前交叉韧带成纤维细胞与滑膜细胞共培养条件下前列腺素E2的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1692

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (13): 2094-2100.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1692

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前交叉韧带成纤维细胞与滑膜细胞共培养条件下前列腺素E₂的作用

蔡林奕，皮彩霞，谢静

四川大学口腔疾病研究国家重点实验室，四川省成都市 610041

修回日期:2018-11-02 出版日期:2019-05-08 发布日期:2019-05-08
通讯作者: 谢静，博士，副教授，硕士研究生导师，四川大学口腔疾病研究国家重点实验室，四川省成都市 610041
作者简介:蔡林奕，女，1994年生，四川省德阳市人，汉族，四川大学在读硕士，主要从事骨和软骨的基础研究。
基金资助:
国家自然科学青年基金(81600840)

Effects of prostaglandin E₂ in the co-culture of anterior cruciate ligament fibroblasts and synoviocytes

Cai Linyi, Pi Caixia, Xie Jing

State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Revised:2018-11-02 Online:2019-05-08 Published:2019-05-08
Contact: Xie Jing, MD, Associate professor, Master’s supervisor, State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
About author:Cai Linyi, Master candidate, State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (Youth Program), No. 81600840

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
滑膜细胞与前交叉韧带成纤维细胞共培养：生理情况下，膝关节组织中的滑膜细胞和成纤维细胞存在着密切的细胞交流。共培养体系的建立，有助于更真实地反映滑膜细胞在韧带损伤修复过程中的参与作用。在共培养基础上应用前列腺素E₂可进一步模拟韧带损伤后局部微环境的改变。
基质金属蛋白酶组织抑制剂家族：是基质金属蛋白酶家族的生理性抑制剂，能与活化的基质金属蛋白酶家族发生1∶1的结合而抑制其活性。人体内的基质金属蛋白酶组织抑制剂家族有4个成员，几乎对所有基质金属蛋白酶家族有抑制作用，但这一抑制作用有一定的交叉性和选择性。基质金属蛋白酶家族及其抑制剂共同调控细胞外基质的代谢平衡，当二者表达量不均衡时，可导致细胞外基质重建加快，组织难以愈合。研究前列腺素E₂作用下基质金属蛋白酶组织抑制剂家族基因表达的变化有利于从分子生物学角度理解前交叉韧带损伤与修复过程，为前交叉韧带损伤提供针对性治疗方法。

摘要
背景：滑膜细胞与前交叉韧带成纤维细胞共培养体系的建立能在较大程度上模拟韧带损伤后的微环境变化。在前列腺素E₂等炎症因子的刺激下，基质金属蛋白酶家族与基质金属蛋白酶组织抑制剂家族(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)表达量的严重失衡可在一定程度上解释前交叉韧带的不可自我修复特性。
目的：在前交叉韧带成纤维细胞与滑膜细胞共培养的条件下，研究前列腺素E₂对滑膜细胞迁移和TIMPs基因表达的影响。
方法：体外分别进行人滑膜细胞的单培养以及前交叉韧带成纤维细胞与滑膜细胞的Transwell共培养，用前列腺素E₂干预后，细胞划痕实验检测24 h时的滑膜细胞迁移率；半定量PCR分析滑膜细胞中TIMPs基因表达的变化。
结果与结论：①前列腺素E₂处理单培养的滑膜细胞后，细胞迁移率显著下降(P < 0.05)；与共培养滑膜细胞比较，前列腺素E₂对单培养滑膜细胞迁移的抑制作用更为显著(P < 0.05)；②在单培养滑膜细胞中，前列腺素E₂呈浓度依赖性地抑制TIMPs基因的表达(P < 0.05)；对TIMP2和TIMP4而言，这种抑制作用具有时间依赖性；对TIMP1和TIMP3而言，随时间增加，基因表达上调；③共培养滑膜细胞TIMPs基因表达的变化幅度不如单培养细胞显著，且各个时间点的TIMPs基因表达量均高于单培养处理组(P < 0.05)；④结果提示，前列腺素E₂能显著抑制滑膜细胞的迁移和TIMPs的基因表达，而共培养的旁分泌作用可在一定程度上解除这种抑制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4919-7057(蔡林奕)

关键词: 前列腺素E₂, 前交叉韧带, 滑膜细胞, 成纤维细胞, 共培养, TIMPs, 基质金属蛋白酶组织抑制剂家族, 基质金属蛋白酶类, 细胞迁移

Abstract:

BACKGROUND: Co-culture of synoviocytes with anterior cruciate ligament fibroblasts can optimize the simulation of articular microenvironment after ligament injuries. The serious imbalance between the expressions of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) induced by prostaglandin E₂ and other inflammatory factors could certainly indicate the poor self-healing capability of the anterior cruciate ligament.
OBJECTIVE: To investigate the effects of prostaglandin E₂ on cell migration and gene expressions of TIMPs in synoviocytes co-cultured with anterior cruciate ligament fibroblasts.
METHODS: Human synoviocytes were mono-cultured or co-cultured with anterior cruciate ligament fibroblasts in the Transwell chamber. Then the mono-cultured and co-cultured synoviocytes were treated with prostaglandin E₂. Cell migration was assessed by wound healing assay at 24 hours after prostaglandin E₂treatment. Semi-quantitative PCR was done to analyze the gene expressions of TIMPs in synoviocytes.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Prostaglandin E₂ intensely inhibited the cell migration of synoviocytes (P < 0.05), and the inhibitory effect was more significant in the mono-cultured synoviocytes compared with the co-cultured cells (P < 0.05). (2) Gene expressions of TIMPs in the mono-cultured synoviocytes were down-regulated by prostaglandin E₂ in a dose-dependent manner (P < 0.05). The inhibitory effect on TIMP-2 and TIMP-4 was time-dependent, while the gene expressions of TIMP-1 and TIMP-3 were up-regulated with the increase of induction time. (3) The variation of TIMPs expression in the co-cultured group was insignificant as compared with that in the mono-cultured group, but the expression level of TIMPs in the co-cultured group was significantly higher than that in the mono-cultured group at each observational time point (P < 0.05). Thus, prostaglandin E₂ can suppress cell migration and gene expressions of TIMPs in synoviocytes, and this inhibitory action can be partially reversed by the co-culture via the paracrine effect.

Key words: Prostaglandins, Anterior Cruciate Ligament, Matrix Metalloproteinases, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

蔡林奕，皮彩霞，谢静. 前交叉韧带成纤维细胞与滑膜细胞共培养条件下前列腺素E₂的作用[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(13): 2094-2100.

Cai Linyi, Pi Caixia, Xie Jing. Effects of prostaglandin E₂ in the co-culture of anterior cruciate ligament fibroblasts and synoviocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(13): 2094-2100.

图/表（结果） 4

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引言

前交叉韧带损伤后可直接导致关节稳定性的破坏和运动功能的紊乱，并继发邻近组织结构的损伤，甚至是骨关节炎的发生^[1-2]。前交叉韧带在运动中容易受到损伤，其自我修复能力却极其低下^[3]。在临床治疗中，手术修复与重建可在一定程度上恢复膝关节的运动功能和稳定性，但远期效果欠佳。因此，前交叉韧带损伤的修复是临床上的一大难题^[4]。

在膝关节内，前交叉韧带表面被一层滑膜组织包裹，前交叉韧带损伤常常伴随滑膜的损伤。受损的滑膜细胞合成和分泌大量炎性细胞因子促进病变的发展。最终，聚集在局部微环境中的炎性细胞因子，可与机械应力损伤共同刺激滑膜等周围组织合成和分泌前列腺素E₂和多种酶类，加重前交叉韧带的损伤^[5]。另一方面，前交叉韧带损伤后，伤口愈合机制也随之启动。周围组织释放转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1等生长因子进入关节液，后者能显著上调修复相关蛋白的表达^[6]。在影响损伤修复的炎症递质中，前列腺素E₂表达量可在一定程度上反映组织损伤的严重程度^[7]。前列腺素E₂是修复早期的关键调控者，白细胞介素1β等炎性因子与其受体结合后，可通过表达前列腺素E₂进一步激活炎症反应^[8-9]。

细胞外基质的重建是韧带损伤修复的重要过程。基质金属蛋白酶家族是细胞外基质分解代谢的关键酶，该家族成员几乎能降解细胞外基质中的所有蛋白成分^[10]。有研究表明，损伤局部微环境中高表达的基质金属蛋白酶家族可在一定程度上解释前交叉韧带损伤的难以愈合^[11]。进一步研究发现，前交叉韧带成纤维细胞受损后，多种基质金属蛋白酶家族表达量显著上调。而对于自我修复能力较好的内侧副韧带，其成纤维细胞损伤后，仅少数基质金属蛋白酶家族表达出现较小幅度的上调^[12]。基质金属蛋白酶组织抑制剂家族(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)是基质金属蛋白酶家族的生理性抑制剂，可直接与活化的基质金属蛋白酶家族发生1∶1结合而抑制其活性，促进细胞外基质稳定^[13-14]。当TIMPs与基质金属蛋白酶家族的表达量不均衡时，细胞外基质重建加快，组织难以愈合^[15]。然而，目前并未有文献报道过前列腺素E₂对滑膜细胞中TIMPs基因表达的影响。

由于前交叉韧带与滑膜之间的相互作用影响前交叉韧带损伤修复，因此，课题组利用Transwell建立前交叉韧带成纤维细胞与滑膜细胞共培养体系以更大限度地模拟前交叉韧带损伤后的体内环境，在此基础上探讨前列腺素E₂对单培养和共培养条件下滑膜细胞迁移和TIMPs基因表达的影响，对探索组织/细胞间交流有重要的意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞水平分组对照观察实验。

1.2 时间及地点 于2016年5月至10月在四川大学口腔疾病研究国家重点实验室完成。

1.3 材料

实验用主要仪器和试剂：6孔板(Corning，美国)；前列腺素E₂(Sigma，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；RNA抽提试剂盒(Qiagen，美国)；cDNA合成试剂盒(Mbi，美国)；PCR试剂盒(Mbi，美国)；倒置显微镜(Olympus Ⅸ 70，日本)；Thermo-cycler(Bio-Rad，美国)。

细胞来源：前交叉韧带和周围的滑膜组织取自19例因外伤行截肢治疗的患者，排除创伤前膝关节组织中已存在炎性病变的患者，即患有类风湿关节炎、骨关节炎或其他慢性膝关节病变的患者，年龄22-58岁，其中男性12例，女性7例，均来自四川大学华西医院骨科。用于细胞培养的组织主要取自健康韧带的中间部分。经医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养和共培养 实验室主要采用组织培养法培养前交叉韧带成纤维细胞和滑膜细胞^[16-17]。一般来讲，无菌条件下在12 h内取得外伤截肢患者正常前交叉韧带和滑膜组织，用含双抗(200 U/mL)的1×PBS清洗组织3次后，将其剪成2.0 mm×2.0 mm×2.0 mm的小块并迅速使其贴附于T25培养瓶底壁，稳定后加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基3 mL，放入含体积分数5%CO₂的37 ℃孵箱中培养。前交叉韧带成纤维细胞一般会在三四周内爬出组织块；而滑膜细胞一般在2周内爬出组织。待细胞融合度分别达到90%-95%时，进行传代或冻存。实验中前交叉韧带成纤维细胞一般使用2-4代细胞(考虑到前交叉韧带成纤维细胞的数量问题)；而滑膜细胞一般使用4-6代(前3代滑膜细胞会表现出CD45阳性使其带有免疫细胞特性，3代以后的滑膜细胞CD45阴性达到99%而具有纯化的滑膜细胞特性)^[18]。

1.4.2 实验分组与处理 实验分为：①单培养组：滑膜细胞单培养；②单培养处理组：前列腺素E₂处理单培养的滑膜细胞，前列腺素E₂的质量浓度分别为1，5和10 µg/L；③共培养处理组：前列腺素E₂处理共培养的滑膜细胞，前列腺素E₂的质量浓度为5 µg/L。

对于单培养组，将滑膜细胞以1×10⁵ L^-1接种于6孔板，置于体积分数5%CO₂、37 ℃孵箱中培养12 h后，弃去含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，用含体积分数2%胎牛血清的DMEM培养基饥饿细胞12 h，再换成含体积分数1%胎牛血清的DMEM培养基，此时开始计时。

前交叉韧带成纤维细胞和滑膜细胞的共培养按Spector等^[19]所述进行。共培养前，先将滑膜细胞接种于6孔板中使细胞数量达到5×10⁵，同时将前交叉韧带成纤维细胞接种于6孔板对应的Transwell小室中使细胞数量达到5×10⁴。置于体积分数5%CO₂、37 ℃孵箱中培养12 h后，弃去含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，用含体积分数2%胎牛血清DMEM培养基饥饿细胞12 h，再换成含体积分数1%胎牛血清的DMEM培养基，此时立即将种有前交叉韧带成纤维细胞的Transwell套入种有滑膜细胞的6孔板中形成Transwell上、下室，使细胞在其中共培养，并开始计时。

开始计时，同时对种于6孔板中共培养和单培养的滑膜细胞进行不同质量浓度前列腺素E₂的处理，并进行体外划痕实验，在倒置显微镜下观察划痕并采集图像。培养2，6及12 h后，收集1 mL细胞裂解物用于后期的半定量PCR；培养24 h后，在倒置显微镜下观察划痕修复过程，并采集图像。

1.4.3 体外划痕实验 进行前列腺素E₂处理后，用1 mL无菌移液器枪头在6孔板底部长满的单层细胞上迅速而轻轻地划1道竖痕，PBS冲洗2遍，去掉脱落的细胞，继续培养至24 h。在倒置显微镜下观察划痕修复过程，取0和24 h为时间点拍照记录，并测量各时间点的相对痕距，比较不同组细胞迁移率的差异^[20]。

1.4.4 半定量PCR 按试剂盒说明提取滑膜细胞RNA并纯化、定量后，使用cDNA合成试剂盒得到cDNA。使用PCR试剂盒在Thermo-cycler上进行半定量PCR。各基因的引物序列(以GAPDH作为内参)，见表1。半定量PCR反应体系为25 µL，含有1 µL cDNA。每次循环包括变性94 ℃ 30 s，退火57-60 ℃ 30 s，延长72 ℃ 30 s，循环圈数为28。得到的产物在Tris硼酸-乙二胺四乙酸缓冲液中电泳，溴化乙锭染色并显色。Quantity One 4.6.3软件用于分析吸光度值。

1.5 主要观察指标 ①各组细胞迁移情况；②前列腺素E₂处理单培养和共培养滑膜细胞后TIMPs基因的表达

1.6 统计学分析 数据采用SPSS 17.0统计学软件处理与分析，计量资料以x(_)±s表示。组间比较采用方差分析和LSD法，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

韧带的修复是细胞-基质和细胞-细胞直接作用以及旁分泌信号间接作用所介导的动态过程^[21]。生理状态下，滑膜细胞和前交叉韧带成纤维细胞间存在密切的相互作用，这种交流意味着滑膜组织能参与局部微环境的调控并对前交叉韧带的损伤修复有着重要的影响。因此实验借助Transwell共培养体系较大程度地模拟体内微环境，从细胞迁移和细胞外基质调控的角度观察前列腺素E₂作用下单培养和共培养的滑膜细胞迁移和TIMPs表达的变化，以模拟前交叉韧带损伤后滑膜的响应，试图进一步阐明滑膜在前交叉韧带损伤修复中的参与作用。实验发现：①前列腺素E₂能显著抑制滑膜细胞的迁移；②前列腺素E₂以剂量依赖性的方式抑制滑膜细胞中TIMPs的基因表达；③前列腺素E₂作用下，单培养和共培养条件下滑膜细胞对前列腺素E₂刺激的应答存在差异，共培养的旁分泌作用可在一定程度上解除前列腺素E₂对滑膜细胞迁移和TIMPs基因表达的抑制。

关节镜下行前交叉韧带外科重建手术已成为治疗前交叉韧带损伤的重要方法。采用自体或异体移植物、人工合成生物材料等重建前交叉韧带可在一定程度上恢复膝关节的稳定性和功能^[22]。但是，由于对前交叉韧带损伤和修复的机制研究较少，治疗方法较为单一，暂不能提供针对性的治疗方案^[23]。在修复的起始阶段，成纤维细胞在各种趋化因子的作用下迁移到受损部位，这种细胞迁移活动可在局部微环境中一系列促炎因子(如前列腺素E₂)的作用下被抑制，聚集的细胞开始增殖、分化形成肉芽组织以及纤维化，以恢复受损组织的结构和功能^[24]。因此，受多种细胞因子调控的细胞迁移影响修复的进程^[25]。有研究表明，前列腺素E₂能通过上调细胞内环腺苷酸的水平而抑制成纤维细胞迁移^[26]。这种抑制作用可在一定程度上解释某些慢性炎症性疾病中存在的伤口迁延不愈^[27]。当前实验结果表明，前列腺素E₂能显著抑制滑膜细胞的迁移，5 μg/L的前列腺素E₂处理单培养的滑膜细胞24 h后，其迁移率降低了75%。但前列腺素E₂处理共培养的滑膜细胞后，细胞迁移率相比单培养处理组增加。这与之前的研究结果一致，可能由于Transwell上室的前交叉韧带成纤维细胞通过旁分泌的形式作用于下室的滑膜细胞，避免了滑膜细胞迁移过度受抑制，从而维持迁移速度的相对稳定^[28]。

从细胞外基质调控紊乱的角度可在一定程度上解释前交叉韧带损伤后较差的自我修复能力^[29]。细胞外基质中的有机成分构成了组织的骨架，并处于不断更新的过程中。正常生理条件下，这一旧细胞外基质降解和新细胞外基质合成的过程由基质金属蛋白酶和TIMPs调控，二者表达量的相对稳定保证了细胞外基质的代谢平衡。但在各种损伤因子的作用下，基质金属蛋白酶和TIMPs表达失衡，损伤难以愈合^[30]。由于拥有广泛的底物，损伤后高表达的基质金属蛋白酶所致的细胞外基质过快降解被认为是导致前交叉韧带不良修复能力的关键。对滑膜细胞的研究表明，应力损伤和高表达的炎性细胞因子可导致多种基质金属蛋白酶表达上调，包括基质金属蛋白酶1，2和3^[31]。体外进行滑膜细胞与损伤的交叉韧带成纤维细胞共培养，可在交叉韧带成纤维细胞中检测到基质金属蛋白酶1，2和3表达上调^[32]。滑膜组织和韧带中高表达的基质金属蛋白酶可导致细胞外基质的慢性降解，以此方式加剧前交叉韧带损伤。TIMPs是基质金属蛋白酶的生理性抑制剂，能与活化的基质金属蛋白酶发生1∶1的结合而抑制其活性，以维持细胞外基质稳定。TIMPs是一组多功能蛋白，除了维持细胞外基质稳定外，还参与细胞增殖、血管生成、肿瘤浸润与转移等过程的调控。人体内的TIMPs有4个成员，几乎对所有基质金属蛋白酶有抑制作用，但这一抑制作用有一定的交叉性和选择性。TIMP-1能抑制绝大多数基质金属蛋白酶，特别是能与基质金属蛋白酶1，3，9和13的活性形式以及基质金属蛋白酶9的非活性形式发生紧密结合。同时，TIMP-1能在多种细胞因子的诱导下上调。TIMP-2对不同基质金属蛋白酶的抑制作用与TIMP-1相似，特别是基质金属蛋白酶2。不同的是，TIMP-2的表达是组成性的，很少受细胞因子的诱导。TIMP-3通过与细胞外基质结合而发挥作用。与TIMP-1类似，TIMP-3的表达是高度诱导性的，易受细胞因子特别是细胞周期调控蛋白的影响^[33-34]。TIMP-4的表达具有组织特异性，能抑制数个基质金属蛋白酶的活化^[35]。在当前实验中，发现前列腺素E₂以剂量依赖性的方式抑制滑膜细胞中TIMPs的基因表达，当前列腺素E2浓度为10 μg/L时，TIMP-1，TIMP-3和TIMP-4基因表达下调最为显著；TIMP-2基因表达量在前列腺素E2浓度为5 μg/L时下调最多。这种TIMPs表达的异常可以抑制细胞外基质中各有机成分的合成，从而妨碍组织损伤后修复。因此认为，前列腺素E₂所致的滑膜细胞迁移能力和TIMPs基因表达的下降可能是前交叉韧带损伤后难以自我修复的原因之一。在不同时间点观察前列腺素E₂处理后的单培养和共培养滑膜细胞，发现随时间增加，TIMP-1和TIMP-3基因表达量增加，TIMP-2和TIMP-4基因表达量下降，可能是因为TIMP-1和TIMP-3的基因表达易受细胞因子诱导所致。但共培养处理组滑膜细胞中TIMPs随时间变化的幅度不如单培养处理组显著，且共培养的滑膜细胞中TIMPs基因表达量在各个时间点均高于单培养滑膜细胞，这可能是Transwell上室的前交叉韧带成纤维细胞旁分泌作用所致。

当前研究是关于前交叉韧带损伤和修复的机制研究。基于细胞共培养技术，研究前列腺素E₂作用下滑膜细胞迁移和TIMPs的基因表达变化，较大程度模拟体内微环境，有利于揭示滑膜在前交叉韧带损伤修复中的参与作用，为寻找前交叉韧带损伤修复的针对性治疗方案提供理论依据。必须指出，研究还存在着一些不足。首先，滑膜细胞和前交叉韧带成纤维细胞均取自正常组织，不能代表体内损伤状态的细胞。其次，在前交叉韧带损伤患者的滑液中，除了前列腺素E₂的上调，还存在肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β等多种炎症因子的上调，滑膜细胞迁移和TIMPs的表达水平可能受到这些因子的综合作用。而在目前的研究中，只分析了前列腺素E₂作用下滑膜细胞的应答改变，并未涉及其他炎症因子。在与临床结论相比较时，这一方面不可忽视。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

前交叉韧带成纤维细胞与滑膜细胞共培养条件下前列腺素E₂的作用

Effects of prostaglandin E₂ in the co-culture of anterior cruciate ligament fibroblasts and synoviocytes

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