不同途径移植骨髓单个核细胞修复创伤性脑损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.019

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (28): 4531-4536.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.019

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不同途径移植骨髓单个核细胞修复创伤性脑损伤

赵楠¹，刘俊¹，李俊彦¹，马钢¹，李进¹，王廷华²，苏平¹

¹昆明市第一人民医院神经外科，云南省昆明市 650011；
²昆明医科大学神经科学研究所，云南省昆明市 650031

出版日期:2015-07-02 发布日期:2015-07-02
通讯作者: 苏平，主任医师，昆明市第一人民医院神经外科，云南省昆明市 650011
作者简介:赵楠，男，1978年生，河北省唐山市人，汉族，2007年昆明医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事干细胞及神经系统修复的研究。
基金资助:
云南省应用基础研究面上项目(省科社会发展2008CD195-1)；昆明市科技计划项目(昆科计字08S100304-5号)

Bone marrow mononuclear cell transplantation for repair of traumatic brain injury via different approaches

Zhao Nan¹, Liu Jun¹, Li Jun-yan¹, Ma Gang¹, Li Jin¹, Wang Ting-hua², Su Ping¹

¹Department of Neurosurgery, the First People’s Hospital of Kunming, Kunming 650011, Yunnan Province, China;
²Institute of Neuroscience, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China

Online:2015-07-02 Published:2015-07-02
Contact: Su Ping, Chief physician, Department of Neurosurgery, the First People’s Hospital of Kunming, Kunming 650011, Yunnan Province, China
About author:Zhao Nan, M.D., Associate chief physician, Department of Neurosurgery, the First People’s Hospital of Kunming, Kunming 650011, Yunnan Province, China
Supported by:
a grant from the Applied Basic Research Program of Yunnan Province, China, No. 2008CD195-1; Science and Technology Program of Kunming City, No. 08S100304-5

摘要/Abstract

摘要：

背景：干细胞移植存在多种途径，目前还无法确定哪一种是最佳途径。而对于不同的脑损伤个体，所移植的细胞种类、移植途径和移植时间都将会影响到治疗效果。

目的：探讨不同途径移植骨髓单个核细胞对脑损伤大鼠神经功能的影响。

方法：Ficoll淋巴细胞分离液梯度离心分离大鼠骨髓单个核细胞，CFDA-SE体外标记后备用；自由落体法制备大鼠创伤性脑损伤模型，模型制作成功后，立即通过损伤区、侧脑室和颈内动脉移植CFDA-SE标记的骨髓单个核细胞，每一种移植途径都设对照组(以等体积的DMEM代替骨髓单个核细胞)。治疗后不同时间点进行mNSS评分，最后一次行为学评分完毕取脑组织，荧光倒置显微镜下观察骨髓单个核细胞在损伤区域的存活和迁移情况。

结果与结论：治疗后7，10，14 d，对照组和移植组mNSS评分均较1 d和3 d时降低(P < 0.05)；治疗后7 d和10 d，颈内动脉移植组和对照组相比mNSS评分降低(P < 0.05)；治疗后14 d，颈内动脉移植组荧光细胞数量较其他组多(P < 0.05)，且分布广。结果表明经颈内动脉移植骨髓单个核细胞能明显改善大鼠神经功能，且移植细胞能够在损伤区大量存活和迁移。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 骨髓单个核细胞, 创伤性脑损伤, 移植途径, 颈内动脉移植, 损伤区移植, 侧脑室移植, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: There are several routes for stem cell transplantation; however, it is still unable to determine which one is the best. As for the different individuals with brain injury, the type of transplanted cells, transplantation route and time will affect the therapeutic effects.

OBJECTIVE: To investigate the effect of bone marrow mononuclear cells transplanted via different approaches on neurological function of rats with traumatic brain injury.

METHODS: Bone marrow mononuclear cells of rats were administered gradient centrifugation with Ficoll lymphocyte separation medium, and were labeled with CFDA-SE in vitro as standby. Rat models of traumatic brain injury were established by the method of freefall. After successful establishment of rat models, bone marrow mononuclear cells labeled with CFDA-SE were immediately transplanted into rats via injured area, lateral ventricle and internal carotid artery. One control group was designated for each transplantation route (bone marrow mononuclear cells were replaced with the same volume of DMEM). The degree of neurological deficits was evaluated using mNSS scores at different time points after treatment. The brain tissue was harvested after the last neurobehavioral evaluation. The survival and migration of bone marrow mononuclear cells in the injured area were observed under an inverted fluorescent microscope.

RESULTS AND CONCLUSION: At 7, 10, and 14 days after treatment, the mNSS scores of rats in all groups were all lower than those at 1 and 3 days (P < 0.05). At 7 and 10 days, the mNSS scores of rats in the internal carotid artery transplantation group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05). At 14 days after treatment, the number of fluorescence-labeled cells of rats in the internal carotid artery transplantation group was greater than that in the other groups (P < 0.05) and these labeled cells were widely distributed. The results demonstrate that the neurological function of rats can be improved by transplanting bone marrow mononuclear cells via the internal carotid artery, and a large number of transplanted cells can survive and migrate in the injured area.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow Cells, Brain Injuries, Cell Transplantation

中图分类号:

R394.2

赵楠，刘俊，李俊彦，马钢，李进，王廷华，苏平. 不同途径移植骨髓单个核细胞修复创伤性脑损伤[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(28): 4531-4536.

Zhao Nan, Liu Jun, Li Jun-yan, Ma Gang, Li Jin, Wang Ting-hua, Su Ping. Bone marrow mononuclear cell transplantation for repair of traumatic brain injury via different approaches[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(28): 4531-4536.

图/表（结果） 1

2.1 大鼠脑损伤模型制作的大体观察自由落体打击后大鼠可出现一过性肢体抽搐，并有一过性呼吸抑制。模型死亡率约10 %，主要是因为颅内出血过多，打击后呼吸停止。死亡大鼠由同批大鼠再次造模后取代。大体观察打击后即刻受力点局部范围内渗血并有急性硬膜下血肿形成，数分钟后渗血自动停止。

2.2 骨髓单个核细胞的体外分离及标记收集的骨髓细胞悬液，经密度梯度离心法分离后得到骨髓单个核细胞，但仍含有少量红细胞、淋巴细胞等多种类的细胞(< 3%)，锥虫蓝染色显示细胞活性>95%(图1)。

CFDA-SE的全称为Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，是一种近年来被广泛应用于细胞增殖检测用荧光探针，也可以用于细胞的荧光示踪。荧光显微镜下呈绿色，可显示整个细胞形态(图2)。细胞标记率> 95%，且荧光不容易淬灭和衰减。

2.3 各组大鼠mNSS神经功能评分所有大鼠造模后可立即出现弓背、毛发竖立，短暂呼吸抑制，伤后1 d，大鼠均出现左下肢瘫痪，行走时绕左侧下肢转圈，不能直线行走。假手术组术后mNSS评分与正常大鼠比较无明显变化。除假手术组外，其他所有组治疗后7，10，14 d mNSS评分明显较1 d和3 d时降低(P < 0.05)，治疗后14 d时运动功能恢复较快，mNSS评分已接近正常大鼠。

治疗后7 d和10 d，颈内动脉移植组与对照组相比mNSS评分降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。损伤区移植组和侧脑室移植组所有时间点mNSS评分与相应对照组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.4 骨髓单个核细胞在损伤区域的存活和迁移骨髓单个核细胞移植14 d后，荧光显微镜下发现：①损伤区移植组荧光细胞总数较少，主要集中在移植针道附近，损伤区域较少(图3)。②侧脑室移植组移植细胞较损伤区稍多，主要分别于脑室及损伤区周边(图4)。③颈内动脉移植组荧光细胞数量较多，在右侧大脑分布广，皮质下、损伤区等都有荧光细胞(图5)。经计数及统计学分析，颈内动脉移植组的绿色荧光细胞(41.8±14.1)明显多于侧脑室移植组与损伤区移植组(27.5±12.8，18.0±10.3)，侧脑室移植组明显多于损伤区移植组(P < 0.05)。

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引言

急性创伤性脑损伤是神经外科危重急症，其死亡率高，幸存者也往往遗留后遗症。以神经和胚胎为主要来源的干细胞治疗已有很长一段时间，并取得了一定的成果，但它们的推广应用受到了很多限制^[1]。于是人们不断寻找其他适合的移植细胞，例如基质细胞、间充质干细胞、嗅鞘细胞等。到目前为止，还没有找到一种可以满足全部要求的细胞。

骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells, BM-MNCs)集成了所有骨髓干细胞成分(包含骨髓造血干细胞、骨髓间充质干细胞、骨髓基质细胞、内皮前体细胞、边缘细胞群以及功能不明的干细胞等)，它较单一类型的干细胞成分有以下的优势：①具有多种干/祖细胞成分，在一定条件下可分化为神经细胞或内皮细胞^[2-4]，并具有旁分泌作用^[5-11]，分泌大量的细胞因子，促进小血管新生，改善了组织供血。②不仅提供了组织修复的细胞物质基础，还提供了骨髓干细胞分化所必需的细胞因子及分化依赖的诱导微环境。③分离过程简单、方便，避免了复杂的体外培养过程，更好地保留了骨髓干细胞多向分化潜能和自动迁移性。因此，设想骨髓单个核细胞用于脑损伤治疗应是一个可行的方法。

现在常用的治疗中枢神经系统疾病的移植途径有靶点移植^[12]、外周血管注射(静脉及动脉)^[13]、经脑脊液移植^[14]。但无法确定哪一种是最佳途径，甚至还无法确定是否存在最佳途径。目前的研究还停留在两种途径之间进行比较^[2^，^15-17]。本研究观察不同途径移植骨髓单个核细胞对大鼠脑损伤神经功能恢复的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2009年10月至2012年1月在昆明医科大学神经科学研究所完成。

材料：

实验动物：雄性SD大鼠84只，清洁级，6周龄，体质量(200±20) g，由昆明医科大学动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

不同途径移植骨髓单个核细胞治疗创伤性脑损伤实验所用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
胎牛血清	Gibico公司
CFDA-SE	碧云天
Ficoll淋巴细胞分离液	沈阳文尔生物技术有限公司
MCO-15AC细胞培养箱	Sanyo公司
医用超净操作台	AIR TECH公司
DM- IRB荧光显微镜、CM I900冰冻切片机	Leica公司
轨道式大鼠脑立体定位仪	瑞沃德
LDZ5-2离心机	北京医用离心机厂

实验方法：

大鼠脑损伤模型的制作：采用Feeney自由落体致伤法制备大鼠创伤性脑损伤模型。麻醉后，切开头皮，用牙科钻于右侧顶部冠状缝后1.5 mm，中线旁开2.5 mm钻孔，扩大骨窗至直径5 mm，在其上垫一灭菌垫片，保持硬膜完整。以50 g的铁质圆柱体自30 cm高处沿金属杆自由落体撞击垫片，造成皮质运动区中度挫裂伤。打击后迅速移去打击装置，防止二次打击和持续压迫。假手术组除了不用自由落体打击大脑皮质，其余同模型组。造模后进行改良神经功能缺损评分(mNSS)：13-18分为严重损伤，7-12分为中度损伤，1-6分为轻度损伤。

骨髓单个核细胞的体外分离及标记：将20只SD大鼠断颈处死后，取出双侧胫骨和股骨，用低分子肝素盐水(50 U/mL)反复冲洗骨髓腔收集骨髓细胞；适量DMEM离心洗涤2次(室温，1 500 r/min，5 min)，去除脂肪和胶质成分；用密度为1.077 g/mL的Ficoll淋巴细胞分离液梯度离心(室温，2 000 r/min，15 min)，吸取中间云雾状的单个核细胞层，DMEM离心洗涤2次备用。

使用前CFDA-SE用二甲基亚砜溶解成10 mmol/L的贮液，-20 ℃保存；临用前，取适量用PBS稀释成10 μmol/L的工作液备用；调整各组细胞悬液的浓度为1×10¹⁰ L^-¹，加入等体积CFDA-SE工作液，37 ℃放置10 min；离心后弃标记液，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM离心洗涤细胞。

实验动物分组：64只SD大鼠随机分为8组，每组8只，分别为假手术组、模型组、损伤区移植组、损伤区移植对照组、侧脑室移植组、侧脑室移植对照组、颈内动脉移植组、颈内动脉移植对照组。

不同方法移植骨髓单个核细胞治疗脑损伤模型大鼠：模型制作成功后，立即用CFDA-SE标记的骨髓单个核细胞进行移植治疗，采用3种常用的移植途径，每一种移植途径都设对照组(以等体积的DMEM代替骨髓单个核细胞)。

损伤区移植：移植部位位于损伤区域中心(冠状缝后 1.5 mm，中线旁开2.5 mm，深3 mm)，以0.5 μL/min的速度注入5 μL(2×10¹¹ L^-¹)的骨髓单个核细胞悬液，停留10 min后缓慢拔针。

侧脑室移植：向右侧脑室(冠状缝后0.9 mm，中线旁开1.4 mm，垂直进针约4.2 mm)移植骨髓单个核细胞，其余步骤同前。

颈内动脉移植：分离右颈内动脉和颈外动脉，以丝线轻扎颈外动脉后，用5号头皮针穿刺颈总动脉，穿刺成功后向内缓慢注入1 mL的骨髓单个核细胞悬液(5×10⁹ L^-¹)，停留10 min退针，压迫止血，松开颈外动脉扎线。

大鼠行mNSS神经功能评分：分别于损伤后1，3，7，10，14 d，对大鼠进行mNSS神经功能评分^[18-21](表1)。由3位熟悉评分标准的非本组实验人员进行评分，评分后取平均值。

骨髓单个核细胞在损伤区域的存活、迁移：大鼠在最后一次行为学评分完毕后，40 g/L多聚甲醛灌注、取脑，连续冰冻冠状切片，片厚20 μm，隔20取1。在荧光倒置显微镜下，用200倍在损伤区周围取5个非重叠视野，计数荧光细胞总数。

主要观察指标：①各组大鼠治疗不同时间点mNSS神经功能评分。②骨髓单个核细胞在各组大鼠损伤区域的存活和迁移情况。

统计学分析：用SPSS 10.0软件进行统计处理，计量资料采用x(_)±s表示，采用t 检验和方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义

讨论

3.1 骨髓单个核细胞的体外分离实验通过梯度离心分离的骨髓单个核细胞纯度高，每只大鼠至少可以分离得到2×10⁷的细胞，细胞活性>95%。利用5 µmol/L的CFDA-SE标记骨髓单个核细胞，具有操作简单、使用方便、安全无辐射、观察期长等优点，其标记率>95%，可继续用于后面的体内移植实验。

未分类的骨髓单个核细胞是个含有造血干细胞、骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞、边缘细胞群以及功能不明的干细胞的混合体^[2-3]。这些细胞都与中枢神经系统有着密不可分的联系：早在2000年 Mezey等^[22]在《Science》上发表论著，发现骨髓细胞可以分化为神经干细胞及神经细胞；同年Woodbury等^[23]发现，成年鼠和人的骨髓间充质干细胞在体外培养体系中能够分化为神经元样细胞；2006年Mathieu等^[24]发现内皮细胞除了能够促进神经干细胞自我更新外，还能诱导其向星形胶质细胞和神经元分化。此外，这些细胞还能分泌多种神经营养因子^[5-11]。因此，设想将骨髓单个核细胞用于神经疾病治疗应是一个可行的方法。为此，本实验中将骨髓单个核细胞作为一个整体进行体内移植治疗。

3.2 不同移植途径对脑损伤的影响研究发现模型组伤后14 d运动功能恢复较快，mNSS评分已接近正常大鼠。Feeney等^[18]和Gasparovic等^[19]研究表明在自由落体脑损伤模型中，大鼠神经功能的缺失在最早的2周内就有显著恢复，但严重的损伤模型则需要超过90 d恢复，这说明大鼠的自我恢复能力较人类强，不同物种间的差异明显。这一类似情况在大鼠脊髓全横断模型中也曾出现，大鼠脊髓全横断后两三周，部分动物有自主下肢活动。因此，作者认为中度大鼠脑损伤模型的mNSS评分应该在10 d左右时结束。

损伤后立即在损伤区及侧脑室移植细胞，大部分细胞没有存活。作者猜测，这可能是由于损伤后大脑局部出现各种病理生理反应以及继发损伤(如能量代谢障碍、钙离子超载、氧自由基和兴奋性氨基酸堆积、炎性反应等)，这些微环境的改变都不利于移植细胞的存活，因此，存活的细胞主要集中在相对正常的针道附近。Lu等^[25]发现伤后24 h移植骨髓间充质细胞，其存活率较低，他认为脑损伤后的微环境不利于移植细胞的存活，可能是低氧等不利因素所致。此外，Tate等^[26]通过研究证实，神经干细胞在脑损伤半球不同区域移植，细胞的存活率和迁移范围是有显著差异的。

治疗后7 d和10 d，颈内动脉移植组和对照组相比mNSS评分降低，而且损伤区周围荧光细胞数量明显多于其他组，这一结果提示在本实验条件下，经颈内动脉移植骨髓单个核细胞能有效的改善大鼠神经功能评分，且移植细胞能够在损伤区大量存活和迁移。分析有以下原因：首先，损伤局部微循环开放，血脑屏障打开，细胞可以进入损伤区及周边；其次，经颈内动脉移植的细胞数量较多，保证了移植细胞的总数量；再次，不会对大脑造成新的损伤，安全性较高^[27]；最后，移植细胞分布较广，能更好的与大脑整合。Lu等^[28]也得出同样的结论，认为动脉内移植优于脑实质内移植：后者的细胞绝大多数定位于注射点区，而前者的细胞可较广泛地分布于损伤中心及周缘；前者较后者损伤小，细胞数量大；前者细胞存活的比率为21%，后者为8.6%。

干细胞移植存在多种途径，目前还无法确定哪一种是最佳途径，甚至还无法确定是否存在最佳途径。对于不同的脑损伤个体，所采用的移植干细胞及移植途径、移植时间的掌握，都将会影响到治疗效果^[29-34]。对于一种干细胞采用的移植途径所取得的治疗效果，换为另外一种干细胞，可能取得不同的治疗效果。因此，想要得到更系统的数据还需进行大量研究工作。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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