滑膜细胞炎性因子水平及miR-145/MKK4分子轴的关联性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3145

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (14): 2199-2204.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3145

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滑膜细胞炎性因子水平及miR-145/MKK4分子轴的关联性

朱丽璇，崔玥，罗静

云南省第一人民医院疼痛科，云南省昆明市 650032

收稿日期:2019-03-14 修回日期:2019-03-22 接受日期:2020-09-10 出版日期:2021-05-18 发布日期:2020-12-30
通讯作者: 罗静，副主任医师，云南省第一人民医院疼痛科，云南省昆明市 650032
作者简介:朱丽璇，女，1972年生，云南省昆明市人，汉族，1996年昆明医学院毕业，副主任医师，主要从事疼痛诊疗学研究。
基金资助:
云南省卫生科技计划项目(2018NS0243)，项目负责人：罗静

Correlation between inflammatory factors in synovial cells and microRNA-145/mitogen-activated protein kinase 4 molecular axis

Zhu Lixuan, Cui Yue, Luo Jing

Department of Pain, The First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Received:2019-03-14 Revised:2019-03-22 Accepted:2020-09-10 Online:2021-05-18 Published:2020-12-30
Contact: Luo Jing, Associate chief physician, Department of Pain, The First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Zhu Lixuan, Associate chief physician, Department of Pain, The First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
Health Science and Technology Project of Yunnan Province of China, No. 2018NS0243 (to LJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
99Tc-MDP：锝[99Tc]亚甲基二膦酸盐，是99mTc-MDP的异构体，可用于治疗类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、骨坏死、骨关节炎等疾病。
炎症反应：炎症是一种重要的免疫反应，在感染或受伤期间被激活，并在各种有害条件下维持组织稳态，是许多生理病理过程的基础。促炎因子如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、白细胞介素6可促进炎症反应的发生，抗炎因子白细胞介素4、白细胞介素10、白细胞介素13等可抑制炎症反应，正常情况下，促炎因子和抗炎因子之间处于动态平衡。

背景：炎症因子被证明在软骨细胞和双指关节细胞中表达异常，靶向炎症途径可能是治疗骨关节炎的有效策略，但目前鲜有关于滑膜细胞炎症反应的研究报道。
目的：探讨99Tc-MDP通过miR-145/MKK4分子轴对滑膜细胞产生炎性因子的影响。
方法：①骨关节炎成纤维样滑膜细胞(HFLS-RA细胞)经过不同质量浓度99Tc-MDP药物处理48 h，qRT-PCR实验检测HFLS-RA细胞中miR-145以及炎性因子caspase 1、白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α的表达水平，CCK-8实验检测HFLS-RA细胞存活率；②确定99Tc-MDP干预最佳质量浓度后，将HFLS-RA细胞分为4组：NC组(空白对照组，不经任何处理)、99Tc-MDP组(13 μg/L 99Tc-MDP处理HFLS-RA细胞48 h)、99Tc-MDP+miR-145 inhibitor组(13 μg/L 99Tc-MDP处理HFLS-RA细胞48 h同时在细胞中转染miR-145 inhibitor)、99Tc-MDP+miR-145 inhibitor+sh-MKK4组(13 μg/L 99Tc-MDP处理HFLS-RA细胞48 h同时在细胞中转染miR-145 inhibitor+sh-MKK4)，qRT-PCR实验检测HFLS-RA细胞中miR-145以及炎性因子caspase 1、白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α的表达水平，CCK-8实验检测HFLS-RA细胞存活率。
结果与结论：①99Tc-MDP可显著抑制HFLS-RA细胞炎性因子caspase 1、白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α表达和细胞存活率，且半抑制浓度IC50=13 μg/L；②99Tc-MDP可显著上调HFLS-RA细胞中miR-145的表达，下调MKK4表达(P < 0.01)；③miR-145靶向MKK4，且过表达miR-145可显著抑制MKK4的表达；④与99Tc-MDP组相比，99Tc-MDP+miR-145 inhibitor组可显著抑制HFLS-RA细胞中miR-145的表达(P < 0.05)，促进细胞中炎性因子的表达(P < 0.05)和细胞增殖(P < 0.05)，相比较于99Tc-MDP+miR-145 inhibitor+sh-MKK4组，99Tc-MDP+miR-145 inhibitor组可明显促进HFLS-RA细胞增殖(P < 0.05)和炎性因子的表达(P < 0.05)；⑤结果表明，99Tc-MDP通过miR-145靶向下调MKK4抑制HFLS-RA细胞产生炎性因子，缓解骨关节炎发生。

https://orcid.org/0000-0003-3245-8473 (朱丽璇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 99Tc-MDP, miR-145, MKK4, 炎性因子, 炎症, 滑膜细胞, 骨关节炎

Abstract: BACKGROUND: Inflammatory cytokines have been shown to be abnormally expressed in chondrocytes and double-knuckle cells. Targeting inflammatory pathways may be an effective strategy for the treatment of osteoarthritis, but few reports focus on inflammatory responses in synovial cells.
OBJECTIVE: To investigate the effect of 99Tc-MDP on synovial cells-produced inflammatory factors through microRNA-145 (miR-145)/mitogen-activated protein kinase 4 (MKK4) molecular axis.
METHODS: Osteoarthritis fibroblast-like synovial cells (HFLS-RA cells) were treated with 99Tc-MDP of different mass concentrations for 48 hours. The expression levels of miR-145 and inflammatory factors, caspase 1, interleukin (IL)-1, IL-18 and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in HFLS-RA cells were measured by qRT-PCR, and the survival rate of HFLS-RA cells was measured by cell counting kit-8. After determining the optimal mass concentration for 99Tc-MDP intervention, HFLS-RA cells were divided into four groups: blank control group (without any treatment), 99Tc-MDP group (13 μg/L 99Tc-MDP treated HFLS-RA cells for 48 hours), 99Tc-MDP+miR-145 inhibitor group (13 μg/L 99Tc-MDP treated HFLS-RA cells followed by transfection with miR-145 inhibitor), 99Tc-MDP+miR-145 inhibitor+sh-MKK4 group (13 μg/L 99Tc-MDP treated HFLS-RA cells followed by transfection with miR-145 inhibitor+sh-MKK4). The expression levels of miR-145 and the inflammatory factors, caspase 1, IL-1, IL-18 and TNF-α, in HFLS-RA cells were measured by qRT-PCR, and the survival rate of HFLS-RA cell was measured by cell counting kit-8.
RESULTS AND CONCLUSION: 99Tc-MDP significantly inhibited the expression of caspase 1, IL-1, IL-18 and TNF-α as well as the cell survival rate of hFLS-RA cells. The 50% inhibiting concentration of 99Tc-MDP was 13 μg/L. 99Tc-MDP significantly upregulated the expression of miR-145, and downregulated the expression of MKK4 expression in HFLS-RA cells (P < 0.01). MiR-145 targeted MKK4, and overexpression of miR-145 could significantly inhibit the expression of MKK4. Compared with the 99Tc-MDP group, the 99Tc-MDP+miR-145 inhibitor group significantly inhibited the expression of miR-145 in HFLS-RA cells (P < 0.05) and promoted the expression of inflammatory factors in the cells (P < 0.05) and cell proliferation (P < 0.05). Compared with the 99Tc-MDP+miR-145 inhibitor+sh-MKK4 group, the 99Tc-MDP+miR-145 inhibitor group could significantly promote HFLS-RA cell proliferation (P < 0.05) and increase the expression of inflammatory factors in the cells (P < 0.05). To conclude, 99Tc-MDP relieves osteoarthritis by inhibiting HFLS-RA cell-produced inflammatory factors via the downregulation of MKK4 by miR-145.

Key words: , 99Tc-MDP, miR-145, MKK4, inflammatory factor, inflammation, synovial cells, osteoarthritis

中图分类号:

朱丽璇, 崔玥, 罗静. 滑膜细胞炎性因子水平及miR-145/MKK4分子轴的关联性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2199-2204.

Zhu Lixuan, Cui Yue, Luo Jing. Correlation between inflammatory factors in synovial cells and microRNA-145/mitogen-activated protein kinase 4 molecular axis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(14): 2199-2204.

图/表（结果） 4

2.1 99Tc-MDP抑制HFLS-RA细胞分泌炎性因子 qRT-PCR实验结果显示，随着99Tc-MDP质量浓度的增加，HFLS-RA细胞炎性因子caspase 1、白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α表达逐渐降低(P < 0.01)，见图1A。CCK-8实验结果显示，随着99Tc-MDP质量浓度的增加，HFLS-RA细胞存活率逐渐降低，半抑制浓度IC50=13 μg/L(P < 0.01)，见图1B，故后续实验中选择质量浓度为13 μg/L 99Tc-MDP。因此，99Tc-MDP可以抑制HFLS-RA细胞生长，并且抑制HFLS-RA细胞分泌炎性因子。

2.2 99Tc-MDP上调HFLS-RA细胞中miR-145表达的同时下调MKK4表达 qRT-PCR实验结果显示，逐渐增加99Tc-MDP质量浓度至13 μg/L后，HFLS-RA细胞中miR-145表达显著上调(P < 0.01)，见图2A；同时，Western blot实验结果显示，MKK4表达显著下调(P < 0.01)，见图2B。因此，99Tc-MDP促进miR-145表达的同时抑制MKK4表达。

2.3 miR-145靶向下调HFLS-RA细胞中MKK4表达通过生物信息学数据库TargetScan分析得知，miR-145可以与MKK4 3’UTR端靶向结合，见图3A。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与对照组相比，过表达miR-145显著下调野生型质粒的荧光强度(P < 0.01)，见图3B，而突变型质粒的荧光强度与对照组相比无显著差异。Western blot实验结果显示，过表达miR-145可以显著下调HFLS-RA细胞中MKK4表达(P < 0.01)，见图3C。因此，miR-145可以靶向结合MKK4并下调其表达。

2.4 99Tc-MDP通过miR-145靶向MKK4抑制HFLS-RA细胞产生炎性因子 qRT-PCR实验结果显示，HFLS-RA细胞培养基中加入13 μg/L 99Tc-MDP后miR-145表达显著高于NC组；加药的同时转染miR-145 inhibitor后，miR-145表达显著低于加药组；而加药的同时转染miR-145 inhibitor和sh-MKK4后，miR-145表达又显著高于加药并转染miR-145 inhibitor(P < 0.01)，见图4A。
Western blot实验结果显示，99Tc-MDP组MKK4表达明显低于NC组；99Tc-MDP+miR-145 inhibitor组MKK4表达明显高于99Tc-MDP组；而99Tc-MDP+miR-145 inhibitor+sh-MKK4组MKK4表达又明显低于99Tc-MDP+miR-145 inhibitor组(P < 0.01)，见图4B。
CCK-8实验结果显示，99Tc-MDP组HFLS-RA细胞增殖活力显著低于NC组；99Tc-MDP+miR-145 inhibitor组HFLS-RA细胞增殖活力显著高于99Tc-MDP组；而99Tc-MDP +miR-145 inhibitor+sh-MKK4组HFLS-RA细胞增殖活力显著低于99Tc-MDP+miR-145 inhibitor组(P < 0.01)，见图4C。
qRT-PCR实验结果显示，炎性分子caspase 1、白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α表达：99Tc-MDP组显著低于NC组；99Tc-MDP+miR-145 inhibitor组显著高于99Tc-MDP组；99Tc-MDP +miR-145 inhibitor+sh-MKK4组显著低于99Tc-MDP + miR-145 inhibitor组(P < 0.01)，见图4D。99Tc-MDP通过miR-145靶向MKK4抑制HFLS-RA细胞分泌炎性因子caspase 1、白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点实验于2017年3月至2018年6月在云南省第一人民医院完成。
1.3 材料骨关节炎成纤维样滑膜细胞(HFLS-RA，华拓细胞库)。CCK-8试剂盒(碧云天生物科技有限公司)；miR-145 mimics/inhibitor以及sh-MKK4(吉泰生物)；DMEM、胎牛血清、青霉素、链霉素以及Lipofectamine 2000转染试剂盒(赛默飞公司)；TRIZOL、反转录试剂盒以及荧光定量PCR试剂盒(索莱宝公司)；细胞总蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒以及SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(QIAGEN公司)；免疫印迹一抗(MKK4一抗和GAPDH一抗)和二抗(羊抗兔)(Abcam公司)；99Tc-MDP(成都云克药业有限责任公司)。

1.4 实验方法
1.4.1 99Tc-MDP制备按照试剂商提供的操作手册将试剂A(共有5 mL，含0.05 g 99Tc)和试剂B(含5 mg MDP以及0.5 mg氯化亚锡)室温混合5 min，最后调整原液质量浓度为0，1，5，10，20 μg/L。
1.4.2 细胞培养和转染 HFLS-RA细胞用含体积分数为10%胎牛血清以及100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养液传代培养，置于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养。待HFLS-RA细胞生长至对数期，胰酶消化后以每孔1×105个细胞密度接种于24孔板，严格按照Lipofectamine 2 000转染试剂盒说明书将miR-145 mimics/inhibitor以及sh-MKK4转染到HFLS-RA细胞中，72 h后收集细胞，qRT-PCR以及Western blot实验检测转染效率，实验重复3次。
1.4.3 99Tc-MDP处理HFLS-RA细胞取对数生长期HFLS-RA细胞，胰酶消化后分别用0，5，13 μg/L 99Tc-MDP处理HFLS-RA细胞，并置于37 ℃、体积分数为5%CO2环境中培养，48 h后通过qRT-PCR检测各组细胞中炎性因子的表达，CCK-8检测细胞增殖活力。
实验分组：①在2.1部分：0，1，5，10，20 μg/L
99Tc-MDP组；②2.2部分：0，5，13 μg/L 99Tc-MDP组；③2.3部分：MKK4-WT+NC组、MKK4-WT+miR-145 mimics组、MKK4-MUT+NC组、MKK4-MUT+miR-145 mimics组、NC组、miR-145 mimics组；④2.4部分：NC组、99Tc-MDP组、99Tc-MDP+
miR-145 inhibitor组、99Tc-MDP+ miR-145 inhibitor+sh-MKK4组。
1.4.4 qRT-PCR实验检测 miR-145、caspase 1、白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α表达水平收集转染72 h后的细胞，按照TRIZOL说明书提取细胞总RNA，用反转录试剂盒反转成cDNA，以U6为内参检测miR-145表达，以GAPDH为内参检测caspase 1、白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α表达，用荧光定量PCR试剂盒进行扩增并用2-ΔΔCt方法计算细胞中miR-145、caspase 1、白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α表达水平。引物由生工生物工程股份有限公司合成，序列见表1。

1.4.5 Western blot实验检测MKK4表达水平收集转染72 h后的细胞，按照蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，用BCA试剂盒定量。取等量蛋白与上样缓冲液混匀，95 ℃变性10 min，10% SDS-PAGE分离蛋白，并转至PVDF膜上，封闭1 h，随后MKK4一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，次日去除一抗，TBST漂洗3次，每次5 min，加入特异性二抗室温摇床孵育1 h，去除二抗，TBST漂洗3次，每次5 min，最后加入化学发光底物，在凝胶成像系统中显影，用Image J进行条带灰度值分析，实验重复3次。
1.4.6 CCK-8实验检测HFLS-RA细胞增殖活力收集转染72 h后的细胞，按照CCK-8试剂盒说明书将细胞接种至96孔板中，每孔5×103个细胞，置于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养，第0-5天每天同一时间点，每孔加入10 μL CCK-8溶液混匀，37 ℃孵育2 h，检测细胞在450 nm处的吸光度值，实验重复3次。
1.4.7 双荧光素酶报告基因验证miR-145与MKK4的靶向关系通过PCR扩增miR-145与MKK4结合的片段，并连接到双荧光素酶报告基因质粒中，得到MKK4野生质粒；随后突变其结合的位点，用同样的方法得到MKK4突变型质粒。通过测序确定质粒构建成功后，提取质粒与miR-145 mimics共转染到293T细胞中。转染48 h，按照试剂盒说明书检测荧光素酶活性，实验重复3次。
1.5 主要观察指标 ①不同质量浓度99Tc-MDP对HFLS-RA细胞增殖和炎性因子表达的影响；②13 μg/L 99Tc-MDP对miR-145表达的影响；③miR-145和MKK4靶向关系验证；④99Tc-MDP通过miR-145调控MKK4的表达对HFLS-RA细胞增殖和炎性因子表达的影响。
1.6 统计学分析实验数据采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.01为差异有显著性意义。

讨论

骨关节炎是最常见的肌肉骨骼疾病[10]，多达40%的65岁以上人群可能有膝关节或髋关节的症状性骨关节炎[11]。骨关节炎的主要特征是关节软骨逐渐破坏，导致身体残疾和生活质量下降[12-14]。99Tc-MDP的主要成分是氯化亚锡还原锝与亚甲基二膦酸盐的螯合物，用来治疗骨关节炎等疾病[6， 15-17]。研究报道，99Tc-MDP在抑制炎症反应、免疫调节和骨代谢中具有较好的药理作用[17-18]，但是99Tc-MDP抑制滑膜细胞产生炎性因子缓解骨关节炎的发生未见研究报道。因此，该研究主要探究99Tc-MDP缓解骨关节炎发生的可能分子机制。结果发现，99Tc-MDP可以抑制HFLS-RA细胞分泌炎性因子caspase 1、白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α，并且抑制HFLS-RA细胞存活率。
研究报道，miRNA能够调节骨关节炎的发生。例如，过表达miR-26a/26b可以抑制小鼠骨关节炎的发生[19]； miR-140-3p，miR-33b-3p和miR-671-3p鉴定为潜在参与代谢过程的骨关节炎生物标志物[20]；miR-29b-3p促进软骨细胞凋亡并促进骨关节炎的发生和发展[21]。miR-145调节类风湿性关节炎中滑膜成纤维细胞的表型[22]，但miR-145抑制滑膜细胞产生炎性因子尚未有研究报道。查阅相关文献，亦没有文献报道99Tc-MDP是否可以通过调控miRNAs影响滑膜细胞分泌炎性因子。结合上述结果，作者猜测99Tc-MDP可以促进滑膜细胞中miR-145的表达，结果发现miR-145在HFLS-RA细胞中低表达，99Tc-MDP可以上调HFLS-RA细胞miR-145表达。过表达 miR-145可以抑制HFLS-RA细胞增殖并促进其细胞凋亡，也可以抑制HFLS-RA细胞炎性因子caspase 1、白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α表达。
MKK4是一种双特异性激酶，可以磷酸化p38和JNKs[23-25]。p38和JNK的磷酸化反过来介导炎症反应，从而诱导NF-κB和AP-1活化[26]。研究报道，MKK4受上游miRNA调控发挥作用。例如，miR-92a通过靶向MKK4激酶负调节巨噬细胞中的Toll样受体触发的炎症反应[27]；miR-92a通过直接靶向MKK4-JNK1途径抑制H2O2诱导血管平滑肌细胞凋亡[28]；miR-145通过直接抑制MKK4减弱骨关节炎中肿瘤坏死因子α驱动的软骨基质降解[9]。该研究发现，miR-145靶向抑制MKK4表达，并且敲降MKK4抑制HFLS-RA细胞增殖，也可以抑制HFLS-RA细胞炎性因子caspase 1、白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α表达；而同时敲降MKK4和miR-145可以恢复敲降MKK4对HFLS-RA细胞的影响。因此，99Tc-MDP通过miR-145靶向MKK4抑制HFLS-RA细胞产生炎性因子caspase 1、白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α。
综上所述，99Tc-MDP通过miR-145靶向MKK4抑制HFLS-RA细胞产生炎性因子从而缓解骨关节炎发生的分子机制，为今后治疗骨关节炎提供了坚实的实验依据和理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

滑膜细胞炎性因子水平及miR-145/MKK4分子轴的关联性

Correlation between inflammatory factors in synovial cells and microRNA-145/mitogen-activated protein kinase 4 molecular axis

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