验伦理委员会批准(批准号BSU2015022)之后进行。

1.3.2 实验用主要试剂及仪器检测指标所用抗体均购于北京博奥森生物技术有限公司，分别为：Anti-MMP1 (bs-0424R), Anti-TIMP1(bs-0415R), Anti-胶原Ⅰ(bs-0578R)，Anti-胶原Ⅲ(bs-0549R)，SP免疫组织化学检测试剂盒(兔)(SP-0023)。图像采集系统为：尼康50i显微成像系统。图像分析系统为：MetaMorph离线版7.7(美国Molecular Devices Company)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组用随机数字表法将兔随机分为跳跃组(n=16)和对照组(n=16)，跳跃组进行跳跃训练，对照组为空白对照。每组又按取材时间不同分为2，4，6，8周组，每组4只兔子，双侧后肢髌骨髌腱结合部均纳入实验。

1.4.2 跳跃训练方法准备位置：将兔前肢固定在套索装置中，用牵引绳提起，兔子后肢站立在电刺激平台上(瞬时刺激电压为15 kV，电流为10-20 mA，刺激时间为0.4 s/次，刺激频率为5次/min)，与地面之间的夹角约为60°。电刺激使兔子向前上方跳跃，每次跳跃后迅速将兔子放回准备位置。每当平台发出瞬时刺激电压时，都伴随着声音，经过几次适应训练后，兔子可形成条件反射。固定在平台两侧的激光发射器用于监测跳跃高度。低于 15 cm的跳跃高度或跳跃姿势不佳(单脚起跳或落地)的跳跃均不计数。动物训练人员均经过专业培训。

跳跃组的兔子进行3次适应性训练以建立跳跃模式。适应性训练量从30次/d依次递增到50，100次/d。在适应性训练过程中，剔除并更换不能形成正常跳跃模式或不能耐受常规训练量的兔子。正式训练时，每周训练5次，每次训练跳150次(10组×15次)，组间休息3 min。

1.4.3 取材跳跃组兔子分别在跳跃训练2，4，6，8周的最后一次训练结束后24 h，腹腔注射过量25%戊巴比妥钠处死，取双侧后肢髌骨髌腱复合体。对照组分别在相应时间点取材。

1.4.4 组织处理髌骨髌腱复合体处理方法参考实验室前期的研究^[1⁹^]。髌骨髌腱复合体在40 g/L多聚甲醛中固定，10%甲酸中脱钙，梯度乙醇脱水后进行石蜡包埋，然后被制成5.0-6.0 μm的组织切片，用于免疫组织化学染色。

1.4.5 免疫组织化学检测MMP1、TIMP1及胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的表达采用SABC法+DAB显色法。具体为：二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，PBS(pH 7.4)冲洗5 min×3次，0.1% 胰酶抗原修复30 min(37 ℃水浴箱内进行)，PBS冲洗 5 min×3次，H₂O₂封闭15 min，PBS冲洗5 min×3次，体积分数10%山羊血清(SP-0023 试剂A)封闭15 min，分别滴加一抗(Anti-MMP1(bs-0424R)/Anti-TIMP1(bs-0415R)/ Anti-胶原I(bs-0578R)/Anti-胶原Ⅲ(bs-0549R)，1∶100)过夜(16-18 h，4 ℃)，次日37 ℃复温30 min，PBS冲洗5 min×3次，加入生物素化的二抗(SP-0023试剂B) 20 min，PBS冲洗5 min×3次，辣根过氧化物酶(SP-0023 试剂C)20 min，PBS冲洗5 min×3次，滴加DAB显色液染色5-10 min直到出现棕黄色阳性反应，流水冲洗10 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.4.6 图像采集与处理用光学显微镜(Nikon Inc.，Nikon Eclipse 50i，日本)拍摄免疫组织化学染色后的切片，在髌骨髌腱结合部选择四五个400倍视野进行拍摄。使用图像分析系统(MetaMorph Premier Offline 7.7，Molecular Devices Co. LLC，Sunnyvale，CA，美国)分析每个400倍视野下的阳性染色细胞数。

实验人员均经过专业培训，每个指标由2个实验人员分别进行免疫组织化学染色，拍片，分析，最后取2人细胞计数的平均值进行结果分析。

1.5 主要观察指标 ①髌骨髌腱结合部MMP1，TIMP1的活性；②髌骨髌腱结合部胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的表达。

1.6 统计学分析对照组和跳跃组组内不同时间点各指标的变化使用单因素方差分析。首先分析所有数据的方差齐性，如果方差齐，则用LSD方法用于两两比较，如果方差不齐，则使用Tamhane的T2方法进行两两比较。跳跃组和对照组之间的差异用独立样本t 检验分析。所有数据用x(_)±s表示。显著性水平设定为P < 0.05。

讨论

现有研究表明胶原的合成与降解会影响细胞外基质稳态，胶原Ⅰ及胶原Ⅲ与肌腱、腱止点损伤修复关系密切。此次研究发现，负荷积累4-8周过程中TIMP1/MMP1的比值均显著高于对照组，胶原合成代谢占优势；负荷积累前6周MMP1活性受到抑制；负荷积累4-8周TIMP1活性被上调；负荷积累前6周髌骨髌腱结合部胶原Ⅰ表达增加；负荷积累8周后胶原Ⅲ表达降低。

3.1 髌骨髌腱结合部过度使用性损伤形成过程中MMP1和TIMP1活性的变化 MMP1对降解Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原具有较高的酶活性^[²⁰^]，TIMP1可MMP1的活性，促进胶原的合成^[2¹^]。TIMPs/MMPs的比值决定细胞外基质合成和降解的程度，TIMPs/MMPs表达失衡会导致疾病的发生^[11]。此次研究组间比较结果显示，跳跃组MMP1的表达量在前6周均显著低于相应对照组，这说明髌骨髌腱结合部在负荷积累的前6周胶原分解代谢受到抑制。ROONEY等^[²²^]的研究发现，大鼠在8周的非损伤性运动后，肌腱MMPs活性下降，这被认为是对运动负荷的适应。跳跃组TIMP1的表达在训练4-8周后均显著高于相应对照组(均为P < 0.01)，这说明髌骨髌腱结合部在负荷积累4-8周后胶原合成代谢增加。4，6，8周跳跃组TIMP1/MMP1比值均显著高于相应对照组。这说明在负荷积累4-8周后，髌骨髌腱结合部胶原的合成代谢占优势，其中负荷积累4-6周胶原分解代谢受到抑制，负荷积累4-8周后胶原合成代谢提高。组内比较结果显示，训练4周后，MMP1的表达最低，TIMP1的表达和TIMP1/MMP1的比值达高峰；训练4-8周后，MMP1的表达呈逐渐增加趋势，TIMP1的表达和TIMP1/MMP1的比值呈逐渐降低趋势。这说明随着负荷的积累，胶原合成代谢逐渐降低，胶原分解代谢逐渐增加。

3.2 髌骨髌腱结合部过度使用性损伤形成过程中胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达的变化肌腱损伤修复早期，胶原Ⅲ在损伤部位快速合成，恢复组织完整性，随着修复的进行，胶原Ⅲ逐渐被胶原Ⅰ代替^[2³^-2⁴^]，与胶原Ⅲ相比，胶原Ⅰ具有更大的直径和更好的抗牵拉性能^[2⁵^]。因此WANG等^[2⁶^]的研究认为，胶原Ⅰ/胶原Ⅲ的比值可作为评价骨腱结合部愈合质量的一个标准。此次研究结果显示，与对照组相比，训练6-8周后跳跃组胶原Ⅰ/胶原Ⅲ的比值显著增大，这提示跳跃积累6-8周时髌骨髌腱结合部的抗牵拉性能增强。研究仅通过细胞外基质成分推断髌骨髌腱结合部的抗牵拉性能增强，但是否实际提高了抗牵拉性能需要通过力学拉断实验进一步证明，此次研究中没有涉及。训练6-8周后跳跃组胶原Ⅰ/胶原Ⅲ比值的增大，是由于训练6周后胶原Ⅰ的表达达峰值，训练8周后胶原Ⅲ的表达降低导致的。跳跃组胶原Ⅰ的表达量在跳跃训练前6周均显著高于相应对照组，在训练6周后达高峰，在8周后恢复到对照组水平；跳跃组胶原Ⅲ的表达在训练8周后显著低于对照组。这说明，在跳跃负荷积累过程中髌骨髌腱结合部通过增加胶原Ⅰ的表达或胶原Ⅰ在胶原中比例应对跳跃负荷刺激。胶原Ⅰ合成增加，胶原Ⅲ表达减少，以及胶原Ⅰ/胶原Ⅲ比例增加被认为是愈合良好的表现^[2⁷^-2⁸^]。负荷积累8周后，胶原Ⅰ的表达恢复正常水平，作者认为这是髌骨髌腱结合部对跳跃负荷的适应。髌骨髌腱结合部过度使用性负荷累积过程中产生了更多的胶原Ⅰ，这与肌腱损伤修复过程不同，肌腱损伤修复早期产生了更多的Ⅲ型胶原^[²³^-2⁴^]。SONG等^[2⁷^]的研究发现，兔前交叉韧带重建术后进行连续被动运动后骨腱结合部胶原Ⅰ表达增加。运动后产生更多Ⅰ型胶原可能是骨腱结合部应对负荷刺激的特征。

胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的合成降解受MMP1和TIMP1活性的调节。MMP1对降解Ⅰ型、Ⅲ型胶原具有很高的酶活性^[²⁰^]，TIMP1可抑制MMP1的活性，促进胶原的合成^[2¹^]。髌骨髌腱结合部胶原Ⅰ的表达在负荷积累前6周均显著高于对照组。在训练2周后高表达是由于胶原降解酶活性受到抑制，胶原降解代谢受到抑制；在训练4-6周后胶原Ⅰ高表达，是由于胶原合成酶活性被上调，降解酶活性被抑制，胶原合成作用占优势。训练8周后，胶原合成代谢占优势，但是胶原Ⅰ的表达没有随着增加，而是在训练8周后恢复到对照组水平，胶原Ⅲ的表达也显著下降，这说明此阶段胶原的降解增加。虽然与对照组比，训练8周后合成代谢占优势，但是跳跃组内比较发现，训练4-8周后，髌骨髌腱结合部胶原合成代谢呈逐渐降低趋势，胶原降解代谢呈逐渐增加趋势。训练8周后，TIMP1促进胶原合成的作用不足以拮抗MMP1降解胶原Ⅰ、Ⅲ的作用，前6周的负荷中产生的过多的胶原Ⅰ被降解，胶原Ⅰ的表达从训练6周后的峰值水平下降到对照组水平，而胶原Ⅲ降到低于对照组水平。

结论：髌骨髌腱结合部在跳跃负荷积累过程中主要通过增加胶原Ⅰ的表达应对负荷刺激。在负荷积累前2周主要通过抑制MMP1活性，增加胶原Ⅰ的表达；负荷积累4-6周主要通过上调TIMP1的活性，抑制MMP1的活性，增加胶原Ⅰ的表达；负荷积累8周后，TIMP1促进胶原合成的作用不足以拮抗MMP1降解胶原Ⅰ、Ⅲ的作用，胶原Ⅰ的表达从训练6周后的峰值水平下降到对照组水平，胶原Ⅲ降到低于对照组水平。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

腱止点过度使用性损伤形成过程中细胞外基质的调节机制

Regulatory mechanism of the extracellular matrix during the development of bone-tendon junction overuse injury

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