补骨脂素逆转谷胱甘肽-S-转移酶π介导的乳腺癌干细胞耐药性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.007

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (13): 2003-2008.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.007

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补骨脂素逆转谷胱甘肽-S-转移酶π介导的乳腺癌干细胞耐药性

花义同，王晓红，许乘凤，程凯，孙洪光，张英哲，刘健，杨振林

滨州医学院附属医院甲状腺乳腺外科，山东省滨州市 256603

修回日期:2017-02-18 出版日期:2017-05-08 发布日期:2017-06-09
通讯作者: 杨振林，博士，教授，滨州医学院附属医院甲状腺乳腺外科，山东省滨州市 256603
作者简介:花义同，男，1990年生，山东省滨州市人，汉族，滨州医学院在读硕士，主要从事乳腺癌耐药方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81173601，30972932)；山东省高等学校科技计划项目(J15LL51)；山东省自然科学基金项目(ZR2014HQ020)；滨州医学院科研计划与科研启动基金(BY2014KYQD36)；滨州市科技发展计划项目(2015ZC0301)

Psoralen reverses glutathione-S-transferase π-mediated multidrug resistance in breast cancer stem cells

Hua Yi-tong, Wang Xiao-hong, Xu Cheng-feng, Cheng Kai, Sun Hong-guang, Zhang Ying-zhe, Liu Jian, Yang Zhen-lin

Department of Breast Thyroid Surgery, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Binzhou 256603, Shandong Province, China

Revised:2017-02-18 Online:2017-05-08 Published:2017-06-09
Contact: Yang Zhen-lin, M.D., Professor, Department of Breast Thyroid Surgery, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Binzhou 256603, Shandong Province, China
About author:Hua Yi-tong, Studying for master’s degree, Department of Breast Thyroid Surgery, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Binzhou 256603, Shandong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81173601, 30972932; the Scientific Research Plan of Shandong Provincial High Educations, No. J15LL51; the Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2014HQ020; the Scientific Research Plan and Initial Fund of Binzhou Medical University, No. BY2014KYQD36; the Science and Technology Development Plan of Binzhou City, No. 2015ZC0301

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
谷胱甘肽-S-转移酶π：催化体内有害极性化合物与谷胱甘肽结合，或通过非酶结合方式将各种潜在毒性化学物质、致癌剂等排出细胞外，保护细胞免受损害。其相对高表达和肿瘤的高侵袭及患者的不良预后有关，与细胞的增殖没有关系，主要涉及肿瘤细胞对化疗药物的耐药。
逆转耐药：肿瘤耐药细胞通过高表达耐药蛋白增加药物外排减少胞内化疗药物浓度，从而降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，导致耐药性的产生。通过减少耐药蛋白的表达或者是抑制其功能，减少化疗药物外排，从而增加胞内化疗药物的浓度，产生更强的杀伤作用。

摘要
背景：乳腺癌干细胞不仅导致乳腺癌的发生，还可能导致乳腺癌的转移及复发。干细胞与细胞耐药性的关系也受到人们越来越多的重视，把治疗的重点放到对干细胞的治疗上，可能会起到意想不到的结果。
目的：探索补骨脂素对人乳腺癌MCF-7/ADR细胞中谷胱甘肽-S-转移酶π的逆转作用及机制。
方法：①无血清培养基悬浮培养富集乳腺癌MCF-7/ADR干细胞群；②以RT-PCR和Western Blot检测0，4，8，12，16 mg/L补骨脂素对MCF-7/ADR干细胞中谷胱甘肽-S-转移酶π基因及蛋白表达水平的影响；③Western Blot技术检测0，8 mg/L补骨脂素处理前后核内核因子κB的活化状态；④RT-PCR技术检测18 μmol/L SN50及8 mg/L补骨脂素对谷胱甘肽-S-转移酶π的表达水平；⑤CCK-8实验检测阿霉素对细胞增殖的影响。
结果与结论：补骨脂素能显著降低MCF-7/ADR细胞中谷胱甘肽-S-转移酶π基因及蛋白表达水平，且补骨脂素能明显抑制核因子κB的活化。提示补骨脂素通过减少谷胱甘肽-S-转移酶π表达水平进而逆转人乳腺癌MCF-7/ADR干细胞多药耐药，其机制可能是通过抑制核因子κB信号通路来实现。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7810-7436(杨振林)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 乳腺癌, 谷胱甘肽-S-转移酶π, 核因子κB, 特异性抑制剂, 逆转剂, 补骨脂素, 多药耐药, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Breast cancer stem cells not only lead to the occurrence of breast cancer, but also may cause breast cancer metastasis and recurrence. The relationship between stem cells and cell resistance is also gaining increasing attentions, and the focus on the stem cell treatment may result in unexpected results.
OBJECTIVE: To explore the reversal effect of psoralen on glutathione-S-transferase π (GST-π) in human breast cancer MCF-7/ADR cells and its mechanism.
METHODS: MCF-7/ADR cells were cultured and enriched in serum-free medium to obtain breast cancer stem cells. RT-PCR and western blot were used to detect the expression of GST-π at the levels of gene and protein in the MCF-7/ADR cells after treatment with 0, 4, 8, 12, 16 mg/L psoralen. To observe the activation of nuclear factor-κB, western blot was used. The expression of GST-π was detected by RT-PCR in 18 μmol/L SN50 group and 8 mg/L psoralen group. Cell counting kit-8 assay was used to detect the effect of doxorubicin on cell proliferation.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, psoralen reduced the expression of GST-π at the mRNA and protein levels, and significantly inhibited the activation of nuclear factor-κB. It was suggested that psoralen could reverse the multidrug resistance of human breast cancer MCF-7/ADR stem cells by decreasing the expression level of GST-π. The mechanism may be achieved by inhibiting the nuclear factor-κB signal pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Psoralens, Breast Neoplasms, NF-kappa B, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

花义同，王晓红，许乘凤，程凯，孙洪光，张英哲，刘健，杨振林. 补骨脂素逆转谷胱甘肽-S-转移酶π介导的乳腺癌干细胞耐药性[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(13): 2003-2008.

Hua Yi-tong, Wang Xiao-hong, Xu Cheng-feng, Cheng Kai, Sun Hong-guang, Zhang Ying-zhe, Liu Jian, Yang Zhen-lin. Psoralen reverses glutathione-S-transferase π-mediated multidrug resistance in breast cancer stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(13): 2003-2008.

图/表（结果） 1

2.1 无血清培养条件下可有效富集乳腺癌干细胞 在无血清培养基中，细胞聚集生长趋势比较明显，同时也会有一部分细胞凋亡。相关文献报道，聚集成球细胞干细胞比例明显增高^[11]。作者所在实验室前期实验也证实这点，多次检测结果表明成球细胞保持干细胞特性^[9]。此次实验显示MCF-7/ADR在完全培养基中贴壁生长，在无血清培养条件下出现聚集成球，贴壁不紧密现象，且有悬浮生长趋势(图1)。

2.2 补骨脂素对MCF-7/ADR细胞GST-π mRNA表达水平的影响 0，4，8，12，16 mg/L补骨脂素处理MCF-7/ADR细胞48 h后，与对照组(0 mg/L)相比，各种质量浓度补骨脂素组MCF-7/ADR细胞中GST-π mRNA表达水平下调(P < 0.05)，但不同质量浓度补骨脂素组GST-π mRNA表达水平差异无显著性意义(P > 0.05；图2)。

2.3 补骨脂素对MCF-7/ADR干细胞中GST-π蛋白表达水平的影响 Western Blot 检测结果表明，MCF-7/ADR细胞存在GST-π蛋白水平的高表达。0，4，8，12，16 mg/L补骨脂素处理MCF-7/ADR细胞后，GST-π蛋白表达水平明显下降(P < 0.05)，且不同质量浓度补骨脂素组GST-π蛋白表达水平差异无显著性意义(P > 0.05；图3)。

2.4 补骨脂素对核因子κB活化状态的影响 选取8 mg/L补骨脂素处理细胞后，Western Blot 检测结果发现补骨脂素能明显抑制核因子κB从胞质向胞核内转移，只有活化后的核因子κB才能进入细胞核发挥作用^[12]，说明补骨脂素能够阻止其向核内转移，明显减弱核因子κB的活化状态(P < 0.05；图4)。

2.5 核因子κB特异性抑制剂对补骨脂素作用的影响 RT-PCR技术检测结果表明，补骨脂素和SN50都能降低GST-π的表达，补骨脂素抑制作用不如SN50明显(P < 0.05)。两者合用对GST-π的抑制作用最强(图5)。

2.6 补骨脂素对逆转耐药性的影响 CCK-8结果显示，不同药物处理后的微球体，阿霉素对其细胞增殖的影响也不同。结果显示，对照组MCF-7/ADR的IC₅₀为(90.37±5.78) mg/L，补骨脂素组MCF-7/ADR的IC₅₀为(79.96±2.93) mg/L，SN50组MCF-7/ADR的IC₅₀为(59.17±3.97) mg/L，补骨脂素+SN50组MCF-7/ADR的IC₅₀为(50.32±3.01) mg/L。可见MCF-7/ADR细胞微球体对阿霉素的IC₅₀明显高于其他处理组细胞，进一步证明补骨脂素能逆转细胞耐药。

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引言

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌，50万妇女因乳腺癌死亡，很大一部分患者由于乳腺癌细胞的多药耐药特性而死亡^[1]。化疗是一种针对肿瘤的治疗方法^[2]，而肿瘤细胞对抗癌药物产生的多药耐药是导致化疗失败的最常见因素，也是困扰肿瘤临床治疗的关键性难题^[3]。因此，积极探索多药耐药的分子基础，发展临床逆转耐药试剂来防止耐药性的发生来对抗肿瘤的多药耐药迫在眉睫。
常规化学药物的作用靶点较为单一，且不良反应较多，所以寻找多作用靶点的中药成为目前研究的热点^[4]。已知某些中药比如人参皂甙单体、柴胡提取物等具有钙离子拮抗作用^[5-6]，并且药物作用相对来说比较温和，能在逆转多药耐药中提高化疗效果，应用及开发前景较为广阔^[7]。补骨脂是补益中药中少有的钙离子拮抗剂，补骨脂素是其主要成分之一^[8]。作者所在实验室前期研究发现，补骨脂素可以逆转乳腺癌MCF-7/ADR耐药细胞株的多药耐药。补骨脂素逆转多药耐药的作用是明确的,能在基因和蛋白水平上明显减少谷胱甘肽-S-转移酶π(glutathione-S- transferase π，GST-π)的表达，但是却没有减少多药耐药蛋白1、多药耐药相关蛋白和肺耐药相关蛋白的表达。逆转耐药具体机制还不十分清楚。作者认为逆转耐药机制可能跟干细胞GST-π表达有关，补骨脂素可能作为GST-π的逆转剂来逆转干细胞的多药耐药的假设，实验拟进一步明确其可能的相关调控机制。

材料方法

1.1 设计 细胞体外培养实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年9月在滨州医学院附属医院临床实验中心完成。

1.3 材料 人乳腺癌细胞阿霉素耐药株MCF-7/ADR、PRMI-1640完全培养基、DMEM培养液、CCK-8试剂盒、核蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物有限公司。补骨脂素购于中国生物制品鉴定所。胰岛素购自诺和公司。B27购自Gibico公司。Maxima SYBR Green qPCR及ReverTra Ace qPCR RT Kit购自Thermo scientific公司。GST-π基因上、下游引物购于上海生工生物股份有限公司。抗体购自Proteintech公司。酶标仪购自北京柏莱斯特科技发展有限公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 将MCF-7/ADR细胞培养在阿霉素浓度为1 mg/L的RMPI-1640完全培养基中，在37 ℃、湿度100%、体积分数5%CO₂和95%空气的培养箱内培养。所有试验均在细胞对数生长期进行。

1.4.2 富集乳腺癌干细胞 选择常规贴壁培养的对数生长期MCF-7/ADR细胞，PBS洗涤，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，重悬于无血清DMEM培养液其中包含20 g/L表皮细胞生长因子、5 mg/L胰岛素、4 g/L牛血清白蛋白和2%的生长因子B27。然后调整细胞浓度为5×10⁸ L^-¹接种于低黏附6孔板中，每孔3 mL，无血清培养液悬浮培养，每天摇动6 孔板数次以阻止细胞贴壁。每3 d半量换液。细胞悬浮成球呈聚集生长趋势，称之为微球体^[9]。

1.4.3 细胞分组干预 称取15 mg补骨脂素粉，用15 mL DMSO溶液溶解，充分搅拌，直至完全溶解，终浓度为1 g/L，过滤，分装，4 ℃避光保存。

作者所在实验室前期研究测得MCF-7/ADR 10%抑制率(IC₁₀)=8 mg/L，20%抑制率(IC₂₀)=20 mg/L，IC₁₀和IC₂₀被认为是无毒浓度或者是低毒浓度^[10]，因而实验选择0，4，8，12，16 mg/L的补骨脂素进行干预。作者所在实验室研究发现补骨脂素处理24 h和48 h细胞变化差异无显著性意义，即补骨脂素作用没有时间依赖性^[10]，因而实验选择48 h作为干预时间。

另外，采用不同的药物分别对细胞进行处理，检测处理前后GST-π基因的表达情况。将MCF-7/ADR干细胞分为4组：对照组、补骨脂素组、SN50组和补骨脂素+SN50组。SN50的干预浓度为18 μmol/L，补骨脂素的干预质量浓度为8 mg/L，各种干预药物同时加入，干预48 h。核因子κB特异性抑制剂SN50能阻断核因子κB信号通路，抑制核因子κB的活化，实验欲研究补骨脂素对核因子κB信号通路的影响，所以选取其特异性抑制剂作为对照。

1.4.4 RT-PCR技术检测GST-π基因的mRNA水平 取0，4，8，12，16 mg/L补骨脂素处理48 h后的细胞，每孔加入1 mL Trizol裂解细胞，将裂解液转入1.5 mL EP管中，室温静置 5 min；每管加入0.2 mL氯仿，涡旋仪上剧烈振荡15 s，室温静置2 min，4 ℃，12 000 r/min 离心15 min，取上层水相移至新的EP管中，加入0.5 mL预冷的异丙醇，颠倒数次，室温静置10 min，4 ℃，12 000 r/min离心10 min；弃上清，加入1 mL体积分数为75%的乙醇(DEPC水配制)洗涤RNA沉淀；4 ℃，10 000 r/min离心5 min；弃去上清，将EP管倒置，室温干燥10 min；每管加入体积分数为0.1%的DEPC水20 μL溶解RNA沉淀。酶标仪测定所提 RNA 的浓度和纯度，含量为1.5-2.0 g/L；260 nm与280 nm处的吸光度比值为1.8-2.0。

以总RNA为模板，以Oligo-dTPrimer为引物按照ReverTra Ace qPCR RT Kit说明书进行操作反转录合成第一链cDNA。按照SYBR R Green Realtime PCR Master Mix试剂盒说明书进行PCR反应，反应引物序列如下(表1)。反应体系为：cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，SYBRGreen PCR Mix 12.5 μL，DEPC H₂O补足总体积至25 μL。反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环，每次扩增设置β-actin为内参对照。制作标准曲线，根据标准曲线扩增效率的一致性，选用2^-^??Ct法计算GST-π基因mRNA的相对表达量。

1.4.5 Western Blot技术检测GST-π及核因子κB表达水平 0，4，8，12，16 mg/L补骨脂素处理48 h的细胞，去培养液，加入3 mL冷PBS洗涤，弃上清，重复2次；加100 μL裂解液冰上裂解30 min；转移至1.5 mL EP管中；4 ℃离心机，12 000 r/min离心15 min，取上清，测蛋白浓度，严格按照凯基核蛋白提取试剂盒说明书提取核蛋白，按4∶1的浓度加5×loading buffer，煮沸15 min；-80 ℃冰箱冻存。

1.4.6 阿霉素对不同药物干预的细胞增殖的抑制实验 不同药物处理后，悬浮培养2 d，半量换液，新鲜培养基清洗3次，调整细胞悬液浓度为5×10⁶ L^-¹，分别种植与96孔板中，每孔100 μL；将处理好的96孔板放入培养箱中过夜，加入终浓度为0.1，1，10，100 mg/L的阿霉素处理48 h，并设置调零孔和对照孔；加入1/10体积CCK-8，体积分数5% CO₂、37 ℃条件下孵育2 h，在酶标仪上选择450 nm波长检测吸光度值。

1.5 主要观察指标 ①细胞中GST-π和核因子κB蛋白的表达情况；②GST-π基因的表达情况；③阿霉素对细胞增殖的抑制作用。

1.6 统计学分析 数据采用x(_)±s表示，两样本间均数比较采用t 检验。所有数据均用SPSS 17.0 统计软件处理。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肿瘤干细胞在肿瘤的发生、发展、转移和复发等方面发挥着重要的作用^[13]，研究发现在乳腺癌等实体肿瘤中有肿瘤干细胞的存在，尽管乳腺癌干细胞存在的比例不高，但是却具有比较高的致瘤性^[14]。乳腺癌干细胞不仅导致乳腺癌的发生，还可能导致乳腺癌的转移和复发^[15]。常规放、化疗手段很难杀死存在于乳腺癌组织中的干细胞，使其成为乳腺癌转移和复发的根源^[16]。富集培养的乳腺癌细胞微球体可能具有一定的干细胞特性，具有干细胞特性的CD44⁺CD24^-^/low细胞比例明显增高^[17]。干细胞耐药的机制之一是表达一种或多种药物运载蛋白，这一点肿瘤干细胞与正常干细胞类似^[18]。CD44⁺CD24^-^/low乳腺癌干细胞活性与多药耐药的相关性密切相关，CD44⁺CD24^-^/low细胞亚群的细胞膜P-糖蛋白荧光强度显著高于MFC-7/ADR细胞株^[19]。有报道指出，与乳腺癌分化细胞相比，乳腺癌干细胞可通过高表达P-糖蛋白及GST-π，低表达拓扑异构酶Ⅱ和肺耐药相关蛋白，而具有更强的耐药性，可能是乳腺癌化疗耐药的关键原因^[20]。因此，把治疗的重点放到对干细胞的治疗上，可能会起到意想不到的结果。

补骨脂为补益类中药中少数的几个具有钙离子通道阻滞剂作用的药物^[21]，补骨脂素为补骨脂的主要成分之一，为呋喃香豆素类化合物，对多种小鼠肉瘤、艾氏腹水瘤、肝癌等有生长抑制和体外细胞毒作用^[22-23]，而且会对肺癌耐药细胞株^[10]，白血病耐药细胞株产生明确的逆转作用^[24]。作者发现在MCF-7/ADR富集球在补骨脂素处理后的48 h后，GST-π的表达水平明显减少。结果表明补骨脂素可以和化疗药物合用，通过抑制耐药细胞株GST-π的表达来增加耐药细胞株对化疗药物的敏感性，补骨脂素可以作为GST-π的抑制剂或逆转剂来用于临床上。

GST-π作为人类细胞基因组的正常表达之一，与许多原癌基因如表皮生长因子受体等相互关联，由同一系列基因调控协调表达，主要作用为催化体内有害极性化合物与谷胱甘肽的结合^[25]，或通过非酶结合方式将各种潜在毒性化学物质、致癌剂等排出细胞外^[26]，保护细胞免受损害。GST-π的相对高表达和肿瘤的高侵袭及患者的不良预后有关^[27]。有证据表明，GST-π与细胞的增殖没有关系，主要涉及肿瘤细胞对化疗药物的耐药^[28]。MCF-7/ADR细胞GST-π表达水平明显高于其亲本MCF-7细胞，同时说明MCF-7/ADR细胞的耐药性与GST-π的水平有关，GST-π高表达参与其耐药^[29]。Kamada等^[30]研究发现，GST-π可以通过减少DNA的损伤来减少细胞的凋亡。MCF-7/ADR富集球经补骨脂素处理后，GST-π的表达水平明显减少。

核因子κB是1986年从B淋巴细胞核抽提物中检出的核蛋白因子，具有多项转录调节作用，核因子κB信号传导途径参与应激反应和免疫细胞活化、增殖、分化、凋亡及肿瘤形成等相关的多种基因转录的调控^[31]。核因子κB几乎存在于所有细胞的胞质中，只有当它被激活从细胞质转位于细胞核后才可以发挥重要的调节作用^[32]。近年来研究发现,核因子κB的异常激活与肿瘤的耐药性密切相关^[33]。有研究证实，核因子κB是多因素多药耐药机制的上游调节位点^[34]，运用核因子κB抑制剂可以增加化疗药物的敏感性^[35]。补骨脂素可以明显减少细胞核内核因子κB的表达水平^[36-44^]。作者发现，补骨脂素可以通过减少核因子κB的活化来减少胞核内的表达水平。核因子κB的活化状态可以通过免疫荧光方法来检测，得到的数据也跟先前的研究结果相一致^[36]。核因子κB的特异性抑制剂SN50处理乳腺癌MCF-7/ADR干细胞后，GST-π的表达水平与空白组相比明显减少。作者认为GST-π很可能就是核因子κB信号通路下游的关键因子。实验证明了此假设可以成立。

综上，补骨脂素可以通过抑制核因子κB信号通路减少富集球中核因子κB的活化来减少GST-π的表达水平，从而逆转GST-π介导的多药耐药。补骨脂素可以被用来作为化疗增敏剂来提高临床化疗效果，其逆转作用是肯定的，从而可能为治疗乳腺癌寻求到毒不良反应小的中药耐药逆转剂，在临床上开辟一条新的化疗道路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

补骨脂素逆转谷胱甘肽-S-转移酶π介导的乳腺癌干细胞耐药性

Psoralen reverses glutathione-S-transferase π-mediated multidrug resistance in breast cancer stem cells

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