放射性脑损伤模型小鼠纤维蛋白原的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0207

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (12): 1889-1894.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0207

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放射性脑损伤模型小鼠纤维蛋白原的变化

符桢琳1，张思琴2，徐杨2，柴溶2，陈晨2，阮林3，韦力1，4

1广西医科大学人体解剖学教研室，广西壮族自治区南宁市 530021；2广西医科大学附属口腔医院，广西壮族自治区南宁市 530021；3广西医科大学第一附属医院放疗科，广西壮族自治区南宁市 530021；4广西生物医药协同创新中心&广西再生医学重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530021

收稿日期:2018-02-22 出版日期:2018-04-28 发布日期:2018-04-28
通讯作者: 韦力，硕士，教授，广西医科大学人体解剖学教研室，广西壮族自治区南宁市 530021；广西生物医药协同创新中心&广西再生医学重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530021 并列通讯作者：阮林，广西医科大学第一附属医院放疗科，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:符桢琳，女，1994年生，湖南省汨罗市人，汉族，广西医科大学在读硕士，主要从事放射性脑损伤及神经解剖学方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81460479)；广西教育厅科学基金(ZD2014031)

Changes of fibrinogen in a mouse model of radiation-induced brain injury

Fu Zhen-lin1, Zhang Si-qin2, Xu Yang2, Chai Rong2, Chen Chen2, Ruan Lin3, Wei Li1, 4

1Department of Human Anatomy, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Affiliated Stomatological Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3Department of Radiotherapy, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 4Guangxi Key Laboratory of Regenerative Medicine & Guangxi Collaborative Innovation Center for Biomedicine, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2018-02-22 Online:2018-04-28 Published:2018-04-28
Contact: Wei Li, Master, Professor, Department of Human Anatomy, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Regenerative Medicine & Guangxi Collaborative Innovation Center for Biomedicine, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Corresponding author: Ruan Lin, Department of Radiotherapy, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Fu Zhen-lin, Master candidate, Department of Human Anatomy, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81460479; the Science Foundation of Education Department of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. ZD2014031

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
放射性脑损伤：亦可称放射性脑病，是脑部或脑邻近部病变经放疗后产生的脑组织损伤，为临床中头颈部恶性肿瘤患者放射治疗后常见的并发症，严重程度与照射野体积、放射剂量成正相关。临床表现为颅内压升高、弥漫性头痛、癫痫发作以及局灶性神经功能损害，放射性脑损伤预后差，进程也常不可逆。
纤维蛋白原：即凝血因子Ⅰ，存在于血液中，由肝细胞合成的一种可调节炎症、凝血且具有组织修复功能的多效蛋白，在机体凝血机制中发挥关键作用。

摘要
背景：前期研究发现放射破坏小鼠血脑屏障，而放射致损伤的血脑屏障是继发性脑损伤的原因，但目前有关放射因素对血浆纤维蛋白原及脑组织中纤维蛋白原沉积的影响报道甚少。
目的：建立放射性脑损伤模型，观察放射后血浆中纤维蛋白原的变化及其在脑组织中沉积的情况，探讨放射性脑损伤机制。
方法：50只昆明小鼠随机分为放射组、对照组，每组各25只，放射组予60Coγ射线照射，15 Gy/次，隔天照射，共30 Gy。放射前、后分别采用Morris水迷宫观察小鼠学习记忆能力的变化，神经行为结束后，检测血浆中纤维蛋白原的含量，采用免疫组织化学方法观察海马CA3区纤维蛋白原的表达，并在电镜下观察其血脑屏障结构变化。
结果与结论：①与对照组相比，放射组小鼠放射后在目标区域停留的时间和路程明显减少(P < 0.05)；②血浆纤维蛋白原显著升高(P < 0.001)，海马CA3区有大量纤维蛋白原沉积，电镜下血脑屏障基膜周围出现透亮区；③结果说明，放射可致血浆中纤维蛋白原升高，沉积于脑组织的纤维蛋白原可能是继发性脑损伤的原因。

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ORCID: 0000-0002-6200-4117(符帧琳)

关键词: 放射, 纤维蛋白原, 血脑屏障, 小鼠, 超微结构, 学习记忆, 海马, 国家自然科学基金, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Preliminary findings have shown that radiation can impair the mouse blood-brain barrier, which is a cause of secondary brain injury. However, there is little information concerning radiation effects on fibrinogen in plasma and fibrinogen deposition in brain tissue.
OBJECTIVE: To establish the mouse model of radiation-induced brain injury, to observe the changes of fibrinogen in plasma and brain tissue, and to further understand the mechanism of radiation-induced brain injury.
METHODS: Fifty Kunming mice were randomly divided into irradiation and control groups (n=25 per group). Irradiation group rats were irradiated by 60Co γ, 10 Gy, once every other day, and the total dose was 30 Gy. Learning and memory abilities were tested by Morris Water Maze before and after irradiation, the content of fibrinogen in plasma was detected, then fibrinogen in CA3 region of the hippocampus was determined by immunohistochemistry, and the ultrastructural changes of the blood-brain barrier were investigated under transmission electron microscope .
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the swimming time and distance of the irradiated mice were reduced in the target quadrant (P < 0.05), while fibrinogen was increased in plasma (P < 0.001) and deposited in hippocampal CA3 region. The translucent zone around the basement membrane of blood-brain barrier in the irradiation group was observed under electron microscope. These results suggest that irradiation can increase fibrinogen in plasma and brain, and the fibrinogen deposited in the brain may be the cause of secondary brain injury.

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Key words: Brain Injuries, Radioactivity, Fibrinogen, Disease Models, Animal, Hippocampus, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

符桢琳，张思琴，徐杨，柴溶，陈晨，阮林，韦力. 放射性脑损伤模型小鼠纤维蛋白原的变化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(12): 1889-1894.

Fu Zhen-lin1, Zhang Si-qin2, Xu Yang2, Chai Rong2, Chen Chen2, Ruan Lin3, Wei Li1, 4. Changes of fibrinogen in a mouse model of radiation-induced brain injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(12): 1889-1894.

图/表（结果） 2

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引言

头颈部恶性肿瘤、脑肿瘤发病率和死亡率较高，中国每10万人中有286人患癌，在东南亚地区，男性鼻咽癌发病率为6.5%，女性为2.8%^[1]。放射疗法是这类肿瘤的重要辅助治疗方法，可广泛应用于各种原发性和专一性的脑瘤等疾病，虽然效果显著但是会造成神经损伤、脑组织坏死、神经认知功能损伤、脑血管病以及颈椎病的风险，尤其辐射所引起的脑损伤已经成为该疗法的严重并发症^[2-3]。文献报道称，美国每年约有20万患者接受全脑放射治疗，而100%儿童和超过50%的成人出现进行性认知功能障碍为主要临床表现的放射性脑损伤(radiated brain injury，RBI)。世界卫生组织数据统计，放射治疗后脑组织坏死发生率高达28.5%，5年后的放射性脑损伤发生可高达59%^[4-5]。

放射性脑损伤指脑部或脑邻近部位的病变经放射性疗法治疗后引起的脑组织损伤，是头颈部放射治疗后常见的并发症之一。目前，放射性脑损伤已成为限制放射性疗法在临床上应用的一个重要因素^[6]。放射性脑损伤对患者的生存质量与生存期都会产生严重的影响，而随着鼻咽癌患者生存期的延长，其发生放射性脑损伤的可能性也在不断增加，因此，放射性脑损伤正逐步受到神经病学和放疗学界的重视^[7]，但其发生机制尚不明确。

研究表明，放射导致血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的作用减弱、通透性增加后，血液中可溶性纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)渗入神经组织，转化为不溶性纤维蛋白在神经系统沉积，并一直持续到损伤后数天。纤维蛋白原是存在于血液中具有调节凝血、炎症和组织修复功能的一种多效蛋白，作为机体生理止血中的重要凝血因子，血管内皮损伤后，纤维蛋白原在凝血酶原作用下转化为纤维蛋白，沉积在损伤血管处防止大量出血。

近年来，有研究表明，纤维蛋白原不仅是血脑屏障破坏的标志物，而且是一种有效的炎症诱导因子和神经轴突生长抑制剂，通过破坏的血脑屏障，抑制损伤的神经修复，在神经系统疾病中起关键作用^[8-11]。

目前有关放射作为一种外在影响因素对纤维蛋白原的影响如何报道甚少，本课题前期研究发现放射不仅损伤脑血管内皮细胞，而且放射诱导损伤的血脑屏障是继发性脑损伤的重要原因，然而其机制尚未清楚^[12-13]。为此，本研究建立放射性脑损伤模型，观察放射后血浆中纤维蛋白原的变化以及脑内纤维蛋白原沉积的情况，从纤维蛋白原的角度进一步探讨放射性脑损伤的机制，为防治放射性脑损伤提供新的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2016年12月至2017年11月在广西医科大学104馆完成。

1.3 材料

实验动物及分组：50只2月龄清洁级雌性昆明小鼠(由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK桂2014-0002)，体质量(30±2) g，随机分为对照组和放射组，每组25只，饲养于安静、昼夜节律正常的环境中，温度保持在(25±2) ℃，自由摄食和饮水。实验过程中动物的处置符合实验动物伦理学标准。

实验试剂及主要仪器：纤维蛋白原抗体(ThermoFisher 公司)，Alexa Fluor 594抗体(Abcam公司)，CA-1500全自动凝血分析仪(日本Sysmex公司)，GWXJ80型⁶⁰Co照射源(由广西医科大学第二附属医院提供，照射参数为 1 250 cGy/min)，H-7650透射电子显微镜(日本日立公司)，HM500冰冻切片机(德国leica公司)，Morris水迷宫(中国科学研究院)，荧光显微镜(德国leica公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 放射性脑损伤模型的建立体积分数3.5%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，放射组小鼠固定于自制的“放疗定位罩”中，使其头部、身体不能移动。照射野上界为眼后眦连线，下界为双耳后连线，避开双眼、鼻腔和口腔，照射源为⁶⁰Coγ射线，照射剂量15 Gy/次，隔天照射，总剂量30 Gy。对照组小鼠麻醉后置于同样环境中，但不予照射^[14]。

1.4.2 Morris水迷宫行为学测试 Morris水迷宫由圆形水池、移动平台、电脑摄像记录仪等组成。池壁、池底和平台均为黑色，水池分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个象限，平台置于第Ⅰ象限。测试包括定位航行试验和空间探索试验2部分。定位航行试验共8 d，前3 d平台置于水面上1 cm，后5 d平台隐藏于水面下1 cm，记录小鼠寻找到平台的时间(逃避潜伏期，escape latency，EL)。空间探索试验于放射结束后进行，去除平台，选一个入水点将小鼠放入水池中，记录其在1 min内的游泳速度、轨迹以及在各象限的时间和路程^[15-16]。

1.4.3 纤维蛋白原的检测神经行为测试结束后，用体积分数3.5%水合氯醛麻醉，眼球取血，2 mL/只，并置于抗凝管(1∶9枸橼酸钠)中，室温下混合均匀后静置，离心， 3 000 r/min，共10 min，取上层血浆，采用全自动凝血分析仪检测纤维蛋白原水平。

1.4.4 免疫组织化学染色观察脑组织纤维蛋白原沉积于眼球取血后进行，经左心室快速灌注生理盐水冲洗，再用40 g/L多聚甲醛(pH=7.4)灌注固定，开颅取脑。脑组织置于40 g/L多聚甲醛中固定过夜，再浸入含30%蔗糖的 0.1 mol/L PBS中，组织沉底后再放入-80 ℃冰箱保存。冰冻切片为连续冠状位，片厚25 μm，在手术显微镜下，选出图1中脑片，0.1 mol/L PBS(pH=7.4)冲洗(5 min×3次)，柠檬酸盐(pH=6.0)抗原修复(98 ℃水浴，5 min)，修复后脑组织依次经PBS冲洗(5 min×3次)、PBSGT(0.1 mol/L PBS加入0.2%gelatin、0.25%TritonX-100，pH=7.4)^[17]冲洗 (10 min×4次)。一抗浓度为1∶100，阴性对照组为0∶100，加入一抗纤维蛋白原前，用体积分数5%牛血清白蛋白室温封闭30 min，然后置于4 ℃冰箱过夜。第2天复温后，PBSGT冲洗(5 min×4次)，加二抗(1∶1 000)室温孵育 1.5 h，PBS冲洗后封固，在荧光显微镜下观察。

1.4.5 电镜观察血脑屏障结构于神经行为测试后进行，各组随机抽取3只小鼠，3.5%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，30 mL生理盐水快速冲洗，继用20 g/L多聚甲醛-2%戊二醛(pH 7.4)100 mL灌注固定。开颅，在手术显微镜下取出如图1所示的CA3脑组织，大小1 cm×1 cm，取脑组织立即浸于20 g/多聚甲醛-2%戊二醛(pH=7.4)固定液。常规方法制备超薄切片，在H-7650型透视电镜进行观察^[18]。

1.5 主要观察指标观察建模后小鼠的生长情况及死亡率，检测放射前、后的学习记忆能力，然后处死小鼠，取脑组织电镜观察其血脑屏障的结构，检测纤维蛋白原在脑组织中的沉积情况及其在血浆中的变化。

1.6 统计学分析数据采用graphpad prism 7.0统计软件分析，2组比较采用t 检验(T-Test)，P < 0.05即为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

纤维蛋白原由肝细胞合成和分泌，占血浆总蛋白的 2%-3%，半衰期四五天^[19-20]，为机体止血中重要的凝血因子，同时它也属于应激蛋白，在应激状态下常常增高，尤其是急性应激状态下的增高更明显^[21-22]。临床资料表明，糖尿病、肥胖、应激、吸烟及口服避孕药等因素可致纤维蛋白原的升高^[23-28]，然而其机制尚未明确。本研究中发现全脑放射后血浆中纤维蛋白原明显升高，提示放射线也是致血浆中纤维蛋白原升高的因素，其机制也尚待进一步研究。纤维蛋白原的主要功能是作为第一因子参与凝血，在循环系统中经凝血酶作用转变为纤维蛋白而发挥其凝血和生理止血功能，然而临床上纤维蛋白原升高也会增加血液粘滞性和外周阻力，引起内皮细胞损伤，促进胶原和去氧核糖核酸合成，趋化单核/巨噬细胞向内膜下迁移，促进血栓形成^[29-30]。近年来，有研究表明纤维蛋白原和内皮细胞共培养可致内皮细胞退缩^[31-32]，增加血管通透性，故推测放射诱导的纤维蛋白原升高可能是进一步诱导内皮细胞损伤的原因。

血脑屏障由血管内皮细胞、基膜、周细胞、星形胶质细胞终足共同构成，血脑屏障破损是引发一系列脑组织损伤的关键因素，是脑源性疾病发生、发展的重要原因之一^[33]。放射对血脑屏障的功能有损伤作用，而且也可破坏血脑屏障的结构。作为存在于神经系统各级血管中的物理屏障，血脑屏障独特的转运机制严格调节着中枢神经系统的内稳态，可调控血液中蛋白进入神经组织，正常情况下中枢神经系统内检测不到纤维蛋白原^[19^，^34]，然而本研究中也能观察到正常脑组织偶尔有纤维蛋白原的沉积，但是放射后的脑组织内却出现大量纤维蛋白原的沉积。有研究表明，神经系统外伤、缺血缺氧，老年痴呆等因素致血管破裂、血脑屏障破坏或血神经屏障破坏时^[35-36]，血液中可溶性纤维蛋白原可沉积于血管内和脑组织中。本实验采用电镜也观察到放射后血脑屏障损伤，这与作者以往报道一致，提示放射后血脑屏障的损伤可以是导致纤维蛋白原沉积的原因，同时也提示沉积于脑组织中纤维蛋白原也可以作为脑血管损伤或血脑屏障损伤的标志^[18]。

中枢神经系统的不同部位对放射敏感性不同，海马对放射损伤高度敏感，是脑边缘系统中最重要的功能区之一，海马也是学习、行为、情感以及记忆等高级神经活动的重要部位，且在脑缺血、脑缺氧的研究中已发现海马的病变部位最为典型，研究表明在大鼠的放射性脑损伤中最早、最典型的病变发生于胼胝体和海马区等部位^[37-38]。在学习记忆和行为功能方面有重要的作用，因此海马神经细胞损伤后会从体外行为中得到反映，甚至可在无形态改变的情况下观察到，海马区细胞在定向航行实验中被认为是空间记忆能力的原始基础。海马也是空间信息获得与提取的关键，对记忆的巩固和储存也同样重要^[39]。所以，作者选取了大脑的海马区进行观察。此次实验中免疫组化结果显示，经10 Gy ⁶⁰Coγ射线放射后纤维蛋白原在小鼠脑组织的海马区也出现了异常沉积。

纤维蛋白原在凝血系统和纤溶系统中发挥着重要作用的同时，也存在双重生物活性。有研究认为纤维蛋白原是一种典型的急性期炎症反应物，参与调节炎症反应和宿主防御，本研究中发现放射组小胶质细胞增多、吞噬和活化现象，可能与纤维蛋白原沉积于血管内或血管外脑组织中有关，但有待进一步的验证。作为神经系统内的免疫防御屏障，静息状态下的小胶质细胞通过吞噬细菌、抗原提呈和产生细胞因子保护中枢神经系统，而激活的小胶质细胞释放过量的促炎性反应因子，诱导神经元细胞功能减退^[40-41]。也有研究认为纤维蛋白原是神经元再生的抑制因子，沉积于脑组织中纤维蛋白原通过Src家族激酶分子促进轴突中表皮生长因子受体簇集与自身磷酸化，阻碍轴突、神经纤维生长，致神经功能降低，同时沉积的纤维蛋白原活化胶质细胞、促进炎症反应、细胞凋亡、钙离子内流等一系列分子级联反应最终导致神经元的凋亡、促进认知功能障碍^[42-45]。

Morris水迷宫是较为经典的学习记忆检测方法，主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感的记忆能力，属于水迷宫常用的一种方法，它是一种强迫实验动物游泳，学习寻找隐藏在迷宫水面下方用于逃生的安全平台的实验，并通过分析其寻找平台所用的时间和所走的路径测试实验动物对空间位置觉和方向觉的学习记忆能力。经水迷宫设备分析后得到丰富的实验信息，例如，实验动物的潜伏期、游泳总路程、平均速度、穿越平台的次数等等^[46-47]。

本研究发现⁶⁰Co放射后小鼠在目标区域的停留时间和路程减少，提示放射后小鼠的学习记忆能力下降可能与纤维蛋白原沉积于脑血管或脑组织内致神经元功能减退有关，但尚待进一步证实。防止放射对脑的损伤已成为国内外研究的热点，目前纤维蛋白原损伤神经机制尚未完全清楚，但纤维蛋白原清除已被广泛应用于类风湿性关节炎、肾小球肾炎、IgA肾病等的临床治疗^[19]，应用药物减少纤维蛋白原在局部的沉积和(或) 抑制纤维蛋白与受体的相互作用将为放射性脑损伤的防治提供一个新的治疗思路。本实验下一步计划结合体外实验，培养脑血管内皮细胞及神经细胞，经⁶⁰Coγ射线放射后，观察脑细胞的形态变化，采用聚合酶链式反应(PCR)、蛋白质印迹(Western Blot)及酶联免疫吸附剂测定(Elisa)等方法研究纤维蛋白原对脑细胞中各种炎性信号通路与相关基因等方面的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

放射性脑损伤模型小鼠纤维蛋白原的变化

Changes of fibrinogen in a mouse model of radiation-induced brain injury

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